LUẬN văn đề tài NGHIÊN cứu xác ĐỊNH cây NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ BẰNG kĩ THUẬT PCR và ĐÁNH GIÁ đa DẠNG DI TRUYỀN tập đoàn NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ

LUẬN văn đề tài NGHIÊN cứu xác ĐỊNH cây NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ BẰNG kĩ THUẬT PCR và ĐÁNH GIÁ đa DẠNG DI TRUYỀN tập đoàn NGÔ MANG GEN KHÁNG THUỐC TRỪ cỏ

Bộ Giáo dục đào tạo Khoa công nghệ sinh học KHểA LUN TT NGHIP Đề tài: Nghiên cứu, xác định ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ kĩ thuật PCR đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ H NI - 2008 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Phần I: Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Đầu năm 80 kỷ XX xuất công bố chuyển gen từ mở ra chân trời mới, chứa đựng tơng lai đầy hứa hẹn cải tiến trồng Nhiều giống trồng đà đợc chuyển gen để tạo đặc tính u việt, giúp cải thiện suất, chống chịu sâu bệnh, hạn, mặn, lạnh, tăng chất lợng cải thiện môi trờng Từ kỹ thuật gen trở thành công cụ hữu hiệu đợc ứng dụng cải tiến giống trồng Sự phát triển nhanh chóng Công nghệ Sinh học đà đa thực vật chuyển gen sản phẩm chúng đến với thị trờng tiêu dùng Và kể từ kỹ thuật gen thực vật đợc thiết lập, thử nghiệm thành công ứng dụng đà đợc đầu t đợc tiến hành cách rộng rÃi để giải vấn đề tồn Nông nghiệp Vì thực vật chuyển gen đà đợc trồng phổ biến đồng ruộng để làm tăng tính kháng bệnh, kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ hệ thống canh tác Từ cuối năm 1997, trồng biến đổi gen sản phẩm chúng đà đợc chấp nhận thơng mại hoá số quốc gia Ngày việc sản xuất sử dụng trồng chuyển gen ngày gia tăng, khẳng định tầm quan trọng sản xuất nông nghiệp số nghành khác Năm 2007 diện tích trồng tiếp tục tăng số, đạt 12% tơng đơng với 12,3 triƯu hecta (30 triƯu mÉu Trong ®ã tỉng diƯn tÝch trồng 12 năm (1996-2007) đạt 690 triệu héc-ta (1,7 tỷ mẫu) Với mức tăng cha thấy gấp 67 lần từ 1996-2007, trở thành công nghệ trồng đợc áp dụng nhanh thời gian gần Ngày nay, chuyển gen đợc trồng ngày rộng rÃi nhiều nớc giới Nhng câu hỏi an toàn việc sử dụng sản phẩm chuyển gen đồng thời đợc đặt trở thành vấn đề nóng bỏng với hàng loạt vấn đề liên quan xoay quanh nó, liệu chúng đợc sử dụng dới -2- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu dạng khả rủi ro đến với sức khoẻ ngời, với đa dạng sinh học, tiềm ẩn ô nhiễm môi trờng Việt Nam, đến thời gian xây dựng hoàn thiện quy chế quản lý an toàn sinh học chuyển gen kiểm soát sản phẩm biến đổi gen Tuy nhiên, để đa nhanh chuyển gen vào sản xuất Việt Nam việc nghiên cứu tạo chuyển gen, trồng thử nghiệm kiểm soát trồng biến đổi gen cần phải tiến hành trớc bớc Trong số trồng biến đổi gen thử nghiệm ngô đợc quan tâm đặc biệt ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ Để đáp ứng tiêu kỹ thuật việc phát xác ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ nhanh chóng sử dụng dòng ngô phục vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc diệt cỏ Việt Nam Chúng đà thực đề tài Nghiên cứu, xác định ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ kĩ thuật PCR đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ 1.2 Mục đích Thu thập liệu trồng biến đổi gen tìm hiểu cách tổng quan ngô chuyển gen Bớc đầu làm quen với kỹ thuật nghiên cứu chuyển gen Xác định đoạn trình tự đặc trng promoter CaMV-35S (195bp) có ngô chuyển gen Xác định gen PAT (Phosphinothricin-N-Acetyltransferase) gen kháng thc trõ cá glufosinate cã ng« chun gen b»ng kỹ thuật PCR Đánh giá đặc điểm hình thái, tiêu nông sinh học đa dạng di trun ë møc ph©n tư b»ng kÜ tht PCR-RAPD cđa số dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ cho công tác backcross tạo dòng ngô −u viƯt mang gen gen kh¸ng thc trõ cá -3- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Phần II: Tổng QUAN Ti Liệu 2.1 Giới thiệu ngô 2.1.1 Vài nét sơ lợc ngô Cây ngô có tên khoa học Zea mays L., thuộc chi Maydeae, hä Gramineae Tõ thÕ kû 16 Colombus mang h¹t giống từ châu Mỹ sản xuất ngô đà lan tràn khắp giới trở thành loại ngũ cốc quan trọng cung cấp lơng thực cho loài ngời Hiện giới tồn hai hệ thống phân loại loại Zea Wilkes (1967) Iltis & Doebly (1984) Nhãm Euchleana Nhãm Luxuriantes Z penrennis (Hitch) Reeves & Mangelsdorf Z diploperennis Iltis Doebly & Guzman Z mexicana (Schrader) Kuntze Z perennis Hitch Reeves & Mangelsdorf Nßi Guatemala Nhãm Zea Z mays subsp Parviglumis Iltis & Doebly Nßi Huchuetenango Var Huchuetenangensis Iltis & Doebly Nßi Balsas Var Parviglumis Iltis & Doebly subsp Mexicana (Schrader) Iltis Nßi Chalco Nòi Chalco Nòi Cao nguyên trung phần Nòi Cao nguyên trung phần Nòi Nobogame Nòi Nobogame Nhóm Zea Z mays L Z mays subsp mays Tõ loµi Zea mays L, dựa vào cấu trúc nội nhũ hạt đợc phân thành loài phụ, sau dựa vào màu hạt màu lõi để phân thứ (varieta) Những loài phô chÝnh bao gåm: Zea mays Zea mays Subsp indurata Subsp indentata -4- - ngô đá - ngô ngựa Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays Zea mays Ng« cã nguån gèc tõ - ng« nÕp Subsp ceratina - ng« nÕp Subsp saccharata - ng« bét Subsp everta - ng« bét Subsp amylacea - ng« bäc Subsp tunecata Trung Mü song ngô đà thích nghi nhanh với điều kiện sinh thái khác Bắc bán cầu, ngô trồng Đan Mạch đến vĩ tuyến 55o-56o, Liên Xô cũ Canada tới vỹ tuyến 58o ë P P P P P P Nam b¸n cầu, ngô đợc trồng New Zealand đến vĩ tuyến 42o-43o (Humlam P P P P John, 1942, Necula GH cs, 1957) Ngô trồng thích ứng réng Theo Necula G H (1957) ng« cã thĨ trång độ cao 3900m Tuy nhiên xa khỏi xích đạo độ cao giảm Ví dụ nh Peru (16o nam) ngô trồng đợc P P độ cao 3900m, Bắc Carolia (34o-37o bắc) trồng đợc 1200m, Châu nh P P P P thung lũng Kasmir 2000m, Châu Âu (khoảng 45o-48o bắc) độ cao P P P P 500-800m Trên phạm vi giới, nhà khoa học đà chia sinh thái ngô thành vùng chính: Ôn đới Cận nhiệt đới Nhiệt đới cao (trên độ cao 2000m so với mặt biển) Nhiệt đới thấp (dới 2000m) Theo phân loại này, Việt Nam nằm vùng sinh thái nhiệt đới thấp Các giống từ vùng nhiệt đới thấp biểu thích ứng thông qua khả chống chịu suất, kể thảo nguyên cao phía Bắc vụ đông Đồng Bắc Bộ 2.1.2 Nguồn gen đa dạng di truyền ngô Ngô trồng đợc thu thập, mô tả bảo tồn tốt từ trung tâm đa dạng di truyền Từ năm 1943, quỹ Rockefeller hợp tác với nớc Mỹ La tinh đà thu thập nguồn gen ngô từ trung tâm đa dạng chính, tạo sở cho -5- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu tập đoàn ngô Mexico, Colombia Brazil Ngày có khoảng 15.000 mẫu giống ngô đà đợc thu thập từ nớc khác giới Việt Nam, nguồn gen ngô đợc bảo tồn Viện nghiên cứu ngô với khoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự 3.000 dòng [10] Tập đoàn ngô Mexico trung tâm xuất ngô có đa dạng tối đa có bốn nòi đợc xác lập là: A Nhóm nòi địa cổ đại: Ngời ta cho nhóm xuất phát từ ngô bọc nguyên thuỷ Mexico Các nòi nhóm khác phát triển độc lập địa bàn môi trờng khác chúng tổ tiên Bốn nòi nhóm Palomero toluqueno, Arrocillo amarillo, Chapalote vµ Nal-tel B Nhãm nhËp néi tiỊn Columbus: Các nòi nhóm đợc nhập vào Mexico từ Trung Nam Mỹ vào thời tiền sử Bốn nòi là: Cacahuacintle, Harinoso de Ocho, Oloton ngô C Nhãm lai tiỊn sư: Nhãm nµy bao gåm nòi đợc coi tạo từ việc lai tạp nòi địa cổ đại với nòi nhập nội tiền Columbus, hai nhóm với Teosinte Hiện tám nòi là: Conico, Reventador, Tablonicillo, Tehua, Tepecintla, Comiteco, Jala vµ Zapalote chico D Nhãm đại: Bao gồm nòi phát triển gần cha đạt đến trạng thái ổn định, nhiên có đặc điểm phân biệt xác định Có bốn nòi đợc gọi là: Chalqueno, Celaya, Conico Norteno Bolita Từ ta thấy rõ biến dị to lớn đà đợc xảy nh Đó nòi giống sản sinh nguồn gen ngô giới đa dạng di truyền Sự đa dạng di truyền ngô đợc thể tất tính trạng cờ bắp đặc điểm cây, biến ®éng thĨ hiƯn ë chiỊu cao c©y, chiỊu cao ®ãng bắp đặc điểm (dài lá, chiều rộng lá, số cây, số -6- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu bắp), màu thân dạng lóng Sự biến động cờ thể độ dài cờ, cuống cờ, độ nhánh dài, số nhánh cấp hai ba, đờng kính bắp số hàng hạt Đặc biệt biến động đa dạng nội nhũ hạt, từ ta phân biệt dạng ngựa, đá rắn, bột, đờng, nếp, nổ bọc Sự biến động thể kích thớc hạt, màu hạt chất lợng hạt Việt Nam ngô trồng nhập nội phong phú nguồn gen có hạn hẹp Theo nghiên cứu phân loại ngô địa phơng Việt Nam (GS.TS Ngô Hữu Tình, 1995) từ năm 60 đến cho thấy, ngô Việt Nam tập trung chủ yếu vào hai loài phụ đá rắn nếp Ngày để đánh giá đa dạng di truyền loài, ngời ta không dựa vào đặc điểm thực vật học dễ nhận biết riêng rẽ mà cần phân tích sở nhiều tính trạng để phân biệt nhóm cách biệt di truyền thông qua khoảng cách Ơclit khoảng cách Mahalanobis Gần công nghệ sinh học đà góp phần đắc lực việc xác định đa dạng di truyền thông qua kỹ thuật Isozyme đa hình độ dài phân đoạn cắt hạn chế (RFLP Restriction Flagment Length Polymorphis), RAPD (Đa hình đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) 2.1.3 Đặc điểm hình thái ngô Rễ: Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho rễ họ hòa thảo Ngô có ba loại rễ chính: Rễ mầm, Rễ đốt (rễ phụ cố định), Rễ chân kiềng, chúng giúp ngô hút nớc chất dinh dỡng từ đất Thân, lá: Ngô thuộc họ hòa thảo, song có thân chắc, có đờng kính từ 2-4cm tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái chăm sóc Thân có chiều cao khoảng 1,5-4m Thân ngô trởng thành bao gồm nhiều lóng (dóng) nằm đốt kết thúc cờ Lá ngô đợc mọc từ đốt thân ngô, bẹ ôm chặt lấy thân lỡi (thìa lìa) -7- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Bông cờ bắp: Ngô loại có hoa khác tính gốc Hai quan sinh sản đực (bông cờ) (bắp) nằm cây, song vị trí khác Hoa đực thờng đợc gọi cờ nằm đỉnh Hoa (bắp ngô) phát sinh tõ chåi n¸ch c¸c l¸, song chØ 1-3 chåi khoảng thân tạo thành bắp Hạt: Hạt ngô thuộc loại dính gồm năm phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ chân hạt Vỏ hạt bao quanh hạt, màng nhẵn Lớp alơron nằm dới vỏ hạt, bao lấy nội nhũ phôi Nội nhũ phần hạt chứa tế bào dự trữ chất dinh dỡng Nội nhũ có hai phần: néi nhị bét vµ néi nhị sõng Tû lƯ nµy phục thuộc vào chủng ngô giống ngô khác 2.1.4 Tình hình định hớng phát triển ngô Việt Nam Việt Nam, ngô lơng thực quan trọng thứ hai sau lúa, có phát triển rộng khắp, liên tục đạt đỉnh điểm vào năm 2005 Theo tổng quan nông nghiệp năm 2005” cđa Ngun Sinh Cóc (NN vµ PTNT – 1/2006) sản xuất ngô năm 2005 có tiến vợt bậc: Diện tích đạt 1039 nghìn ha, suất đạt 35,5 tạ/ha sản lợng đạt 3,69 triệu tấn, đà làm thay đổi tỷ trọng cấu sản lợng thực từ 5,7% năm 2000 lên 9% năm 2005 [1] Những tiến sản xuất ngô Việt nam thể rõ nét giai đoạn 20 năm thực đờng lối đổi Đảng Trong suất 20 năm qua (1985-2004) diện tích, suất sản lợng ngô Việt Nam tăng liên tục với tốc độ cao Tỷ lệ tăng trởng bình quân hàng năm suốt 20 năm diện tích 7,5%/năm, suất 6,7%/năm sản lợng 24,5%/năm, cao nhiều 10 năm trớc đất nớc ta thống 1975-1985 (các tỷ lệ tơng ứng giai đoạn 4,2%; 3,9% 10,0%) Nếu lấy số liệu tuyệt đối năm (1985) sau 20 năm đổi (2004) thấy diện tích ngô tăng 2,5 lần, suất 2,3 lần sản lợng 5,9 lần [1] -8- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Tuy nhiên, suất ngô Việt Nam năm 2004 (34,9 tạ/ha) thấp suất bình trung bình giới (48,5 tạ/ha), thấp nhiều so với Mỹ (100,0 tạ/ha) Trung Quốc (51,1 tạ/ha) song đà vợt đợc suất bình quân khối nớc phát triển (31,3 tạ/ha) Mặc dầu vậy, khách quan mà nói: Sản xuất ngô Việt Nam thời kỳ đổi đà có phát triển vợt bậc, toàn diện đáng trân trọng 2.2 Cây trồng biến đổi gen 2.2.1 Khái niệm trồng biến đổi gen Cây trồng biến đổi gen trồng công nghệ sinh học trồng đà đợc biến đổi mặt di truyền nhằm làm cho trồng mang số đặc tính quý trồng tự nhiên Công nghệ cho phép gen riêng biệt đà chọn lọc đợc chuyển từ thể sang thể khác nh loài liên quan với Các tính trạng thờng đợc chuyển vào trồng nh tính kháng côn trùng, kháng nÊm bƯnh, kh¸ng vi khn, kh¸ng thc trõ cá, kh¸ng mặn, cho suất cao, chất lợng sản phẩm tốt Đây phơng hớng quan trọng giải vấn đề an toàn lơng thực cho nhân loại góp phần giảm thiểu loại nông dợc phân bón hoá học, bảo vệ môi trờng sinh thái bền vững Sự biến đổi mặt di truyền thờng bao gồm chèn đoạn ADN, tái tổ hợp mảnh ADN nhỏ vào hệ gen trồng bị biến ®ỉi CÊu tróc cđa gen chÌn ®iĨn h×nh GMC (Genetically Modified Crops) đợc tạo nên phận: Đoạn promoter (đoạn khởi động) có chức điều khiển hoạt động gen cấu trúc, đợc ví nh công tắc bật/mở để đọc gen chèn vào Gen đà đợc chèn (gen đà bị biến đổi) thực chất gen cấu trúc mà hoá cho đặc điểm đà chọn lọc riêng biệt Đoạn terminator (đoạn kết thúc) có chức nh tín hiƯu dõng ®Ĩ ®äc gen ®· chÌn -9- Khãa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Ngoài vài yếu tố khác có mặt cấu trúc đoạn ADN chèn chức chúng thờng để điều chỉnh ổn định chức gen để chứng minh có mặt cấu trúc ADN chèn GMC để có kết hợp dễ dàng thành phần khác cấu trúc đoạn ADN chèn Cấu trúc đoạn ADN chèn phải tơng hợp với hệ gen thể nhận để có di truyền ổn định 2.2.2 Những vấn đề liên quan đến trồng biến đổi gen 2.2.2.1 Lợi ích trồng biến đổi gen Thực trạng phát triển nhanh chóng trồng biến đổi gen năm qua đà chứng tỏ chúng có mặt mạnh trội hẳn trồng không biến đổi gen Sau lợi ích mà chúng đem lại cho ngời thời gian kể từ trồng biến đổi gen xuất nay: Lợi ích nghiên cứu bản: Việc sử dụng GMC đà góp phần to lớn việc phát gen quan trọng, xác định đợc chức gen Lợi ích cải tạo giống trồng: Nhờ có công nghệ gen mà nhiều giống trồng đợc tạo với đặc tính trồng tự nhiên nh khả chống chịu điều kiện ngoại cảnh, chống chịu sâu bệnh, chống chịu thuốc diệt cỏ nhằm nâng cao sản lợng chất lợng trồng Lợi ích chăn nuôi gia súc: Công nghệ chuyển gen thực vật đà tạo loại thức ăn gia súc chứa kháng thể đặc hiệu hay văcxin tái tổ hợp, làm tăng sức đề kháng vật nuôi bệnh tật, tạo loại thức ăn có chất lợng dinh dỡng cao Lợi ích công nghệ thực phẩm: Rất nhiều loại thực phẩm có chất lợng dinh dỡng cao, mẫu mà đẹp, thời gian bảo quản lâu, hay làm thay đổi hàm lợng acid béo dầu thực vật nhằm làm giảm nguy mắc bệnh tim mạch đà đợc tạo nhờ công nghệ chuyển gen thực vật -10- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu 4.5.1 Đa dạng di truyền mức hình thái số đặc điểm nông sinh học dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ 14 dòng nghiên cứuđợc bố trí theo khối ngẫu nhiên điều kiện kiểm soát chặt chẽ, dòng gieo thành hàng dài 5m, khoảng cách gieo 70cm x 25 cm x 1cây/hốc Các đặc điểm hình thái nông sinh học đợc tiến hành đánh giá qua thí nghiệm so sánh, kết bảng Bảng 6: Một số đặc điểm hình thái đặc điểm nông sinh học dòng giống ngô kháng thuốc diệt cỏ (vụ Thu Đông 2007) Tên dòng Thời gian sinh trởng (ngày) Cao TB (cm) Cao bắp TB (cm) Số TB Dài cờ TB (cm) CG3-D1 110 104,8 50,3 16 CG4-D1 115 89,2 43,3 CG3-D2 110 91,8 CG3-D3 110 CG3-D4 Mµu cê Mµu râu Màu dạng hạt 26,6 Trắng xanh Hồng ĐV, LT, RN Cây yếu, tha, bắp nhỏ, kết hạt 16 14,1 Nâu Hồng ĐV, LĐ Cây yếu, tha, bắp nhỏ 53,0 16 24,3 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, tha, bắp nhỏ 102,2 38,2 17 27,4 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ 110 86,6 44,9 16 21,6 Trắng xanh Hồng ĐV LT BRN Cây yếu, bắp nhỏ, hạt CG3-D5 110 105,2 46,4 16 27,0 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, tha, b¾p nhá CG3-D6 110 102,6 51,2 16 24,8 Tr¾ng Hång ĐV, LT Cây yếu, tha, bắp nhỏ CG3-D7 110 112,1 56,6 17 33,4 Trắng Hồng ĐV, LT Cây yếu, b¾p nhá CG3-D8 110 111,3 48,8 17 31,8 Tr¾ng Hång ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ CG3-D9 110 98,6 57,8 17 28,4 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhá, kÕt h¹t kÐm CG4-D2 115 86,2 51,0 16 13,2 Nâu Hồng ĐV, LĐ Cây yếu, tha, bắp nhỏ CG3-D10 110 108,4 54,0 17 26,0 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ, kết hạt CG3-D11 110 102,6 52,2 17 24,3 Trắng xanh Hồng ĐV, LT Cây yÕu, b¾p nhá CG3-D12 110 112,4 48,6 17 32,0 Tr¾ng Hồng ĐV, LT Cây yếu, bắp nhỏ ĐV: đá vàng; LT: lõi trắng; LĐ: lõi đỏ; BRN: bán ngựa -46- Đặc điểm khác Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Nhìn chung dòng ngô nghiên cứu có thời gian sinh trởng từ 110-115 ngày (vụ Thu Đông 2007), dòng ngô nghiên cứu có chiều cao trung bình thấp dao động từ 86,2-112,4cm, 16-17 lá, yếu bắp nhỏ, khă kết hạt Các dòng ngô sử dụng trực tiếp vào thí nghiệm tạo giống lai 4.5.2 Kết phân tích đa hình ADN kỹ thuật PCR-RAPD dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ Để tiến hành phân tích đánh giá mức độ đa hình di truyền dòng, sản phẩm PCR đợc điện di gen agarose 1% Dới kết phân tích PCR-RAPD với số mồi đặc trng + Mồi OPA12 Hình 10: Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD với đoạn mồi OPA12 Các giếng từ 1-14 tơng ứng với thứ tự dòng ngô Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD (hình 10) 14 dòng ngô với mồi OPA12 có 11 loại băng với kích thớc khác từ 400-2000bp đợc nhân lên (bảng 7) Trong đó, mẫu số (CG3-D4) có số băng ADN đợc nhân nhiều băng, mẫu số (CG3-D2) có băng đợc nhân Mẫu số (CG3-D2) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 400 bp, 1600 bp băng vắng mặt (duy nhất) vị trí 1000 bp, 1100 bp, 1400 bp 1500 bp -47- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Tính đa hình đợc thể xuất hay không xuất băng ADN so sánh dòng với mồi OPA12 11 băng cho đa hình Bảng 7: Các băng ADN đợc nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi OPA12 Thứ tự dòng TT 10 11 12 13 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 10 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 Tæng 7 8 7 14 1 1 1 (số đoạn ADN đợc nhân, Số đoạn ADN không đợc nhân) + Mồi OPM12 Hình 11: Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD với đoạn mồi OPM12 -48- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD dòng ngô với mồi OPM12 có loại băng với kích thớc khác từ 200-700bp đợc nhân lên Trong đó, mÉu sè (CG3-D4) vµ mÉu sè (CG3-D5) cã số băng ADN đợc nhân nhiều phân đoạn mẫu số (CG3-D2) mẫu số (CG3-D7) băng đợc nhân Mẫu số (CG3-D4) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 700 bp mồi OPM12 băng nhân lên cho đa hình Bảng 8: Các băng ADN đợc nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi OPM12 Thứ tự dòng TT 10 11 12 13 14 2 Tæng 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 (Số đoạn ADN đợc nhân, Số số đoạn ADN không đợc nhân) + Mồi S208 Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD với đoạn mồi S208 Kết điện di sản phẩm PCR_RAPD dòng ngô với mồi S208 có loại băng với kích thớc khác từ 100-1700bp đợc nhân lên Trong đó, -49- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu mẫu số 11 (CG4-D2) có số băng ADN đợc nhân nhiều băng mẫu số (CG3-D1) có băng đợc nhân mồi S208 có băng đa hình băng đơn hình đợc nhân lên Mẫu số (CG3-D8) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 1700 bp TT Bảng 9: Các băng ADN đợc nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi S208 Thứ tự dòng Tæng 0 1 0 2 1 0 3 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 10 0 1 11 1 1 1 12 0 1 13 0 1 14 0 0 0 (Số đoạn ADN đợc nhân, Số đoạn ADN không đợc nhân) Bảng 10: Thống kê mồi xuất băng đa hình TT Tªn måi OPA12 S202 OPA15 S201 OPM12 OPM9 OPA18 BIO12 S208 10 OPM18 Số mồi đa hình 10 Đơn hình 0 0 0 Đa hình 11 46 Băng cá biệt 1 0 KÕt qu¶ phân tích PCR_RAPD 14 dòng ngô với tổng 20 måi thuéc nhãm OPA, OPM, BIO vµ nhãm S cho thấy có 10 mồi cho băng đa hình rõ -50- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu c¸c måi: OPA12, S202, OPA15, S201, OPM12, OPM9, OPA18, BIO12, S208 OPM18 (bảng 10) Thống kê kết phân tích tính đa hình kỹ thuật PCR_RAPD với 10 måi chØ ë b¶ng 11 B¶ng 11: KÕt qu¶ PCR-RAPD dòng ngô với 10 mồi cho băng đa hình T T Tên dòng CG3-D1 CG4-D1 CG3-D2 CG3-D3 CG3-D4 CG3-D5 CG3-D6 CG3-D7 CG3-D8 10 CG3-D9 11 CG4-D2 12 CG3-D10 13 CG3-D11 14 CG3-D12 Tổng Số băng ADN thu đợc trªn tõng måi OPA12 S202 OPA15 S201 OPM12 7 8 7 93 0 0 3 11 5 5 7 2 63 2 2 2 2 2 2 2 28 2 3 2 2 22 OPM9 OPA18 BIO12 S208 0 1 0 2 1 10 7 6 80 2 3 34 4 3 52 OPM18 Tæng 1 0 4 34 25 38 19 25 35 32 31 31 27 39 33 33 32 27 427 C¸c số liệu thu đợc bảng 11 cho thấy: Với 140 phản ứng PCR nhân lên đợc tổng số 427 băng thuộc 56 loại băng có kích cỡ khác Trong đó, có 51 băng cho đa hình chiếm 91,07%, băng đơn hình chiếm 8,93% Kích thớc băng có chiều dài nhỏ khoảng 200 bp băng có kích thớc lớn khoảng 4000bp Xuất băng cá biệt có băng xuất mẫu băng khuyết mẫu xuất 13 dòng lại Mồi OPA12 nhân lên đợc tổng số băng nhiều 93 băng mẫu số (CG3-D2) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 400 bp, 1600 bp băng vắng mặt (duy nhất) vị trí 1000 bp, 1100 bp, 1400 bp vµ 1500 bp; -51- Khãa ln tèt nghiƯp Bïi Văn Hiệu Mồi OPM18 nhân lên đợc 80 băng; Mồi OPA15 nhân lên đợc 63 băng mẫu CG3-D12 xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 2100 bp; Mồi S208 nhân lên đợc 52 băng mẫu CG3-D8 xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 1700 bp; Mồi BIO12, OPM18 nhân lên đợc 34 băng; Mồi S201 nhân lên đợc 28 băng; Mồi OPM12 nhân lên đợc 22 băng mẫu số (CG3D4) xuất băng cá biệt kích thớc khoảng 700 bp; Mồi S202 nhân lên đợc 11 băng; Mồi OPM9 nhân lên đợc 10 băng Số băng nhân lên trung bình cho 10 mồi 42,7 băng/mồi 4.5.3 Mối quan hệ dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ dựa phân tích RAPD Số liệu thu đợc từ 10 mồi RAPD đợc thống kê phân tích phần mềm NTSYSpc 2.02, từ thiết lập đợc bảng hệ số tơng đồng di truyền (bảng 12) sơ đồ hình quan hệ di truyền 14 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ (hình 13) Bảng 12: Hệ số tơng đồng di truyền dòng ngô kháng thuốc diệt cá 10 11 12 13 14 1.00 0.57 0.41 0.51 0.57 0.54 0.69 0.64 0.57 0.52 0.56 0.52 0.50 0.57 1.00 0.42 0.53 0.62 0.66 0.60 0.60 0.47 0.63 0.65 0.65 0.59 0.51 1.00 0.51 0.42 0.41 0.47 0.51 0.35 0.41 0.48 0.48 0.50 0.48 1.00 0.50 0.72 0.64 0.64 0.48 0.42 0.52 0.41 0.54 0.52 1.00 0.55 0.69 0.65 0.63 0.72 0.65 0.58 0.67 0.63 U U 1.00 0.70 0.57 0.43 0.47 0.54 0.51 0.56 0.55 1.00 0.77 0.56 0.55 0.56 0.56 0.61 0.61 U -52- U 10 11 12 13 14 1.00 0.56 0.59 0.60 0.48 0.57 0.61 1.00 0.57 0.50 0.39 0.43 0.50 1.00 0.63 0.71 0.65 0.60 1.00 0.60 1.00 0.58 0.75 1.00 0.57 0.66 0.68 1.00 Khãa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Hình 13 Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền 14 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ Qua bảng 12 hình 13 cho thấy hệ số tơng đồng di truyền 14 dòng ngô kháng thuốc diệt cỏ cặp dao động từ 0,35 đến 0,77 Hai dòng số (CG3-D6) số (CG3-D7) có hệ số tơng đồng di truyền cao 0,77 Dòng số (CG4-D1) vµ sè 11 (CG4-D2) cã cïng nguån gèc tõ dòng CG4 có hệ số tơng đồng cao 0,65 (phù hợp với nghiên cứu đánh giá hình thái) Dòng số (CG3-D2) có nguồn gốc từ nguồn vật liệu CG3 dòng số 11 (CG4-D1) có nguồn gốc từ CG4 có hệ số tơng đồng thấp 0,35 Hệ số tơng đồng di truyền cặp dòng dao động từ 0,35 đến 0,77 chứng tỏ dòng ngô tạo từ nguồn vật liệu ban đầu đa dạng phong phú Qua kÕt qu¶ sư lý sè liƯu cho thÊy ë mức tơng đồng 55% chia 14 dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ thành nhóm u lai: Nhãm gåm dßng: dßng sè (CG3-D1), sè (CG3-D3), số (CG3D5), số 7(CG3-D6) dòng số (CG3-D7) đợc chia làm nhóm phụ: Nhóm 1.1: gồm dòng số 1, số số Cả dòng có nguồn gốc từ nguồn vật liệu ban đầu CG3 Hệ số tơng đồng cặp dòng nhóm -53- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu cao dao động từ 0,64-0,77 Trong hai dòng số số có hệ số tơng đồng di truyền cao 0,77 Nhóm 1.2 gồm có dòng số dòng số có nguồn gốc từ nguồn vật liệu ban đầu CG3 có hệ số tơng đồng cao 0,72 Nhãm gåm dßng: dßng sè (CG4-D1), sè 11 (CG4-D2), sè (CG3D4), sè 10 (CG3-D9), sè 12 (CG3-D10), số 13 (CG3-D11) dòng số 14 (CG3D12) dòng số dòng số 11 có nguồn gốc từ CG4, dòng lại có nguồn gốc từ CG3, đợc chia làm nhóm phụ: Nhóm 2.1: gồm có dòng số dòng số 11 có hệ số tơng đồng cao 0,65 Nhóm 2.2: gồm có dòng số dòng số 10 có hệ số tơng đồng cao 0,72 Nhãm 2.3: gåm cã dßng sè 12 , dßng số 13 số 14 có hệ số tơng đồng cặp cao dao động từ 0,66-0,75 Nhóm 3: chØ cã nhÊt dßng sè (CG3-D8) cã hƯ số tơng đồng với dòng lại dao động từ 0,35-0,63, hệ số tơng đồng thấp 0,35 dòng số dòng số Nhãm 4: chØ cã nhÊt dßng sè (CG3-D2) có hệ số tơng đồng với dòng lại thấp dao động từ 0,35-0,51 Nh vậy, sở phân tích đa dang di truyền mức độ phân tử ADN kỹ thuật PCR_RAPD kết hợp với phân tích hình thái cho thấy khác đặc điểm hình thái v khác biệt di truyền dòng ngô Các dòng có nguồn gèc th−êng cã quan hƯ gÇn gịi víi vμ nhóm Những dòng có hệ số tơng đồng di truyền thấp dòng có nguồn gốc khác Dựa kết phân tích đa dạng di truyền hình thái phân tử để thiết kế sơ đồ lai backcross nhằm tạo đợc dòng ngô u việt mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc trừ cỏ -54- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Phần V Kết Luận V Kiến Nghị 5.1 Kết luận Đà tách chiết đợc 180 mẫu ADN 180 dòng ngô Đà xác định đợc có mặt promoter 35S có kích thớc 195bp 14/180 dòng ngô hệ thứ đợc tạo cách tù thơ c−ìng bøc tõ ngn vËt liƯu CG3 (mang gen kháng thuốc trừ cỏ) CG4 (mang gen kháng sâu kháng thuốc trừ cỏ) Đà xác định đợc có mặt gen PAT (đoạn trình tự đặc trng có độ dài 231 bp) dòng ngô Đà đánh giá đợc số đặc điểm hình thái, tiêu nông sinh học đa dạng di truyền mức phân tử kĩ thuật PCR-RAPD 14 dòng ngô nghiên cứu phục vụ cho công tác backcross tạo dòng ngô u việt mang gen gen kháng thuốc trừ cỏ 5.1 Kiến nghị Trong vơ tiÕp theo: – TiÕp tơc kiĨm tra sù cã mặt gen kháng thuốc trừ cỏ khác dòng ngô phát có promoter 35S (nhng gen PAT) Kiểm tra khả kháng thuốc trừ cỏ dòng ngô mang gen PAT phơng pháp phun thuốc trừ cỏ nhóm glufosinate đồng ruộng Giữ nguồn vật liệu dòng thuần, tiếp tục nghiên cứu tạo dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ công tác backcross (lai ngợc) để chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ sang dòng ngô u việt nhằm tạo dòng dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ có đặc điểm nông sinh học tốt, phục vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc trừ cỏ -55- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu VI Ti Liệu THAM Khảo 6.1 Tài liệu tiếng Việt Bùi Mạnh Cờng (2007) Công nghệ sinh học chọn tạo giống Ngô NXB Nông nghiệp Bùi Mạnh Cờng, Trần Hồng Uy, P W J Taylor, R Ford, Nguyễn Thị Thanh, Lê Quý Kha (2000) Nghiên cứu đa dạng di truyền số dòng ngô đờng phơng pháp RAPD marker Tạp chÝ Di trun häc vµ øng dơng, sè 1/2000, tr 16-22 Nguyễn Thuý Điệp (2003) Xét nghiệm ADN trồng sản phẩm biến đổi gen Luận văn thạc sĩ Công nghệ Sinh học Phan Xuân Hào, Bùi Mạnh Cờng, Nguyễn văn trờng, Đào Bích Thảo Phân tích đa dạng di truyền dòng mối quan hệ hệ số di truyền với suất tổ hợp lai ngô đợc thể thông qua thị SSR Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, số 6/2005, tr 22-25 Thạch Mai Hoàng (2000) Tác động trồng biến đổi gen tới môi trờng Tạp chí Sinh học ngày nay, số 28, tr 17-19 Nguyễn Thị Lang (2002) Phơng pháp nghiên cứu công nghệ sinh học NXB Nông nghiệp Phạm Bình Quyền, Nguyễn Nghĩa Thìn (1999) Đa dạng sinh học NXB ĐH Quốc gia HN Khuất Hữu Thanh (2006) Kỹ thuật gen: nguyên lý ứng dụng NXB KHKT Nguyễn Quang Thạch (2005) Giáo trình CNSH Nông nghiệp NXB Nông nghiệp -56- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu 10 Ngô Hữu Tình, Trần Hồng Uy, Bùi Mạnh Cờng, Võ Đình Long, Lê Quý Kha, Nguyễn Thế Hùng (1997) Cây ngô, nguồn gốc, đa dạng di truyền trình phát triển NXB Nông nghiệp 11 Khuất Hữu Trung cs (2007) Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lan Kiếm mức độ phân tử kỹ thuật PCR_RAPD Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, số 14/2007, tr 26-30 12 Trung tâm Thông tin t liệu khoa học công nghệ Quốc gia Cây trồng biến đổi gen - Tình hình nghiên cứu ứng dụng quan điểm phát triển Số 4/2003 6.2 Tài liệu tiếng Anh 13 Arne Holst-Jensen (2001) GMO detection methods and vatidation National Veterinary Institute, Section of Food & Feed Microbiology, Ullevaalsveien 68, P.O.Box 8156 Dep 0033 Oslo, Norway 14 Bertheau Y., Diolez A., Kobilinsky A., Magin K (2002) Detection methods and performance criteria for gennetically modified organisms J AOAC Int 2002 May-Jun, 85 (3), pp 801-808 15 Brodmann P D., Ilg EC, Berthoud H., Herrmann A (2002) Real-Time quantitative polymerase chain reaction methods for four genetically modified maize varieties and maize DNA content in food J AOAC Int 2002 May-Jun, 85 (3), pp 646-653 16 Devos K M., and Gale M D (1992) - The use of Random Amplified Polymorphic DNA markers in Wheat Theor Appl Genet 84, pp 567572 17 Hsu Y L., Lih C., Daniel Y C S (2000) Detection of genetically modifiedsoybeans and maize by the polymerase chain reaction method Journal of Food and Drug Analysis, (3), pp 200-207 18 Huebner P., Studer E., Luethy J (1999) Quantitation of genetically modified organisms in food Nature Biotechnol, 17, pp 1137-1138 -57- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu 19 Jaroslava Ovesna, Lenka Dùdicovà, Jiri Horácek, Eva Sadilová, Ladislav Kucera, Ludmila MÐskov¸ (2002) Comparison of different PCR-based protocols for detection of Roundup Ready soybean Czech J.Genet.Plant Breed, 38(1)/2002, pp 55-63 20 Javed Akhter Mohammed Qutub, Norman Burnham, Mohammed Akhtar (2001) Genetically modified foods :health and safety issues Annals of Saudi Medicine, 21 (3-4), pp 161-164 21 Keatley K L., (2000) Controversy over genetically modified organisms: the governing laws and regulation Qual Assur 2000 Jan-Mar, 8(1), pp 33-36 22 Love J., M Knight A M., Mcaleer M A., and Todd J A (1990) Towards construction of a high resolution map of the mouse genome using PCRanalyzed microsatellite Nucl Acid Res 18 (14), pp 4123 – 4130 23 Markus L., Anke B., Fabrice E., Lothar K., Heinz S., Guy V., D., E., (2000) Validation of a method based on Polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs Eur Food Res Technol 2001, 212, pp 497-504 24 Martens (2000) Safety evaluation of genetically modified foods Int Arch Environ Health 2000, 73 (Suppl), pp 14-18 25 Matsuoka T., H Kunbara, H Akiyama, H Miura, Y Goda, Y Kusakabe, K Isshiki, M Toyoda, A Hino (2001) A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize J Food Hyg Soc Japan, 42, pp 24-32 26 McCough S., R Chen X., Panaud O., Ternykh S., Xu Y., Cho Y., G Huang N., Ishii T., and Blair M (1997) Microsatellite markers development mapping and application in rice genetics and breeding, Plant Mol Biol 35, pp 89 99 -58- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu 27 Melody, M Aguiba (2003) Congress bills press for labeling of GM products Manila Bulletin, 8-Mar-2003 28 Meyer R, F Chardonnens, P Hubner, J Luthy (1996) Polymerase chain reaction (PCR) in the quality and safety assurance of food: detection of soya in processed meat products Z Lebensm Unters Forsch , 203, pp 339-344 29 Mitten D H., MacDonald R, Klonus D (1999) Regulation of foods derived from genetically engineered crops Curr Opin Biotechnol, 10, pp 298-302 30 Morgante M., and Olivieri A M (1993) PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics Plant J.1, pp 175 – 182 31 Moseley B E., (1999) The safety and social acceptance of novel foods Int J Food Microbiol 1999, 50, pp 25-31 32 Nobuaki S., Keiko M., Sachiko O., Wataru H., Makoto K., Shigeru U., and Kousaku M (1998) Safety assessment of genetically engineered food: Detection and monitoring of Glyphosate-tolerant Soybeans Biosci Biotechnol Biochem 1998, 62(7), pp 1461-1464 33 Obara-Okeyo P & S Kako, 1998 Genetic diversity and identification of cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers Euphytica 99, pp 95-1001 34 Ramon D (2000) Genetically modified foods: a case of information or misinformation Int Microbiol 2000, 3, pp 1-2 35 Stewart C., Richards H., and Halthill M (2000) Transgenic plants and biosafety: science, misconceptions and public perceptions Biotechniques, 29/2000, pp 832-843 36 Studer E., C Rhyner, J Luthy, P Hubner (1998) Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybeans and maize Z Lebensm Unters Forsch , 207(A), pp 207-213 -59- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu 37 Vos P., Hoggers R., Becker M., rejain M., Lee T., Hornes M., Friejtera P.J., Peleman J., Kuiper M and Zabeau M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting Nucl Acid Res 23, pp 4407 – 4414 6.3 Website 38 http://www.agbiotech.com.vn/ T T 39 http://www.cast-science.org/ 40 http:// www.gmo.gov.vn 41 http://www.isaaa.org 42 http://www.ncst.ac.vn/index.asp 43 http://www.sciencedirect.com 44 http:// www.sinhhocvietnam.com 45 http://www.vast.ac.vn/ H H 46 http://www.worldwatch.org/pubs/vs/2002/economy.html -60- ... giống ngô lai kháng thuốc di? ??t cỏ Việt Nam Chúng đà thực đề tài Nghiên cứu, xác định ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ kĩ thuật PCR đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ. .. (Phosphinothricin-N-Acetyltransferase) gen kháng thuốc trừ cỏ glufosinate cã ng« chun gen b»ng kü tht PCR Đánh giá đặc điểm hình thái, tiêu nông sinh học đa dạng di truyền mức phân tử kĩ thuật PCR- RAPD số dòng ngô mang gen kháng. .. Những vấn đề liên quan đến trồng kháng thuốc trừ cỏ số dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ 2.4.1 Một số vấn đề liên quan đến trồng kháng thuốc trừ cỏ -18- Khóa luận tốt nghiệp Bùi Văn Hiệu Khi