Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng của protein tái tổ hợp (rHIP) trên sự phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại doc

TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng của protein tái tổ hợp (rHIP) trên sự phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại Tạ Thành Văn 1 và M. C. Farach - Carson 2 1 , Bộ môn Hóa - Hóa sinh, Đại học Y Hà Nội 2 , Phòng Sinh học phân tử và Nội tiết, Khoa Sinh học, Trờng Đại học Delaware, Hoa Kỳ I. ĐặT VấN Đề Heparan sulfate proteoglycans (HSPG) nằm ở trên bề mặt tế bào hoặc trong khoảng gian bào của tất cả các mô động vật. HSPG và các protein liên kết với chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh học của tế bào nh: sự liên kết tế bào - tế bào, quá trình phân bào, biệt hóa, sự di chuyển và các quá trình sinh bệnh lý của tế bào [1, 2, 6]. Khoảng gian bào là nơi lu giữ và giải phóng các enzyme proteinase, các chất ức chế và các yếu tố phát triển tế bào. Những tác nhân gây ra sự giải phóng các yếu tố phát triển từ khoảng gian bào đều dẫn đến việc thúc đẩy sự phát triển của tế bào. Khi xử lý mô với enzyme thủy phân heparin/heparan sulfate (HP/HS) hoặc với các chất ức chế tổng hợp HSPG, tế bào phát triển mạnh và trở nên có độ linh động cao, dễ dàng tách rời khỏi các mô. Đây chính là một trong các cơ chế di căn của ung th, trong đó các tế bào phát triển rất mạnh và dễ di chuyển sang mô khác. Protein gắn đặc hiệu với heparan sulfate (HIP) đợc xác định là một protein màng, nhận biết những vị trí đặc hiệu trên phân tử HP/HS. ADN của HIP mã hóa 159 acid amine có trọng lợng phân tử khoảng 24 kDa. HIP đợc tổng hợp nhiều ở tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trởng thành [4, 5]. Protein này gắn trực tiếp, đặc hiệu với HP/HS và heparan sulfate. Chuỗi peptid ngắn đợc tổng hợp mô phỏng theo vùng gắn đặc hiệu với HP/HS của HIP cũng có khả năng gắn đặc hiệu và chọn lọc với HP/HS. Thêm vào đó, HIP còn có khả năng ức chế heparanase, thông qua đó làm tăng cờng mối liên kết tế bào - tế bào. Mối liên kết này bị ức chế bởi HP/HS cũng nh một số HSPG [4, 5]. Chúng tôi giả thiết rằng bằng cách cạnh tranh với vùng gắn đặc hiệu trên phân tử HP/HS, HIP tham gia điều hòa sự phát triển tế bào thông qua việc điều hòa quá trình lu giữ và giải phóng bFGF từ khoảng gian bào. Để chứng minh cho giả thiết này, chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi bình thờng và lợi phì đại của các bệnh nhân ghép tạng điều trị bằng thuốc ức chế miễn dịch cyclosporine A (CsA) làm mô hình nghiên cứu thực nghiệm. Sự phì đại của mô lợi liên quan với việc sử dụng CsA đợc cho là do sự tăng cờng phát triển của các tế bào sợi. Đồng thời tại các mô này có sự tăng cờng tổng hợp các yếu tố phát triển cùng với các receptor của chúng và HSPG. Chính vì vậy, đây là một mô hình nghiên cứu in vitro lý tởng để tìm hiểu cơ chế phì đại của mô lợi ở những bệnh nhân sử dụng CsA cũng nh vai trò của HIP. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng công nghệ gen để tổng hợp HIP của ngời tái tổ hợp trên hệ vi khuẩn E. coli. HIP tái tổ hợp đã đợc sử dụng trong mô hình thực nghiệm in vivo để nghiên cứu tác dụng ức chế của protein này trên dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi bình th ờng và mô lợi phì đại của bệnh nhân ghép tạng sử dụng CsA. II. VậT LIệU Và PHơNG PHáP 1. Vật liệu Heparin, imidazole, và bovine serum albumin đợc mua từ Sigma (St. Louis, MO, USA). bFGF đợc mua từ Becton Dickinson Labware (Bedford, MA, USA). Minimal essential medium (MEM), penicillin/streptomycin, Fungizoneđ, fetal bovine serum (FBS), các thành phần bổ sung cho môi trờng nuôi cấy tế bào, trypsin và phosphate - buffer saline (PBS) đợc mua từ Gibco/BRL (Grand Island, NY, USA). Cyclosporine A mua từ Calbiochem (LaJolla, CA, USA). 55 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 2. Phơng pháp 2.1. Phân lập tế bào sợi từ mô lợi bình thờng và phì đại Mô lợi bình thờng và lợi phì đại đợc lấy trong các cuộc phẫu thuật lợi định kỳ cho các bệnh nhân ghép tạng sử dụng thuốc ức chế miễn dịch CsA tại khoa Răng, bệnh viện Trờng Đại học tổng hợp Pennsylvania (Philadelphia, PA, USA). Mô lợi đợc cắt nhỏ trong điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trong phiến nuôi cấy tế bào có 24 giếng (24 - well plate) với MEM có bổ sung 10% FBS, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100àg/ml), và 1% Fungizoneđ ở 37 o C với thành phần không khí ẩm có 95% không khí và 5% CO 2 . Các tế bào sợi sẽ phủ kín mặt giếng trong khoảng thời gian 14 - 18 ngày. Sau đó các tế bào này đợc chuyển sang bình nuôi cấy 75 - cm 2 sử dụng môi trờng nuôi cấy trên song không có Fungizoneđ. Cuối cùng, các tế bào này đợc thu hoạch, đa nhanh về nhiệt độ - 80 o C và bảo quản trong nitơ lỏng. Tất cả các tế bào sợi sử dụng trong nghiên cứu này đều ở thế hệ thứ 3 đến thứ 8. Bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu: anti - vimetin, anti - desmin, anti - fibronectin, anti - factor VIII và anti - cytokeratin 14, chúng tôi đã khẳng định dòng tế bào sợi phân lập đợc không bị nhiễm các loại tế bào khác nh tế bào biểu mô, tế bào nội mạc, tế bào cơ trơn. 2.2. Tổng hợp và tinh chế HIP tái tổ hợp Các cặp mồi có vị trí của enzyme cắt giới hạn EcoRI cho phép nhân đoạn nucleotide của HIP từ vị trí 25 - 508. Trình tự nucleotide của các cặp mồi xuôi và ngợc theo thứ tự là: 5 - CCCGAATTCGACATGGCCAAGTC và 5 - CCGAAGTCTCATTTCTTAAGGGG. Sản phẩm PCR chứa đựng toàn bộ các bộ ba mã hóa toàn bộ chiều dài phân tử của HIP đợc đa vào vector có oligo - histidine với vị trí enzyme cắt giới hạn là EcoRI. Sản phẩm HIP tái tổ hợp có gắn với oligohistidine ở đầu - N tận. HIP tái tổ hợp đợc tinh chế theo hai giai đoạn. Giai đoạn 1 sử dụng cột sắc ký ái lực cobalt resin và giai đoạn 2 sử dụng cột sắc ký ái lực heparin sepharose. Tất cả các giai đoạn tinh chế đều đợc thực hiện ở 4 o C và độ tinh khiết đợc theo dâi bằng điện di trên gel SDS - polyarylamide và Western blot sử dụng kháng thể kháng HIP. Kết quả cho thấy HIP tái tổ hợp đợc tinh chế với độ tinh khiết trên 95%. Các protein gắn không đặc hiệu ở E. coli không mang HIP - vector cũng đợc tinh chế và đợc sử dụng nh mẫu đối chứng âm tính. 2.3. Điện di trên gel polyacrylamide với sự có mặt của sodium dodecyl sulfate (SDS - PAGE) và Western blot Các mẫu protein hòa tan đợc tủa bằng 10% acid trichloroacetic ở 4 o C trong 2 h hoặc để qua đêm. Tủa đợc thu hồi bằng cách ly tâm 1200 ì g trong 10 phút ở 4 o C sau đó đợc rửa bằng 10% acid trichloroacetic và 100% acetone rồi để khô ở nhiệt độ phòng. Tủa đợc hòa tan bởi một lợng tơng đơng dung dịch đệm điện di hòa tan mẫu (sample buffer) và đệm Tris - HCl, 50 mM, pH 7.0 có 4 M ure, 1% SDS, 1% - mecaptoethanol và 0,01% phenylmethylsulfonyl fluoride. Hỗn hợp này đợc đun sôi trong 5 phút và dùng để chạy điện di trong điều kiện biến tính với 15% gel polyacrylamide. Gel đợc rửa nhanh bằng đệm Tris base 100 mM và 100 mM glycine, pH 9,2 rồi đợc điện di chuyển sang giấy nitrocellulose ở 4 o C trong 5 h với hiệu điện thế 40 V sử dụng Transblot apparatus (Bio - Rad). Giấy nitrocellulose đợc ủ với kháng thể kháng HIP trong đệm PBS có 0,01% sodium azide và 0.05% Tween 20 (PAT) và 1% BSA trong 6h rồi sau đó đợc rửa 3 lần với PAT và ủ với kháng thể kháng IgG của thỏ đợc gắn với horseradish peroxydase (pha loãng 1: 200.000 với PAT) trong 2h. Sau khi rửa tiếp 3 lần với PAT, các vết protein trên tấm giấy này đợc phát hiện bằng dung dịch hóa phát quang (Pier Chemical, Rockford, IL, USA). 2.4. Kỹ thuật đánh giá sự phát triển của tế bào Để đánh giá ảnh hởng của HIP lên sự phát triển của tế bào sợi, chúng tôi sử dụng phiến nuôi cấy tế bào có 24 giếng với số lợng tế bào khởi đầu là 3.500 tế bào/giếng. Các giếng này đợc ủ trong tủ nuôi cấy qua đêm trong môi trờng là MEM có 10% FBS để đảm bảo cho tất cả các tế bào bám vào đáy giếng. Ngày hôm sau, các giếng đợc tráng nhẹ nhàng 2 lần với PBS (Ca 2+ /Mg 2+ ) rồi thay thế bằng môi trờng MEM với 0,2% FBS 56 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Các vệt của HIP đợc phát hiện bằng Western blot với việc sử dụng kháng thể kháng HIP peptide: 1, Trọng lợng phân tử chuẩn; 2, Dịch phá hủy E. coli thô; 3, Dịch chảy qua cột cobalt; 4, Phân đoạn gắn với cột cobalt; 5, Dịch rửa cột heparin (0,5 M NaCl); 6, Dịch chảy qua cột heparin; 7 và 8, Các phân đoạn gắn với cột heparin sepharose đợc đẩy bằng dung dịch đệm với 1,5 M NaCl. (500 àl/giếng) và ủ thêm 24 giờ nữa. Sau đó môi trờng trên đợc thay thế bằng môi trờng có chứa các yếu tố cần nghiên cứu trong đó có HIP. Môi trờng của tất cả các điều kiện thí nghiệm trên đều chứa 0,2% FBS. ở các ngày 0, 3, 5, 9 và 13 tế bào sợi đợc thu hoạch bằng cách xử lý với trypsin/EDTA và đếm bằng buồng đếm tế bào. Mỗi điều kiện thí nghiệm đợc nhắc lại 4 lần. Tốc độ phát triển tế bào đợc phân tích và so sánh sử dụng phần mềm ANOVA và Tukey - Kramer secondary multiple - comparision test. III. KếT QUả 1. Tổng hợp và tinh chế HIP tái tổ hợp của ngời Bằng cách sử dụng hệ vector có oligohistidine, tác giả đã tổng hợp thành công HIP tái tổ hợp của ngời có mang oligohistidine ở đầu - N tận trên hệ vi khuẩn E. coli. Hai đặc tính của protein tái tổ hợp này đã đợc lợi dụng để có thể tinh chế nhanh với số lợng lớn và đạt độ tinh khiết cao: 1) Mang oligohistidine nên có thể sử dụng sắc ký ái lực cobalt resin để gắn và dùng imidazole để đẩy; 2) Có ái lực cao với heparin nên có thể dùng sắc ký ái lực heparin sepharose để gắn và dùng nồng độ NaCl cao (1,5 M) để đẩy. Bằng cách kết hợp hai giai đoạn trên, HIP tái tổ hợp đã đợc tinh chế với độ tinh khiết cao trên 95% so với dịch chiết ban đầu từ vi khuẩn E. coli (hình 1). Nghiên cứu đánh giá độ bền vững của protein này trong các điều kiện bảo quản khác nhau cho thấy HIP có thể đợc bảo quản trong PBS có 10% glycerol ở nhiệt độ - 80 o C trong thời gian một tháng mà hoạt tính của HIP còn đợc trên 90% so với ngày đầu tiên, ngay sau khi mới tinh chế (hình 2). Hình 2. Độ bền vững của HIP ở - 80 o C trong PBS với 10% glycerol. 1, Sau 2 tháng; 2, Sau 1 tháng; 3, Ngày 1; 4, Trọng lợng phân tử chuẩn. 2. HIP ức chế sự phát triển của tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi bình thờng và mô lợi phì đại của bệnh nhân sử dụng CsA giống nhau về mặt hình thái học [3]. Thêm vào đó, hai dòng tế bào này có chung một sự đáp ứng với bFGF, CsA và heparin khi cho các chất này vào môi trờng nuôi cấy [3]. Trong nghiên cứu trớc chúng tôi đã chỉ ra rằng thêm heparin với nồng độ 10 àg/ml vào môi trờng nuôi cấy không ảnh hởng đến sự kích thích tăng sinh tế bào của bFGF ở nồng độ 10 ng/ml. Khi tăng nồng độ bFGF từ 10 đến 50 ng/ml thì số lợng tế bào cũng tăng lên đáng kể [3]. 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 57 Hình 1. HIP của ngời tái tổ hợp trên E. coli đợc tinh chế với độ tinh khiết cao nhờ sắc ký ái lực TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 -10 0 10 20 30 40 50 Cells/well x 1000 Hình 3: HIP đối kháng với khả năng kích thích phân bào của bFGF. Tế bào sợi đợc nuôi cấy trong MEM ở 3 điều kiện khác nhau: 1, 0,2% FBS; 2, 0,2% FBS và 50 ng/ml bFGF; 3, 0,2% FBS, 50 ng bFGF và 5 àg/ml HIP. Số lợng tế bào đợc đếm ở các ngày 0, 3, 9 và 13 kể từ khi thêm các thành phần bổ sung vào môi trờng nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm đợc nhắc lại 4 lần, **, p < 0,001; ***, p < 0,0001. Kết quả ở hình 3 cho thấy, trong những ngày đầu, không có sự khác biệt về số lợng tế bào giữa hai nhóm có và không có HIP. Tuy nhiên vào ngày thứ 9 và đặc biệt là vào ngày thứ 13 thì HIP thể hiện hoạt tính ức chế mạnh khả năng kích thích phân bào của bFGF. Tuy nhiên thí nghiệm khác cho thấy nếu cho HIP vào môi trờng nuôi cấy mà không bổ sung bFGF thì sẽ không có sự thay đổi về số lợng tế bào giữa hai nhóm thí nghiệm. Thêm vào đó, khi bổ sung IGF - 1, một yếu tố phát triển tế bào không phụ thuộc HP/HS thì cũng không làm thay đổi tốc độ phân bào giữa hai nhóm có HIP và không có HIP [7, 8]. ở nồng độ 5 g/ml, HIP bắt đầu thể hiện hoạt tính ức chế sự phân bào trong khi với nồng độ 100 và 10 lần nhỏ hơn, HIP không hề phát huy khả năng ức chế này (hình 4). Những kết quả trên cho phép chúng tôi đề xuất cơ chế điều hòa hoạt tính kích thích phân bào của bFGF trong mô lợi phì đại của bệnh nhân sử dụng CsA (hình 5). *** ** 0 5 10 15 20 25 Cells/well x 1000 Hình 4: Xác định nồng độ HIP bắt đầu có khả năng đối kháng với sự kích thích phân bào của bFGF. Tế bào sợi đợc nuôi cấy trong MEM ở 3 điều kiện khác nhau: 1, 0,2% FBS; 2, có 0,2% FBS và 50 ng/ml bFGF; 3, 0,2% FBS, 50 ng bFGF và 0,05 g/ml; 4, 0,2% FBS, 50 ng bFGF và 0,5 àg/ml HIP và 5, 0,2% FBS, 50 ng bFGF và 0,5 àg/ml HIP. Số lợng tế bào đợc đếm ở các ngày 0, 3 và 9 kể từ khi thêm các thành phần bổ sung vào môi trờng nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm đợc nhắc lại 4 lần, *, p < 0,05. Protein lõi bFGF Khoảng gian bo bFGF (thể hoạt động) Enzyme mô HIP HIP 1 2 3 1 2 3 4 5 bFGF (thể bất hoạt) Phức hợp HIP - HS Vị trí gắn của bFG trên HS 58 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 Hình 5. Mô hình cơ chế đối kháng của HIP với tác dụng kích thích phân bào của bFGF đối với tế bào sợi của mô lợi phì đại. HIP ức chế enzyme thủy phân mô đồng thời cạnh tranh với vị trí gắn của bFGF trên phân tử HS để giải phóng bFGF ở dạng bất hoạt và tạo phức hợp HIP/HS). IV. BàN LUậN Các yếu tố phát triển tế bào gắn đặc hiệu với HP/HS trong đó có bFGF tham gia thúc đẩy sự tăng sinh phì đại của mô lợi ở những bệnh nhân sử dụng CsA. Các yếu tố phát triển này cùng receptor của chúng và HSPG đợc tổng hợp nhiều trong quá trình phát triển phì đại của mô lợi gây ra chảy máu thờng xuyên cho bệnh nhân. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc gia tăng sự phát triển của mô lợi gây ra chủ yếu là do sự tăng sinh của các tế bào sợi. CsA đợc phát hiện là thủ phạm gây tăng quá trình tổng hợp ADN của các tế bào sợi. Điều này đã khiến chúng tôi cho rằng phải chăng cơ chế tác động của CsA thông qua con đờng kích thích sự phân bào của bFGF. HIP đợc xác định là một protein màng gắn đặc hiệu với HP/HS [4]. Protein này có khả năng gắn đặc hiệu và chọn lọc với HP/HS đồng thời có khả năng ức chế heparanase để qua đó làm tăng cờng mối liên kết tế bào - tế bào. Mối liên kết này bị ức chế bởi HP/HS cũng nh một số HSPG. Chính vì vậy, chúng tôi đã giả thiết rằng HIP điều hòa sự phát triển của tế bào thông qua việc điều hòa quá trình lu giữ và giải phóng bFGF từ khoảng gian bào. Thêm heparin vào môi trờng nuôi cấy mà không ảnh hởng đến sự phát triển của tế bào cho thấy các tế bào sợi phân lập đợc có khả năng tổng hợp d thừa glycosaminoglycan để có thể thúc đẩy sự đáp ứng của tế bào đối với bFGF [8]. Kết quả cho thấy ở liều 5 àg/ml hay cao hơn HIP ức chế mạnh sự tăng sinh của tế bào với sự có mặt của 50 ng/ml bFGF. Không có bFGF, HIP không thể hiện hoạt tính ức chế cho thấy HIP có khả năng làm suy giảm sự đáp ứng của tế bào đối với bFGF. Điều này cũng đồng nghĩa rằng ở trạng thái nghỉ (0,2% FBS trong môi trờng nuôi cấy) thì tế bào kém nhậy cảm với các yếu tố phát triển cũng nh đáp ứng yếu với HIP. Từ kết quả trên chúng tôi cho rằng HIP đóng vai trò nh là một chất đối kháng với bFGF trong việc kích thích sự phát triển của tế bào sợi. Cùng với việc HIP không ảnh hởng đến tác dụng kích thích phân bào của IGF - 1 cho thấy cơ chế hoạt động trên của HIP phải là cơ chế phụ thuộc HP/HS. Kết quả này chứng minh cho giả thuyết của chúng tôi về cơ chế hoạt động của HIP trong mô lợi phì đại của bệnh nhân sử dụng CsA. Trong đó CsA kích thích tổng hợp HIP từ tế bào nội mạc hoặc tế bào biểu mô. Do vậy HIP sẽ tăng khả năng cạnh tranh với vị trí gắn đặc hiệu của bFGF trên phân tử HS ở khoảng gian bào để giải phóng bFGF ở dạng bất hoạt và tạo phức hợp HIP - HS. Thêm vào đó HIP còn có khả năng ức chế các enzyme mô nh các protease và endoglycosidase là các enzyme làm tăng bFGF ở trạng thái tự do. Tất cả điều này đều làm bFGF ở dạng hoạt động tăng cao và thúc đẩy sự nhân lên của tế bào sợi gây nên phì đại mô lợi. Kết quả nghiên cứu này mở ra một triển vọng nghiên cứu ứng dụng HIP và các HSPG trong điều trị hiện tợng phì đại lợi, một tác dụng phụ của CsA và các dẫn xuất, tránh cho bệnh nhân khỏi việc phẫu thuật cắt bỏ lợi định kỳ. V. KếT LUậN Những kết quả thu đợc từ công trình nghiên cứu này cho phép chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình tổng hợp protein tái tổ hợp (HIP) của ngời trên hệ vi khuẩn E. coli sử dụng vector có oligo - histidine. 2. HIP tái tổ hợp đã đợc tinh chế với độ tinh khiết cao nhờ kết hợp các kỹ thuật sắc ký ái lực sử dụng nhựa coban và heparin. 3. HIP tái tổ hợp thể hiện hoạt tính ức chế mạnh lên sự nhân lên của cả hai dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi bình thờng và mô lợi phì đại đợc lấy từ bệnh nhân ghép tạng sử dụng CsA. 4. Kết quả thu đợc cho phép các tác giả đa ra cơ chế tác dụng của HIP: HIP cạnh tranh với bFGF trên vị trí gắn đặc hiệu của yếu tố này trong phân tử heparan sulfate để giải phóng bFGF ở dạng 59 TCNCYH phô b¶n 32 (6) - 2004 bÊt ho¹t. Th«ng qua ®ã HIP øc chÕ sù ph¸t triÓn cña tÕ bµo. 60 TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004 TàI LIệU THAM KHảO 1. Tạ Thành Văn (1998); Heparin: Sự tơng tác với các protein. Tạp chí Nghiên cứu Y học, 6 (2), 69 - 72. 2. Tạ Thành Văn, Saburo Hara (2001); ái lực của fructose 1,6 - bisphosphate aldolase với glycosaminoglycans. Tạp chí Nghiên cứu y học 16, 35 - 40. 3. Tạ Thành Văn (2004); Phân lập và nghiên cứu sự đáp ứng của dòng tế bào sợi từ mô lợi phì đại với bFGF và heparin. Y học Việt Nam (đang in). 4. Julian, J., Van - Thanh, T., Carson, D. D. et al. (2001); Expression of HIP/RPL29 during the entrous cycle and early pregnancy in the mouse. Biological Reproduction 64 (4): 1165 - 1175. 5. Rohde, L. H., Julian, J., Babaknia, A., Carson, D. D. (1996); Cell surface expression of HIP, a novel heparin/heparan sulfate binding protein, of human uterine epithelial cells and cell lines. Journal of Biological Chemistry 271, 11824 - 11830. 6. Van - Thanh, T., Takano, R., Kamei, Hara, S. et al. (1999); Fructose 1,6 - bisphosphate aldolase is a heparin binding protein. Journal of Biochemistry 125, 554 - 559. 7. Van - Thanh, T., Korostoff, J., and Farach - Carson, M. C. et al. (2000); Heparan sulfate interacting protein (HIP) negatively regulates growth responses to bFGF by gingival fibroblasts. Molecular Biology of the Cell 11, 244a. 8. Van - Thanh, T., Carson, D. D., Farach - Carson, M. C. et al. (2002); Heparan sulfate interacting protein (HIP/L29) negatively regulates growth responses to basic fibroblast growth factor in gingival fibroblasts. Journal of Dental Research. 81, 247 - 252. Summary Synthesis and study on effect of recombinant protein (HIP) on gingival fibroblast growth derived from overgrowth gingiva Heparan sulfate proteoglycan (HSPG) locates on the cell surface and extracellular matrix (ECM) where basic fibroblast growth factor (bFGF) is captured and released in a regulated fashion by tissue proteinases and endoglycosidases. bFGF implicated in gingival overgrowth. Release, rather than synthesis rates, governs bFGF bioavailability. We identified a heparin/heparan sulfate (HP/HS) interacting protein (HIP) that recognizes specific HS sequences. We isolated and cultured fibroblasts from normal gingiva and overgrowth gingiva from patients on cyclosporine (CsA). Recombinant human HIP fused with oligo - histidine tag expressed in E. coli, dramatically decreased bFGF - induced proliferation. These results support our hypothesis that HIP modulates bFGF bioavaibility through the regulation of ECM sequestration and release. 61 . Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng của protein tái tổ hợp (rHIP) trên sự phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại Tạ Thành Văn 1 và M lợng phân tử chuẩn. 2. HIP ức chế sự phát triển của tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy dòng tế bào sợi phân