TÁCH DÒNG, TẠO PLASMID MANG GEN EPSPS ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ GLYPHOSATE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH DỊNG, TẠO PLASMID MANG GEN EPSPS ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ GLYPHOSATE Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : ĐINH THÀNH PHƯỚC Niên khóa : 2009-2013 Tháng 6/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH DỊNG, TẠO PLASMID MANG GEN EPSPS ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ GLYPHOSATE Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS HUỲNH VĂN BIẾT ĐINH THÀNH PHƯỚC Tháng 6/2013 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu TrườngĐại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập trường Quý Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học quýThầy Cô trực tiếp giảng dạy suốt bốn năm qua TS Huỳnh Văn Biết người tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức giúp đỡ tận tình cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Thầy truyền đạt kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học kinh nghiệm thực tiễn, động viên khuyến khích sáng tạo nghiên cứu, giúp hiểu rõ tảng lý luận học giảng đường cho phong cách độc lập nghiên cứu khoa học PGS.TS Lê Đình Đơn qThầy Cơ, Anh Chị Em Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường tận tình giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện tốt trang thiết bị, hóa chất kỹ thuật q trình thực khóa luận Cảm ơn gia đình bạn bè động viên giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt q trình học tập Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Đinh Thành Phước i TÓM TẮT Hiện nay, phát triển trồng công nghệ sinh học xu chung giới, đậu nành chuyển gen khơng ngoại lệ Vì có tranh cãi lợi ích nguy trồng cơng nghệ sinh học tồn cầu nên việc tăng cường kiểm soát kiểm tra trồng công nghệ sinh học cấp thiết Trước thực trạng nghiên cứu “Tách dòng, tạo plasmid mang gen EPSPS ứng dụng cho phát đậu nành (Glycine max L.) chuyển gen kháng thuốc diệt cỏGlyphosate” thực nhằm bước đầu tạo mẫu chuẩn đường chuẩn cho việc định lượng phát trồng có chuyển gen EPSPSkháng thuốc diệt cỏ Nghiên cứu tập trung vào việc tạo dòng gen EPSPS E coli, sau thu nhận sản phẩm tạo dòng, tinh tiến hành xây dựng đường chuẩn cho phản ứng định lượng, phát gen EPSPSđược chuyển đậu nành Realtime PCR Nghiên cứu đạt kết sau: tạo E coli khả nạp có khả nhận plasmid; tạo dòng gen EPSPSthành cơng; xây dựng đường chuẩn cho định lượng chuyểngen EPSPS kháng thuốc diệt cỏ đậu nành phương pháp Realtime PCR có phương trình: y = -3,0533x + 54,4187 Đường chuẩn xây dựng có độ tin cậycao,với số tương quan R2 = 0,9992.Kết thử nghiệm kỹ thuật Real time PCR với đường chuẩn xác lập phát mẫu DNA đậu nành số 1và số có mang gen EPSPS.Số lượng gen chuyển tương ứng tên mẫu DNA đậu nành số là211,34 x 106 copies mẫu DNA đậu nành số 1,21 x 109copies ii SUMMARY Nowadays, the development of biotech crops has become one of the most general trends in biotech all over the world, transgenic soybean is not an exception Becausethere still have been debates about benefits and risks of biotech crops, enhancement of the control and inspection of biotech crops are imperative In order to obtain a standard sample and calibration curve for quantitative analysis and detection of transgenic Glyphosate - resistant soybean The thesis named “Cloning, construction of a reference plasmid containing EPSPS gene from GM soybean (Glycine max L.)” was conducted The researchfocused on cloningEPSPSgeneinE coli, then the clone product was collected and purified The standard sample from DNA plasmids with EPSPS gene and calibration curve was established for quantitative analysis and detection of GM soybean by Real time PCR In this study,competent cells were made successfully; plasmids whith EPSPS gene was cloned in E coli The calibration curve with high reliability was established.the equation of calibration curve was y = -3.0533x + 54.4187, the reliability indexR2 = 0.999 According the calibration curve, soybean DNA sample and sample were found obtainingEPSPS transgeneswith 211.34 x 106 copies and 1.21 x 109copies Keyword: gene cloning, herbicide resistance, Real time PCR, GMO, EPSPS iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt .ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng .vii Danh sách hình viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược đậu nành (Glycine max L.) 2.2 Sơ lược trồng biến đổi gen 2.2.1 Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMOs- Genetically Modified Organisms) 2.2.2 Cấu trúc gen chuyển vào thực vật 2.2.3 Ứng dụng nguy thực vật chuyển gen 2.2.4 Tổng quan tình hình trồng sản phẩm từ trồng biến đổi gen .8 2.3 Phương pháp phát hiện, định lượng GMOs sản phẩm từ GMOs 14 2.3.1 Nguyên tắc kỹ thuật Real time PCR 14 2.3.2 Vật liệu kỹ thuật Real time PCR 15 2.3.3 Ứng dụng Real time PCR định lượng GMOs sản phẩm GMOs 15 2.3.4 Mức độ chuyên biệt phát định lượng GMOs 18 2.4 Tạo dòng gen 20 2.4.1 Khái quát vector chuyển gen 21 2.4.2 Vector tạo dòng plasmid .21 2.4.3 Khái quát gen tạo dòng 23 2.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp .24 2.4.5 Chọn lọc tế bào vi khuẩn biến nạp .24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 25 iv 3.2 Vật liệu nghiên cứu 25 3.2.1 Mẫu thí nghiệm dùng cho nghiên cứu 25 3.2.2 Dụng cụ - thiết bị dùng nghiên cứu 26 3.2.3 Hóa chất dùng nghiên cứu .26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1 Tạo dòng gen EPSPS 27 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn cho định lượng gen EPSPS Real time PCR 33 3.3.3 Ứng dụng Real time PCR cho chuẩn đoán đậu nành chuyển gen EPSPS 34 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Tạo dòng gen EPSPS 36 4.1.1 Tạo tế bào E coli khả nạp DH5α phương pháp Calcium Chloride 36 4.1.2 Tạo plasmid mang gen EPSPS 40 4.1.3 Biến nạp plasmid pGEM - T chèn đoạn DNA đích vào vi khuẩn E coli DH5α khả nạp 42 4.1.4 Ly trích, tinh DNA plasmid 46 4.1.5 Giải trình tự plasmid 50 4.2 Xây dựng đường chuẩn cho định lượng gen EPSPS Real time PCR 52 4.3 Ứng dụng Real time PCR cho chuẩn đoán GMO đậu nành .55 4.3.1 Quy trình ly trích DNA với CTAB .55 4.3.2 Thực chuẩn đoán đậu nành chuyển gen EPSPS 56 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 5.1 Kết luận .58 5.2 Đề nghị .58 Tài liệu tham khảo 59 Phụ lục 62  v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIA Advance Informed Agreement BCH Biosafety Clearing House BLAST Basic Local Alignment Search Tool Bt Bacillus thuringiensis CBD Convention on Biological Diversity CPB Cartagena Protocol on Biosafety CTAB Cetyl Trimethy Ammonium Bromide Ct Cycle threshold DNA Deoxyribonucleic Acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EPSPS 5-enolypyruvylshikimate - 3-phosphate synthase EU The European Union GMC Genetically Modified Crop GMO Genetically Modified Organism ISAAA International Service for the Acquisition of Agri - biotech Applications LB Luria-Bertani broth, Lysogeny broth hay Luria broth LMO Living Modified Organisms MCR Multiple Cloning Region MCS The Multiple Cloning Site (MCS) Nos Napoline synthase OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RBS Ribosome Binding Sites RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate TBE Tris, Borate, Edta Tris- HCL Aminomethane Hydrochloride(hydroxymethyl) UV Ultraviolet (light) X-gal - bromo - - chloro - - indolyl - β - D-glactopyranoside IPTG isopropyl - β - D-thiogalactoside vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1Một số trình tự kháng thuốc diệt cỏ thường sử dụng Bảng 2.2 Danh mục sinh vật biến đổi gen 10 Bảng 2.2 Danh mục sinh vật biến đổi gen(tt) 11 Bảng 3.1 Địa điểm thời gian thu thập mẫu đậu nành 24 Bảng 3.2 Đặc điểm cặp primer khuếch đại gen EPSPS 27 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen EPSPStrên mẫu DNA 28 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR dùng khuếch đại gen EPSPS 28 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng gắn kết gen EPSPS vào plasmid pGEM-T 29 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen EPSPS vi khuẩn E.Coli 30 Bảng 3.7 Thành phần phản ứng Realtime PCR 33 Bảng 3.8Bảng chu trình nhiệtphản ứng Real time PCR 33 Bảng 4.1Kết đo OD máy NanoVue plus 46 Bảng 4.2 Số copy mẫu chuẩnsử dụng cho phản ứng Real time PCR 51 Bảng 4.3 Kết định lượng chuyển gen EPSPS mẫu DNA đậu nành 54 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Cây đậu nành Hình 2.2Cấutrúccơbảncủagenchuyểnvàothựcvật Hình 2.3Diện tích trồng cơng nghệ sinh học tồn cầu giai đoạn 1996-2012 Hình2.4MứcđộchuyênbiệttrongpháthiệnvàđịnhlượngGMOs 17 Hình2.5Plasmid vector pGEM-T Easy 21 Hình 2.6Promoter trình tự đachọn lọc Vector pGEM-T Easy 22 Hình 4.1Kết thử nghiệm tỷ lệ 100 µl : µl, dịch cấy khơng ly tâm 36 Hình 4.2Kết thử nghiệm tỷ lệ 100 µl : µl, dịch cấy có ly tâm 37 Hình 4.3Kết thử nghiệm tỷ lệ 100 µl : 2,5 µl, dịch cấy khơng ly tâm 37 Hình 4.4Kết thử nghiệm tỷ lệ 100 µl : 2,5 µl, dịch cấy có ly tâm 38 Hình 4.5Kết nuôi cấy vi khuẩn khả nạp không biến nạp plasmid 38 Hình4.6Sản phẩm PCR DNA đậu nành gel 2% 39 Hình4.7 Kết biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli 42 Hình4.8Đĩa đối chứng cấy vi khuẩn E.Coli khơng mang plasmid 42 Hình 4.9Sản phẩm PCR khuẩn lạc gel 2% 44 Hình 4.10 Kết điện di DNA plasmid gel 2% 45 Hình 4.11 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu DNA plasmid 47 Hình 4.12 Kết phản ứng Real time PCR với mẫu DNA plasmid 51 Hình 4.13 Đường chuẩn xây dựng với mẫu chuẩn DNA plasmid 52 Hình 4.14 Kết điện di mẫu DNA đậu nành ly trích CTAB 54 Hình 4.15 Kết quảphản ứng Real time PCR mẫu DNA đậu nành 54 viii toàn sử dụng để thực phản ứng định lượng định tính chuyển gen EPSPSkháng thuốc trừ cỏGlyphosatetrên đậu nành 4.3.2 Thực chuẩn đoán đậu nành chuyển gen EPSPS Với đường chuẩn xây dựng trên, bốn mẫu DNA đậu nành chọn để định lượng chuyển gen EPSPS, kết thể hình 4.15 Mẫu chuẩn Hình 4.15Kết quảphản ứng Real time PCR trên3 mẫu DNA đậu nành 1)Mẫu DNA đậu nành số 1; 2)Mẫu DNA đậu nành số 2; 3)Mẫu DNA số 3; 4)Đối chứng âm Kết thực phản ứng Real time PCR mẫu DNA đậu nành ly trích mẫu chuẩn cho thấy có mẫu đậu nành số có phát chuyển gen EPSPS, mẫu số không phát chuyển gen EPSPS Mẫu số DNA đậu nành không chuyển gen Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường cung cấp; mẫu đối chứng âm khơng có tín hiệu huỳnh quang chứng tỏ phản ứng Real time PCR không bị tạp nhiễm Bảng 4.3 Kết định lượng chuyển gen EPSPStrên mẫu DNA đậu nành Mẫu Ct Số copy gen EPSPS Số 29,00 2,11 x 108 Số 26,68 1,21 x 109 Số Không phát Số Khơng phát Dựa vào phương trình đường chuẩn y = -3,0533x + 54,4187 xây dựng được, kết định lượng gen EPSPS mẫu DNA đậu nành tính tốn Kết định lượng chuyển gen EPSPStrên đậu nành thể bảng 3.3 56 Như vậy, kết sau thực phản ứng Real time PCR cho thấy mẫu đậu nành số có phát chuyển gen EPSPS với số lượng ban đầu 2,11 x 108 copies, mẫu đậu nành số có chuyển gen với số lượng số copy ban đầu 1,21 x 109 copies, mẫu đậu nành số không phát chuyển gen EPSPS Riêng mẫu đậu nành số đối chứng âm (đậu nành không chuyển gen EPSPS) Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Mơi trường cung cấp khơng phát có diện gen chuyển EPSP Điều chứng tỏ hóa chất, kỹ thuật thao tác đạt yêu cầu nhằm đảm bảo cho phản ứng Real time PCR nghiên cứu hoạt động cho kết tốt, đáng tin cậy 57 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đề tài khóa luận tốt nghiệp tạo nguồn vi khuẩn E coli DH5α có khả nhận plasmid tốt dùng để tạo dòng gen Tạo dòng thành cơng plasmid mang gen - enolypyruvylshikimate - phosphate synthase (EPSPS)kháng thuốc diệt cỏ Glyphosate, kết tạo dòng sử dụng để tạo đường chuẩn cho định lượng chuyển gen EPSPSkháng thuốc diệt cỏGlyphosate Xây dựng đường chuẩn cho định lượng chuyển gen EPSPS phương pháp Real time PCR có độ tin cậy cao (R2 = 0,9992) Ly trích thành công mẫu đậu nành thu thập phương pháp sử dụng CTAB, phục vụ cho việc thực phản ứng Real time PCR thử nghiệm đường chuẩn xây dựng 5.2 Đề nghị Thực nhiều nghiên cứu tạo dòng đa dạng loại gen chuyển nữa, tạo dòng trình tự promoter, terminater nhiều trình tự khác để tạo nhiều mẫu chuẩn đường chuẩn cho kiểm tra định lượng chuyển gen.Nhằm tăng mức độ chuyênbiệttrongpháthiệnvàđịnhlượngGMOs 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng việt Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang 2000.Chuyển nạp gen - Những nguyên tắc chọn giống trồng, Quyển II, Nhà xuất Nông Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.Thành phố Hồ Chí Minh Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ 2006.Giáo trìnhCơng nghệ chuyển gen(động vật, thực vật).Huế Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái 2005 Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α Luận văn kỹ sư Công Nghệ Sinh Học,Trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Hồng Lộc,Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung 2007 Giáo trình cơng nghệ DNA tái tổ hợp Nhà xuất đại học quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Nghĩa 2012 Xây dựng qui trình duplex PCR phát đậu nành chuyển gen Luận văn kỹ sư Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Phạm Hồng Sơn 2006.Giáo trình kỹ thuật sinh học phân tử Nhà xuất Đại học Huế Bùi Thị Thanh Tịnh 2006 Hồn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α Luận Văn Đại Học, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Hồng Thị Bích Thúy 2010 Nghiên cứu quy trình nhận diện số sản phẩm lúa gạo biến đổi gen kỹ thuật PCR Real time PCR Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Trưởng 2005 Bước đầu xây dựng quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen phương pháp Real time PCR Luận văn kỹ sư Công Nghệ Sinh học,Trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 10 Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Hữu Nghĩa, Phạm Thị Anh Thư, Huỳnh Văn Biết 2013 Nghiên cứu xây dựng quy tình kỹ thuật duplex PCR nhằm phát thực phẩm chuyển gien có nguồn gốc đậu nành Tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn số 217: 14 – 20 11 Phạm Hùng Vân 2009 PCR Real time PCR vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất y học chi nhánh Thành Phố Hồ Chí Minh 12 Bộ Tài Ngun Mơi Trường 2012 Dự thảo thông tư quy định định mức kinh tế kỹ thuật phát sinh vật biến đổi gen phương pháp phân tích định tính, định lượng Axit Deoxyribo Nucleic Hà Nội 59  Tài liệu nước 13 AnklamE., GadaniF., HeinzeP., PijnenburgH., EedeG V D 2002 Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant -derived food products Eur Food Res Technol214: 26 14 BenbrookC.2003.ImpactsofGeneticallyEngineeredCropsonPesticideUsein theUnited States:TheFirstEightYears.BioTechInfoNet.TechnicalPaperNumber6: 46 15 Bio rad 2004 iCycler iQTM Multicolor Real time PCR detection system Operating instructions Bio rad company, - 118 16 BrudererS., Katharina E Leitner 2003 Genetically Modified (GM) Crops: Molecular and regulatory details, BATS Version 2: -199 17 Choi Y D., Cheong J J 2004 The Current Status of GMOs Development Crop Functional Genomics Center, School of Agricultural Biotechnology, Seoul National University, Korea 18 Chowdhury M.K.U and Vasil I.K 1992 Stably transformed herbicide resistant callus of sugarcane via microprojectile bombardment of cell suspension cultures and electroporation of protoplasts, Plant Cell Rep.11:494-498 19 EEA(EuropeanEnvironmentAgency) 1999.Geneticallymodified organisms.In: Environment in the European Union at the turn of the century,Environmental assessment report No 2:245-261 20 Fearing P.L, Brown D, Vlachos D,Meghji M, Privalle L 1997 Quantitative analysis of CryIAb expression in Bt maize plants, tissues, and silage and stability of expression over successive generations, Molecular Breeding 3: 169-176 21 GonsalvesD 2004 Transgenic Papaya in Hawaii and Beyond AgBioForum volume 7, Number and 2: 36 -40 22 Hemmer W 1997 Food derived from genetically modified organisms and detection methods In:BATS-Report 2/1997 Agency for Biosafety Research and Assessment of Technology Impacts of the Swiss Priority Programme Biotechnology of the Swiss National Science Foundation, Basel, Switzerland, 59 23 Holland P M., Abramson, R D.; Watson R.; Gelfand D H 1991 Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America88: 7276 - 7280 24 JamesC 2012 Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012 In:ISAAA Brief No 44:1-18 25 Maher M Shehata 2005 Genetically modified organisms (GMOs), food and feed: Current status and detection In: Journal of Food, Agriculture and Environment Vol.3: 43-55 60 26 Querci M., Mazzara M 2004 Characteristics of the Qualitative PCR Systems Described in the Manual, Session The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms European Commission Joint Research Center, EU, -11 27 Querci M., Mazzara M, MarettiM 2004 Qualitative Detection of MON810 Maize, Bt - 176 Maize and Roundup Ready® Soybean by PCR, Session The Analysis Of Food Samples For The Presence Of Genetically Modified Organisms European Commission Joint Research Center, EU,1 - 26 28 Ricarda A.Steinbrecher 2002.The CaMV 35S Promoter, Government and Corporate Scientific Incompetence: Failure to assess the safety of GM crops ECONEXUS Briefing December: 1-2 29 Sambrook J., Russell D W 1989.Chapter Plasmid and their usefulness in Molecular Cloning.Molecular cloning a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 31- 162 30 SongX., GuY., QinG 2006 Application of a transfomation method via pollen tube pathway in agriculture molecular breeding Life Science Jounal, 77-79 31 Yoke-Kqueen C., Yee-Tyan C., Siew- Ping, K., Son R 2011 Development of multiplex-PCR for Genetically Modified Organism (GMO) detection targeting EPSPS and Cry1Ab genes in soya and maize samples In: International Food Research Journal 1:515-522  Tài liệu từ internet 32 Promega Quick protocol: pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems instructions for use of products A1360, A1380, A3600 AND A3610 2010.http://www.promega.com/~/media/Files/Resources/ProtCards/pGEMT%20and%20pGEMT%20Easy%20Vector%20Systems%20Quick%20Protocol.pdf 33 Promega Technical Manual pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems instructions for use of products A1360, A1380, A3600 and A3610 Revised 12/2010 http://www.promega.com/~/media/files/resources/protocols/technical%20manuals/ 0/pgem-t%20and%20pgemt%20easy%20vector%20systems%20protocol.pdf?la=en 34 Quick protocol wizard®plusSV minipreps DNA purification systeminstructions for use of products a1330, a1340, a1460, a1465 and a1470 Revised 12/2010 http://worldwide.promega.com/~/media/Files/Resources/ProtCards/Wizard%20Plu s%20SV%20Minipreps%20DNA%20Purification%20System%20Quick%20Proto col.pdf 35 Trần Đăng Hồng Sinh vật biến đổi gen Phần vii: Tranh luận sinh vật biến đổi gen 2013.http://khoahocnet.com/2013/04/11/tran-dang-hong-phd-sinh-vat-biendoi-gen-phan-vii-tranh-luan-sinh-vat-bien-doi-gen/ 61 PHỤ LỤC Phụ lục Kết giải trình tự dạng peak trình tự ngược R Phụ lục Kết giải trình tự dạng peak trình tự xi F Phụ lục LOCUS primer F 355 bp DEFINITION primer F 355 bp TITLE primer F ORIGIN TGGCGCCCAA AGCTTGCATG GC -61 -121 -181 -241 -301 // LOCUS doan DNA chen 355 bp DEFINITION doan DNA chen 355 bp TITLE doan DNA chen ORIGIN TGGCGCCCAA AGCTTGCATG GTCCTCGCCT TCCAGAAGGC 61 CGGTGATGCG CGTTTCACCG GAAGGACCGG TGGGAGATCG 121 ACTTGTCGCC GGGAATGCGG GGATTTGCGG GCGGTTGCGG 181 GCCGGCTGCT TGCACCGTGA TGATGCTGAA ATCCTAAAGG 241 AACAAAACTT TTGCATAAAA CAACATAGAA TTTGCTGAAT GCCTTGCCCG TATTGATGAC CTCGCGAGAC CGCCGAACAT ACGGTTCCGG AAAGGCCAGA AGCATGCAGG CTGTAGCCAC ATTGAATCTT TTTTCAAAAC 301 TTTTCAGTTT TTTAGGAACT TGGGG // TTTAGATCCA AAAACAAGAA AACTTGAAGA GCCTTGCCCG TATTGATGAC CTCGCGAGAC CGCCGAACAT ACGGTTCCGG AAAGGCCAGA AGCATGCAGG CTGTAGCCAC ATTGAATCTT TTTTCAAAAC AAAACAAGAA AACTTGAAGA Phụ lục LOCUS doan DNA chen 355 bp DEFINITION doan DNA chen 355 bp TITLE doan DNA chen ORIGIN TGGCGCCCAA AGCTTGCATG GTCCTCGCCT TCCAGAAGGC 61 CGGTGATGCG CGTTTCACCG GAAGGACCGG TGGGAGATCG 121 ACTTGTCGCC GGGAATGCGG GGATTTGCGG GCGGTTGCGG 181 GCCGGCTGCT TGCACCGTGA TGATGCTGAA ATCCTAAAGG 241 AACAAAACTT TTGCATAAAA CAACATAGAA TTTGCTGAAT 301 TTTTCAGTTT TTTAGATCCA TTTAGGAACT TGGGG // LOCUS primer R 355 bp DEFINITION primer R 355 bp TITLE primer R ORIGIN -61 -121 -181 -241 -301 -ACTTGAAGA TTTAGGAACT TGGGG// Phụ lục Phụ lục Phụ lục Phụ lục Glycine max transgenic chloroplast CP4-EPSPS fusion protein precursor, gene, promoter region and partial cds; nuclear gene for chloroplast product Sequence ID: gb|AY592954.1|Length: 707Number of Matches: Range 1: 349 to 703 Query Score Expect Identities Gaps Strand 34 bits(343) 2e-178 351/355(99%) 0/355(0%) Plus/Minus TGGCGCCCAAAGCTTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC ||||||||| 60 || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 703 TGGCGCCCATGGCCTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC 644 Query 61 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 643 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 584 Query 121 ACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGTTCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 583 ACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGTTCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGG 524 Query 181 GCCGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCAGGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 523 GCCGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCAGGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGG 464 Query 241 AACAAAACTTTTGCATAAAAATTGAATCTTTTTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAAT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 463 AACAAAACTTTTGCATAAAAATTGAATCTTTTTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAAT Query 301 TTTTCAGTTTTTTAGATTCAAAAACAAGAAAACTTGAAGATTTAGGAACTTGGGG 404 355 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 403 TTTTCAGTTTTTTAGATCCAAAAACAAGAAAACTTGAAGATTTAGGAACTTGGGG 349 Phụ lục Glycine max transgenic cp4epsps gene for 5-enol-pyruvylshikimate-3phospate synthase class precursor, complete cds Sequence ID: dbj|AB209952.1|Length: 2457Number of Matches: Range 1: 364 to 718 Query Score Expect Identities Gaps 634 bits(343) 2e-178 351/355(99%) 0/355(0%) Plus/Minus Strand TGGCGCCCAAAGCTTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC ||||||||| 60 || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 718 TGGCGCCCATGGCCTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC 659 Query 61 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 658 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 599 Query 121 ACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGTTCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 598 ACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGTTCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGG 539 Query 181 GCCGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCAGGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 538 GCCGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCAGGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGG 479 Query 241 AACAAAACTTTTGCATAAAAATTGAATCTTTTTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAAT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 478 AACAAAACTTTTGCATAAAAATTGAATCTTTTTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAAT Query 301 TTTTCAGTTTTTTAGATTCAAAAACAAGAAAACTTGAAGATTTAGGAACTTGGGG 419 355 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 418 TTTTCAGTTTTTTAGATCCAAAAACAAGAAAACTTGAAGATTTAGGAACTTGGGG 364 Range 2: 2178 to 2298 Query Score Expect Identities Gaps Strand 202 bits(109) 2e-48 117/121(97%) 0/121(0%) Plus/Minus TGGCGCCCAAAGCTTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC ||||||||| Sbjct 2298 60 || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGCGCCCATGGCCTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC 2239 Query 61 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| Sbjct 2238 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGGGATCG Query 121 A 2179 121 | Sbjct 2178 A 2178 Phụ lục 10 Glycine max CP4EPSPS gene, complete cds Sequence ID: gb|AF464188.1|AF464188Length: 1529Number of Matches: Range 1: 10 to 364 Query Score Expect 634 bits(343) 2e-178 351/355(99%) Identities Gaps Strand 0/355(0%) Plus/Minus TGGCGCCCAAAGCTTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC ||||||||| 60 || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 364 TGGCGCCCATGGCCTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC 305 Query 61 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 304 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 245 Query 121 ACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGTTCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 244 ACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGTTCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGG 185 Query 181 GCCGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCAGGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 184 GCCGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCAGGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGG 125 Query 241 AACAAAACTTTTGCATAAAAATTGAATCTTTTTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAAT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 124 AACAAAACTTTTGCATAAAAATTGAATCTTTTTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAAT Query 301 TTTTCAGTTTTTTAGATTCAAAAACAAGAAAACTTGAAGATTTAGGAACTTGGGG 355 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 64 TTTTCAGTTTTTTAGATCCAAAAACAAGAAAACTTGAAGATTTAGGAACTTGGGG 10 65 Phụ lục 11 Synthetic construct CP4EPSPS protein (CP4EPSPS) gene, complete cds Sequence ID: gb|AY125353.1|Length: 1946Number of Matches: Range 1: 10 to 364 Query Score Expect Identities Gaps Strand 634 bits(343) 2e-178 351/355(99%) 0/355(0%) Plus/Minus TGGCGCCCAAAGCTTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC ||||||||| 60 || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 364 TGGCGCCCATGGCCTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC 305 Query 61 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 304 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 245 Query 121 ACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGTTCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGG 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 244 ACTTGTCGCCGGGAATGCGGACGGTTCCGGAAAGGCCAGAGGATTTGCGGGCGGTTGCGG 185 Query 181 GCCGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCAGGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 184 GCCGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCAGGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGG 125 Query 241 AACAAAACTTTTGCATAAAAATTGAATCTTTTTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAAT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 124 AACAAAACTTTTGCATAAAAATTGAATCTTTTTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAAT Query 301 TTTTCAGTTTTTTAGATTCAAAAACAAGAAAACTTGAAGATTTAGGAACTTGGGG 65 355 ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 64 TTTTCAGTTTTTTAGATCCAAAAACAAGAAAACTTGAAGATTTAGGAACTTGGGG 10 Range 2: 1824 to 1944 Query Score Expect Identities 202 bits(109) 2e-48 117/121(97%) 0/121(0%) Gaps Strand Plus/Minus TGGCGCCCAAAGCTTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC ||||||||| 60 || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1944 TGGCGCCCATGGCCTGCATGGCCTTGCCCGTATTGATGACGTCCTCGCCTTCCAGAAGGC 1885 Query 61 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGAGATCG 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| Sbjct 1884 CGGTGATGCGCGTTTCACCGCTCGCGAGACCGCCGAACATGAAGGACCGGTGGGGGATCG Query 121 A Sbjct 1824 121 | A 1824 1825 ... tốt nghiệp Tách dòng, tạo plasmid mang gen EPSPS ứng dụng cho phát đậu nành (Glycine max L.) chuyển gen kháng thuốc diệt c Glyphosate đã thực hiệnvới mục tiêu tạo mẫu chuẩn mang gen EPSPScó độ... Tách dòng, tạo plasmid mang gen EPSPS ứng dụng cho phát đậu nành (Glycine max L.) chuyển gen kháng thuốc diệt c Glyphosate thực nhằm bước đầu tạo mẫu chuẩn đường chuẩn cho việc định lượng phát. .. ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH DỊNG, TẠO PLASMID MANG GEN EPSPS ỨNG DỤNG CHO PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) CHUYỂN