đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn của việt nam bằng chỉ thị SSR

Hiện nay, hạn hán là nguyên nhân cản trở rất lớn cho việc phát triển bền vững nền nông nghiệp của nước ta, vì vậy việc nghiên cứu, đánh giá các nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở th

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các thày giáo, cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học sư phạm Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân trọng nhất đến TS Khuất Hữu Trung,

Phó trưởng Bộ môn Kĩ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị, các bạn đang làm việc tại Bộ môn

Kĩ thuật di truyền, viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ tôi trong việc thu thập, tìm tài liệu, tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu, và cho tôi những lời khuyên quý giá để luận văn có thể hoàn thiện hơn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị em trong gia đình, bạn

bè đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên về cả vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể toàn tâm, toàn ý cho công việc

Xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 05 tháng 11 năm 2012

Học viên

Nguyễn Thị Thảo

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA: Axit abcisic

ADN: Acid deoxyribonucleic

AFLP: Amplified fragment length polymorphism

ARN: Acid ribonucleic

CTAB: Cetyl trimetyl amonium bromit

dNTP: Dideoxyribo nucleozit triphosphat

EtBr: Ethidium Bromide

EDTA: Etylen diamine tetra acetic acid

FAO: The World Food Organization

HSPs: Heat shock protein

IRRI: International Research Rice Institute

LEA: Late embryogenesis abundant protein

NTSYS: Numerial taxonomy system

PCR: Polymerase chain reaction

PIC: Polymorphic Information Content

QTL: Quantitative trait loci

RAPD: Random amplyfied polymorphic DNA

RE: Restriction enzyme

RFLP: Restriction fragment length polymorphism SDS: Sodium dodecyl sunphate

SSR: Simple sequence repeats

STS : Sequence Tagged Site

TAE: Tris-acetat-acid EDTA

TE: Tris EDTA

WUE: Water use efficiency

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa 3

1.2 Khái niệm về hạn và phân loại hạn 5

1.2.1 Khái niệm về hạn 5

1.2.2 Phân loại hạn 6

1.3 Ảnh hưởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp 7

1.3.1 Ảnh hưởng của hạn đến thực vật 7

1.3.2 Tác động của hạn đến sản xuất nông nghiệp 8

1.4 Đặc tính chịu hạn và nghiên cứu tính chịu hạn ở cây lúa 10

1.4.1 Đặc điểm hình thái và sinh lí lúa chịu hạn 10

1.4.2 Cơ sở sinh lí, hóa sinh của tính chịu hạn 11

1.4.3 Cơ sở phân tử của tính chịu hạn 12

1.4.4 Thể hiện của gen điều khiển tính chống chịu khô hạn 14

1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa 18

1.5.1 Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền 18

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 19

1.5.3 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa 21

1.6 Chọn tạo giống lúa chịu hạn 24

1.6.1 Chọn tạo lúa chịu hạn trên thế giới 24

1.6.2 Chọn tạo giống lúa chống chịu hạn ở Việt Nam 27

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu 30

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.1.2 Hóa chất 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch 35

2.2.2 Nhân ADN bằng kỹ thuật SSR- PCR 36

2.2.3 Kiểm tra kết quả PCR trên gel Agarrose 3,0% 37

2.2.4 Phân tích và xử lí số liệu 38

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 39

3.2 Kết quả phân tích đa hình tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn bằng chỉ thị phân tử SSR 40

3.2.1 Kết quả phân tích với một số mồi điển hình 40

3.2.2 Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi 43

3.2.3 Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 40 giống lúa nghiên cứu 45

3.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của tập đoàn lúa chịu hạn nghiên cứu 47

3.4 Kết quả xác định các allele hiếm, allele đặc trưng nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu 52

3.4.1 Kết quả xác định các allele hiếm, nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu 52

3.4.2 Kết quả xác định các allele đặc trưng nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu 53

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể, kiểu gen và

phân bố địa lý 4 Bảng 1.2 Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa 5 Bảng 2.1 Danh sách, số đăng kí (SĐK) trong ngân hàng gen và kí hiệu các

giống lúa nghiên cứu 30 Bảng 2.2 Danh sách 50 mồi SSR 33 Bảng 3.1 Số allele thể hiện và hệ số PIC của 23 cặp mồi SSR 44 Bảng 3.2 Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền sử dụng ch thị SSR trên

cây lúa đã được công bố 45 Bảng 3.3 Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa

nghiên cứu 46 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu 49 Bảng 3.5 Hệ số tương đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu (tiếp) 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ minh hoạ cơ chế phân tử quá trình tham gia đáp ứng điều

kiện hạn của các gen ở thực vật 13 Hình 1.2 Vị trí của protein hạn hán trên các nhiễm sắc thể ở cây lúa 16Hình 3.1 ADN tổng số của 40 giống lúa nghiên cứu 39 Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM566 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 40 Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3515 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 40 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM5599 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 41 Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM1364 (M: 100bp DNA Ladder) 41 Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3431 (M: 100bp DNA Ladder) 42 Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3534 (M: 100bp DNA Ladder) 42 Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM7003 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 42 Hình 3.9 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM25271 (M: 100bp DNA Ladder) 43 Hình 3.10 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM25319 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 43Hình 3.11 Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 40 giống lúa địa

phương chịu hạn 48Hình 3.12 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3467 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 52 Hình 3.13 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM5811 (M: 100bp DNA Ladder) 53

Hình 3.14 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM1155 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 54 Hình 3.15 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3476 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 54 Hình 3.16 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM3468 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 55 Hình 3.17 Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi

RM6051 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 55

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cây lúa (Oryza sativa L.) là loại cây lương thực có từ rất lâu trên thế giới

Trải qua hàng ngàn năm, đến nay cây lúa đã trở thành nguồn lương thực chính của

½ dân số trên địa cầu Nó cung cấp 20% tổng năng lượng hấp thụ hàng ngày của nhân loại Ở hầu hết các nước nông nghiệp, ngành sản xuất lúa gạo đem lại giá trị kinh tế cao và cung cấp việc làm cho hàng triệu lao động

Việt Nam là một trong những trung tâm phát sinh cây lúa và có tài nguyên di truyền cây lúa vào loại phong phú nhất trên thế giới Nghề trồng lúa trở thành nghề truyền thống, quan trọng hàng đầu trong nền nông nghiệp của nước ta Trung bình hàng năm, lúa gạo chiếm trên 60% tổng sản lượng lương thực và được gieo trồng trên 3,96 triệu ha

Tuy nhiên, do điều kiện địa hình nhiều đồi núi, đồng bằng sát biển hoặc do hậu quả của biến đổi khí hậu, 50% diện tích lúa đang được canh tác trong điều kiện môi trường rất bấp bênh, dễ bị tác động bởi các yếu tố ngoại cảnh bất lợi như hạn, mặn, lạnh Trong đó, khô hạn là một trong những vấn nạn làm cho năng suất bị giảm mạnh, sản phẩm nông nghiệp không ổn định Hậu quả của biến đổi khí hậu toàn cầu làm cho hạn hán xảy ra thường xuyên trên diện rộng và đã vượt tầm kiểm soát của con người Vấn đề hạn hán càng trở nên bức xúc khi hầu hết diện tích đất canh tác bị hạn nặng lại tập trung ở vùng sâu, vùng xa, vùng nông thôn nghèo, nơi

mà cuộc sống người dân chủ yếu dựa vào sản phẩm nông nghiệp

Hiện nay, hạn hán là nguyên nhân cản trở rất lớn cho việc phát triển bền vững nền nông nghiệp của nước ta, vì vậy việc nghiên cứu, đánh giá các nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật nói chung và ở cây lúa nói riêng để nâng cao khả năng chịu hạn, ổn định năng suất ở cây trồng trở thành vấn đề thời sự mang tính

cấp bách và cần thiết Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng

di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR”

nhằm tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen lúa chịu hạn bản địa Việt Nam phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu hạn

Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chịu hạn có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chịu hạn ở mức phân tử

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua các ch thị phân tử góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao, có khả năng chịu hạn, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng khô hạn và cơ cấu sản xuất lúa vùng khô hạn ở Việt Nam

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là cứu là tập đoàn 39 giống lúa có đặc tính chịu hạn được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ, bảo tồn tại ngân hàng gen Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long và 01 giống lúa tham khảo (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu, đánh giá nguồn gen lúa ở mức phân tử bằng ch thị SSR; Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di Truyền

Nông nghiệp

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa

Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Graminae), tộc Oryzae, chi Oryza, có tổng số nhiễm sắc thể 2n = 24 Oryza có khoảng 20 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

ẩm của Châu Phi, Nam và Đông Nam Châu Á, Nam Trung Quốc, Nam và Trung

Mỹ và một phần ở Châu Úc Trong đó, ch có 2 loài là lúa trồng, còn lại là lúa hoang hằng niên và đa niên Loài lúa trồng quan trọng nhất, thích nghi rộng rãi và

chiếm đại bộ phận diện tích lúa thế giới là Oryza sativa L Loài này hầu như có mặt

ở khắp nơi từ đầm lầy đến sườn núi, từ vùng xích đạo, nhiệt đới đến ôn đới, từ khắp vùng phù xa nước ngọt đến vùng đất cát sỏi ven biển nhiễm mặn, phèn… Một loài

lúa trồng khác là Oryza glaberrima Steud, ch được trồng giới hạn ở một số quốc gia Tây Châu Phi và hiện đang bị thay thế dần bởi Oryza sativa L [13]

Tateoka (1963) (trong Oka, 1988) lại phân biệt 22 loài, trong đó, cũng thống

nhất 2 loài lúa trồng O sativa L và O glaberrima Steud Tateoka xem dạng lúa Châu Phi (O perennis Moench) như là một loài riêng O barthii A Chev., và dạng lúa Châu Á và Châu Mỹ thuộc về loài O rufipogon Griff Tateoka cũng bổ sung 2 loài mới: O longiglumis Jansen và O angustifolia Hubbard (Bảng 1.1) [47]

Năm 1928 - 1930, các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã phân loại lúa trồng thành

2 nhóm “Indica” và “Japonica” dựa trên cơ sở phân bố địa lý, hình thái cây và hạt,

độ bất dục khi lai tạo và phản ứng huyết thanh (Serological reaction) Các nhà

nghiên cứu Nhật Bản sau đó đã thêm một nhóm thứ 3 “Javanica” để đặt tên cho

giống lúa cổ truyền của Indonesia là “bulu” và “gundil” Tên gọi của 3 nhóm thể hiện nguồn gốc xuất phát của các giống lúa từ 3 vùng địa lý khác nhau Từ

“Janvanica” có gốc từ chữ Java là tên của một đảo của Indonesia Từ “Japonica” có

lẽ xuất xứ từ chữ Japan là tên nước Nhật Bản Còn “Indica” có lẽ có nguồn gốc từ

India (Ấn Độ) (Bảng 1.2) [5]

Bảng 1.1 Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể,

kiểu gen và phân bố địa lý [47]

Nhóm Oryzae

Nhóm Angustifoliae

Nhóm Coarctatae

Nguồn: Oka, 1988 [39]

Bảng 1.2 Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa

Lá -Lá rộng, xanh nhạt -Lá rộng, cứng, xanh nhạt Lá hẹp, xanh đậm Hạt -Hạt thon dài, dẹp

-Hạt hầu như không

có đuôi dài -Trấu có lông dài -Ít rụng hạt

-Hạt tròn, ngắn -Hạt không đuôi tới có đuôi dài -Trấu có lông dài

và dầy -Ít rụng hạt Sinh học -Tính quang cảm rất

thay đổi

-Tính quang cảm rất yếu -Tính quang cảm

rất thay đổi

Nguồn: Chang, 1985 [22]

Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên thế giới

và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diện tích hơn 1 triệu ha, trong đó có tới 13 nước thuộc Châu Á Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi nước đều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước

Mĩ La tinh Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam, nhưng sản lượng lúa lại thấp hơn Việt Nam từ 2-3 lần

1.2 Khái niệm về hạn và phân loại hạn

1.2.1 Khái niệm về hạn

Bất cứ một cây trồng nào cũng cần có nước để duy trì sự sống Mức độ cần nhiều hay ít phụ thuộc vào từng loại cây trồng và từng giai đoạn phát triển của chúng Hạn đối với thực vật là khái niệm ch sự thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức độ khác nhau: chết, chậm phát triển hay phát triển bình thường Những

cây trồng phát triển bình thường trong điều kiện khô hạn gọi là “cây chịu hạn” và

khả năng có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là “tính chịu hạn” [9]

Tuy nhiên, khó có thể xác định được thế nào là trạng thái hạn đặc trưng vì mức độ khô hạn do môi trường gây nên khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng vùng địa lý và không thể dự đoán trước được Mức độ khô hạn do môi trường gây nên ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây, nhẹ thì giảm năng suất, nặng thì

có thể dẫn đến tình trạng hủy hoại cây, mùa màng [43]…

Dưới tác động các yếu tố gây hạn của môi trường như thành phần thổ nhưỡng, thời tiết, khí hậu, nhiệt độ cao, gió nóng… đã gây nên hiện tượng thiếu nước của cây, mà nguyên nhân chính là do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa cây

và môi trường, dẫn đến sự thiếu hụt nước trong tế bào Trong trường hợp này, tác động của môi trường bên ngoài rất lớn gây ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triển của cây Thông thường, hạn được phân biệt thành 3 loại là hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện [6]

1.2.2 Phân loại hạn

1.2.2.1 Hạn không khí

Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (39 - 420C) và độ ẩm thấp (< 65%) Hiện tượng này thường gặp ở những t nh miền Trung nước ta vào những đợt gió Lào và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu, đầu đông Hiện tượng này còn xuất hiện ở một số nước trên thế giới như gió Chamsin ở Israel; gió Mistral ở miền nam nước Pháp… đã làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến một số loài cây trồng như phong lan, cam, chanh, đậu tương [42]

Hạn không ch ảnh hưởng trực tiếp lên các bộ phận của cây như hoa, lá, chồi non,… mà còn ảnh hưởng đến quá trình tung phấn của cây Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời

vì nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, làm cho mức độ thoát hơi nước nhanh vượt qua mức độ bình thường, lúc đó rễ hút nước không đủ bù lại lượng nước mất, cây lâm vào tình trạng mất cân bằng về nước Nước cũng là sản phẩm khởi đầu, trung gian và giai đoạn cuối cùng của quá trình chuyển hóa hóa sinh, là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra [50] Vì vây, việc cung cấp đủ nước cho cây chính là một biện

pháp canh tác quan trọng Hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là một trong những mục tiêu của các nhà tạo chọn giống

Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì ảnh hưởng càng xấu đến quá trình sinh trưởng của cây Thiếu nước nhẹ thì giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng

sẽ dẫn đến biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, làm tăng quá trình già hóa tế bào Khi

bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào mô bị tổn thương và chết

1.2.2.2 Hạn đất

Mức độ khô hạn của đất tùy thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề mặt và khả năng giữ nước của đất Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến mức cây không thể lấy nước qua tế bào rễ, vì thế hạn đất có thể gây ra cho cây héo lâu dài Hạn đất tác động trực tiếp đến bộ phận rễ làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Đối với cây trồng cạn, hạn đất cũng ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn gieo hạt và nảy mầm Lượng nước trong đất không đủ làm co mầm và héo; nếu thiếu nước nặng sẽ gây thui chột mầm và chết

1.2.2.3 Hạn toàn diện

Hạn toàn diện là hiện tượng khi có cả hạn đất và hạn không khí xảy ra cùng một lúc Trong trường hợp này, cùng với sự mất nước do không khí làm cho hàm lượng nước trong lá giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên, mặc dù sức hút nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt không đủ cung cấp cho cây Hạn toàn diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn, cây không có khả năng phục hồi Ở nước ta, hạn toàn diện thường xảy ra ở các t nh miền Trung (Nghệ An, Hà Tĩnh,…) gây nên thiệt hại đáng kể cây trồng nói chung

và cây lúa nói riêng

1.3 Ảnh hưởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp

quá trình hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau như chết, chậm phát triển hay phát triển tương đối bình thường Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức

độ tổn thương do thiếu hụt nước gây nên gọi là tính chịu hạn [9]

Hạn dẫn đến một số biến đổi trong mô và tế bào như làm biến tính và kết tủa protein, làm tăng độ lỏng của lipit màng, mở xoắn các axit nucleic Hạn cũng phá hoại hệ thống quang hóa II trên màng thylacoid Ảnh hưởng của hạn trước hết là gây ra sự mất nước của tế bào và mô Thiếu nước nhẹ làm ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, thiếu nước nặng gây biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, già hóa tế bào, làm cho cây bị héo Cuối cùng hệ nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào

và mô bị tổn thương và chết Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng suất gieo trồng [16] Phản ứng của cây đối với hạn là sự đóng khí khổng, giảm tỷ lệ thoát hơi nước của mô, giảm quang hợp và làm tăng tích lũy axit abcisic (ABA), prolin, manitol, sorbitol, sự cấu thành nhóm ascobat, glutathione, α-tocopherol, và sự tổng hợp protein mới [54]

1.3.2 Tác động của hạn đến sản xuất nông nghiệp

Hạn hán là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng và làm cho sản lượng nông nghiệp toàn cầu không ổn định Hàng năm, các điều kiện bất lợi của môi trường làm giảm 50% năng suất mùa màng, trong đó tính riêng hạn hán chiếm tới 15% Thậm chí ở một số nơi có mực nước ngầm thấp, có năm hạn làm giảm 100% năng suất mùa màng [19]

Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên xảy ra ở các t nh miền Bắc Tình trạng hạn hán kéo dài từ cuối tháng 7/2009 đã ảnh hưởng nghiêm trọng vùng trồng ngô lớn nhất Trung Quốc và có nguy cơ thu hẹp 60% diện tích trồng trọt Đây là trận hạn hán nghiêm trọng nhất quốc gia này trong vòng 60 năm qua và tác động lên hầu hết các vùng sản xuất lúa mì trong lãnh thổ Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa Ngoài việc phá hủy vụ mùa lúa mì, hạn hán còn gây ra tình trạng thiếu nước cho ước tính khoảng 2,31 triệu người và 2,57 triệu gia súc Trong

8 t nh chịu tác động, 20% đất nông nghiệp và 35% tổng diện tích lúa mì đều bị ảnh hưởng Đến tháng 2 năm 2011, trận hạn hán ảnh hưởng lên diện tích 7,73 triệu hécta lúa mì vụ đông sắp được thu hoạch Theo FAO, thiệt hại vụ thu hoạch lúa mì của Trung Quốc có khả năng là một yếu tố đã làm tăng giá lúa mì trên toàn thế giới vào đầu năm 2011 [42]

Ấn Độ cũng đang phải đối mặt với đợt hạn hán nghiêm trọng nhất trong vòng

7 năm qua Hiện nay đã có hơn 1/3 số quận của Ấn Độ rơi vào tình trạng hạn hán Thiếu hụt lượng mưa cần thiết có thể khiến tăng trưởng kinh tế của quốc gia này giảm sút 1% trong năm 2006 Đợt hạn hán tồi tệ nhất trong lịch sử gần 20 năm qua tại Thái Lan vào năm 2002 đã đẩy quốc gia xuất khẩu gạo lớn nhất thế giới đối mặt với vụ mùa thất thu Và theo thông báo mới nhất của cơ quan ngăn ngừa và giảm thiểu thảm họa Thái Lan, 354 huyện thuộc 47 trên tổng số 77 t nh, thành của nước này nằm trong khu vực thảm họa hạn hán [42]

Ở Việt Nam, hạn hán xảy ra ngày càng kéo dài hơn trước và ảnh hưởng ngày càng trầm trọng hơn đối với sản xuất nông nghiệp Hạn hán năm 1962 ở Bắc bộ và Bắc Trung bộ đã phá huỷ 370.000ha hoa màu Trận hạn hán 1982 đã tàn phá 180.000ha cây màu ở đồng bằng sông Cửu Long Trong năm 1983, chúng ta đã mất 291.000ha trồng lúa do hạn hán Vụ Đông Xuân năm 1992 - 1993, sản lượng lúa của đồng bằng sông Cửu Long giảm 559.000 tấn Năm 1993 khoảng 175.000ha ở miền Trung bị hạn, trong đó 35.000ha bị chết hoàn toàn, mất khoảng 150.000 tấn lương thực Vụ hạn 1994 - 1995 ở Đăk Lắk được xem là nặng nề nhất trong 50 năm gần đây, đã làm giảm doanh thu từ cây cà phê khoảng 600 t đồng Trận hạn hán khác năm 1995 - 1996 ở Miền Bắc tàn phá hoa màu khoảng 13.380ha của vùng Trung Du và 100.000ha vùng đồng bằng sông Hồng Đặc biệt, hạn hán năm 1998 xảy trên toàn lãnh thổ Việt Nam với tổng diện tích bị hạn hán là 734.284ha, trong

đó 276.656ha ở đồng bằng sông Cửu Long Trận hạn hán này đã ảnh hưởng tới 3,8 triệu dân, gây thiệt hại khoảng 5.000 t đồng Các t nh từ Khánh Hoà đến Bình Thuận thường xuyên xảy ra hạn hán với tổng số diện tích hạn hán lên tới 300.000ha Tại Bình Thuận, năm 2004, hạn hán xảy ra trầm trọng khiến diện tích trồng trọt giảm 30 - 50% Đợt nắng nóng kéo dài cuối năm 2009 khiến ngành nông nghiệp các

t nh Đồng bằng sông Cửu Long bị thiệt hại hàng trăm t đồng T nh Kiên Giang có khoảng 13.400ha lúa bị ảnh hưởng, trong đó hơn 3.000ha bị mất trắng hoàn toàn, thiệt hại gần 80 t đồng Thiệt hại nặng nhất là huyện Gia Rai, ước tính ch riêng huyện này đã bị thiệt hại gần 50 t đồng [7]

Theo tính toán của Tổng cục Thủy lợi (CAO), thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (04/ 2010), nếu tình hình khô hạn, thiếu nước ngọt như hiện nay tiếp tục kéo dài sẽ ảnh hưởng tới năng suất của khoảng 26.000ha lúa đông xuân ở các vùng Trung du, đồng bằng Bắc bộ và khoảng 100.000ha ở Nam bộ Cũng theo Cục Thuỷ lợi, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, nắng nóng, khô hạn kéo dài tại các t nh Nam Trung bộ và Tây Nguyên đã làm hơn một triệu người thiếu nước sinh hoạt Sơ bộ, tổng thiệt hại do hạn hán tại 2 khu vực này đã lên tới 1.258 tỷ đồng

1.4 Đặc tính chịu hạn và nghiên cứu tính chịu hạn ở cây lúa

1.4.1 Đặc điểm hình thái và sinh lí lúa chịu hạn

Để nhận biết cây lúa kháng hạn hay khả năng chịu hạn của chúng cần nghiên cứu đặc điểm hình thái và hoạt động sinh lí của lúa chịu hạn để tạo ra các giống lúa chịu hạn đạt năng suất cao, mang lại hiệu quả kinh tế lớn và phù hợp với địa hình của nước ta, đặc biệt là trong bối cảnh biến đổi khí hậu hiện nay Các đặc điểm hình thái và sinh lí biểu hiện giống lúa có khả năng chịu hạn là:

Khi gặp điều kiện khô hạn, bộ lá ngừng sinh trưởng hoặc sinh trưởng chậm lại để hạn chế sự thoát hơi nước Đồng thời phiến lá mỏng hơn, nhiều lông hơn để hạn chế sự tích tụ nhiệt, hạn chế sự thoát hơi nước [62]

Một phản ứng thiết thực nhất ở lúa là đóng khí khổng khi gặp điều kiện hạn Điều này có tác dụng hạn chế sự thoát hơi nước và đồng thời cũng làm hạn chế khả năng quang hợp Vì vậy, đối với lúa chịu khô hạn, một đặc điểm thích nghi của nó là nâng cao hiệu suất quang hợp trước khi xảy ra hiện tượng đóng khí khổng [62]

Lá có xu hướng cuộn lại và giảm góc độ lá Điều này có tác dụng giảm cường độ bức xạ trên bề mặt lá, tăng cường ánh sáng đi xuống phía dưới và giúp duy trì trạng thái thoát hơi nước ở bề mặt lá ở mức tối thiểu [62]

Khi gặp điều kiện hạn, ABA được tăng cường tổng hợp ở rễ, sau đó vận chuyển lên lá, đẩy nhanh tốc độ già hóa của lá, đóng khí khổng làm giảm sự thoát hơi

nước Bên cạnh đó, ABA được tăng cường trên lá làm mức độ héo tăng lên giúp cây tránh bớt được bức xạ mặt trời, giảm sử dụng nước và tăng sử dụng bề mặt lá [8], [62]

Rễ mọc dài hơn, phân bố rộng và sâu hơn vào các lớp đất giúp cây lúa tận dụng nước dưới sâu Khi bắt đầu gặp điều kiện hạn ở giai đoạn cây con, khối lượng

rễ và tỷ lệ rễ/thân, sinh nhiều rễ đốt vì rễ đốt có khả năng đâm xuyên vào các lớp đất tốt hơn để tăng cường khả năng hút nước Đồng thời theo nghiên cứu của Muthukuda (2001) cho thấy: khi gặp hạn, tốc độ dài rễ lớn hơn tốc độ dài lá Nghiên cứu của Phạm Văn Cường (2009) ch ra rằng: ở các giống lúa chịu hạn CH5, 103S-R20 và Toitsu thì chiều dài rễ, số rễ/cây, trọng lượng khô của rễ/cây và tốc độ hút nước của rễ ở các giống chịu hạn cao hơn rất nhiều giống đối chứng khi

có nước trở lại [4], [8], [23], [62]

Khi gặp hạn, cây có phản ứng giảm chiều cao cây để hạn chế nhu cầu sử dụng nước, đồng thời hạn chế sự tác động của bức xạ mặt trời Phản ứng thấp cây cũng làm tăng khả năng chống đổ ở cây lúa [62]

Trổ bông muộn hơn cũng là một phản ứng của lúa chống chịu khô hạn Khi gặp hạn hán trong giai đoạn sinh trưởng dinh dưỡng, với những giống không nhạy cảm với quang chu kỳ có thể trổ bông muộn hơn lúa bình thường 3 đến 4 tuần Nhạy cảm nhất là khi cây lúa gặp hạn ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng còn giai đoạn sinh trưởng sinh thực thì ít mẫn cảm hơn [62]

Trong giai đoạn đẻ nhánh và trổ bông, nếu gặp hạn thì số nhánh và số bông sẽ giảm Tuy nhiên, ở lúa chịu hạn điều đó không ảnh hưởng nhiều đến năng suất do số bông/khóm ít được bù lại bởi sự gia tăng số hặt chắc/bông và sự gia tăng khối lượng hạt [62]

1.4.2 Cơ sở sinh lí, hóa sinh của tính chịu hạn

Khi môi trường khô hạn, thực vật chống lại sự mất nước và nhanh chóng bù lại phần nước đã mất nhờ hoạt động của bộ rễ và sự điều ch nh áp suất thẩm thấu của tế bào Sự thích nghi đặc biệt về cấu trúc hình thái của rễ và chồi nhằm giảm thiểu tối đa sự mất nước hoặc tự điều ch nh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua tích lũy của các chất hòa tan, các protein và axit amin, nhằm duy trì lượng nước tối thiểu trong tế bào Khả năng thu nhận nước chủ yếu phụ thuộc vào chức năng

của bộ rễ Bộ rễ có hình thái khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những vùng sâu Ngoài ra, cây có hệ mạch dẫn phát triển dẫn nước lên các cơ quan thoát hơi nước, hệ mô bì phát triển sẽ hạn chế sự thoát hơi nước của cây [1], [12]

Khả năng điều ch nh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của tế bào rễ cây đối với đất Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn trong đất Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên cứu đều cho rằng khi cây gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hàm lượng ABA, hàm lượng prolin, nồng độ ion K+, các loại đường, axit hữu cơ, giảm CO2, protein và các axit nucleic trên cây lúa Các chất trên có chức năng điều ch nh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng giữ và lấy nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ Ngoài ra còn có thể thay thế vị trí của nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương tác với protein và lipit màng, ngăn chặn sự phá hủy màng [17]

Nghiên cứu sự đa dạng và hoạt động của enzym trong điều kiện gây hạn đã được nhiều tác giả quan tâm Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu đặc tính hóa sinh của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, hạn đã nhận xét rằng áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần và hoạt độ proteaza, kìm hãm sự phân giải protein dự trữ Một số nghiên cứu trên các đối tượng như lạc, lúa, đậu xanh, đậu tương,… cho thấy mối tương quan thuận giữa hàm lượng đường tan và hoạt độ α-amylaza [6], [9] Đường tan là một trong những chất tham gia điều ch nh

áp suất thẩm thấu trong tế bào Sự tăng hoạt độ α-amylaza sẽ làm tăng hàm lượng đường tan do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng chịu hạn của cây trồng Một trong các chất liên quan đến thẩm thấu được chú ý là prolin Prolin là một amino axit có vai trò quan trọng trong sự điều hòa áp suất thẩm thấu trong tế bào Theo tác giả Chen và Muranta (2002), sức chống chịu của thực vật tăng lên khi được chuyển các gen mã hóa enzym tham gia vào con đường sinh tổng hợp prolin trong tế bào Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tích lũy prolin có thể tăng 10 đến 100 lần ở thực vật dưới tác động của áp suất thẩm thấu [24]

1.4.3 Cở sở phân tử của tính chịu hạn

Phản ứng của thực vật trước tác động của hạn rất đa dạng, phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có kiểu gen, độ dài và tính khốc liệt của điều kiện ngoại cảnh Biểu hiện của quá trình này là việc sinh tổng hợp của một loạt các chất trong tế bào, một số hoocmon hoặc chất kích thích để giúp cây có khả năng thích ứng Khi đi sâu vào nghiên cứu ở mức độ phân tử của hiện tượng nóng, hạn ở thực vật người ta đã có những bước tiếp cận khác nhau trên nhiều loài cây trồng ở các giai đoạn phát triển Được nghiên cứu nhiều nhất là các protein sản phẩm biểu hiện gen Các nhóm protein được đặc biệt quan tâm bao gồm: protein sốc nhiệt, môi giới phân tử, LEA [2]

Hình 1.1 Sơ đồ minh hoạ cơ chế phân tử quá trình tham gia đáp ứng

điều kiện hạn của các gen ở thực vật

- Protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSPs): HSPs có ở hầu hết các loài

thực vật như lúa mì, lúa mạch, lúa gạo, ngô, đậu nành, hành, tỏi, chúng chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này HSP được tổng hợp khi

tế bào gặp điều kiện cực đoan như: nóng, hạn, lạnh, phèn, mặn, Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn chặn hoặc sửa chữa sự phá hủy do stress nóng và mở rộng giá trị ngưỡng chống chịu nhiệt độ cao Trong các tế bào thực vật HSP tế bào chất tập chung thành các hạt sốc nhiệt (HSG - heat shock granules) Người ta cho rằng các HSP gắn kết trên các ARN polymeraza để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mARN trong quá trình bị stress nóng Sau sốc nóng các hạt này phân tán và liên kết dày đặc với các riboxom hoạt động sinh tổng hợp protein HSPs được chia thành 6 nhóm dựa trên cơ sở khối lượng phân tử khác nhau: 110, 90, 70, 60, 20, 8.5 kDa Trong đó nhóm HSP 60 và HSP 70 có nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (chaperonin) HSP 8,5 kDa (ubiquitin) có chức năng bảo vệ tế bào nhưng không phải chất môi giới phân tử Ubiquitin có hoạt tính proteaza với chức năng phân giải các protein không có hoạt tính enzym Ubiquitin ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ cao nên có vai trò tự sửa chữa khi tế bào gặp điều kiện cực đoan, đặc biệt là nhiệt độ cao [30]

- LEA (Late embryogenesis abundant protein - protein tích lũy với lượng lớn

ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi): LEA là protein có vai trò bảo vệ

thực vật bậc cao khi môi trường xảy ra stress, đặc biệt là hạn LEA là một trong nhóm gen liên quan đến sự mất nước của tế bào thực vật Protein LEA hạn chế sự mất nước do điều kiện ngoại cảnh bất lợi và đóng vai trò điều ch nh quá trình mất nước sinh lý khi hạt chín Trong tự nhiên, phôi sau khi hình thành trong giai đoạn chín thường được chuyển sang trạng thái ngủ, lượng nước trong phôi và trong hạt giảm đến mức tối thiểu Protein LEA được tạo ra hàng lọat trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi ABA, độ mất nước của tế bào và áp suất thẩm thấu trong tế bào Protein LEA có những đặc điểm chính sau: Giàu amino axit, ưa nước, không chứa cystein và tryptophan, có khả năng chịu nhiệt Protein LEA thực hiện các chức năng như cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính, điều ch nh áp suất thẩm thấu Nhiều gen LEA đã được nghiên cứu và phân lập trên các đối tượng cây

trồng khác nhau [27], [51]

1.4.4 Thể hiện của gen điều khiển tính chống chịu khô hạn

Bản đồ QTL (Quantitative Trait Loci) được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (tính chống chịu mặn, hạn, lạnh, ) Di truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác Hầu hết các nghiên cứu về marker phân tử đều quan tâm đến những thành phần rất đặc biệt trong sự kiện chống chịu khô hạn, đó là: Khả năng của rễ cây phát triển sâu xuống tầng đất bên dưới

Tính trạng phun râu và tung phấn với thời gian cách quãng được xác định (ASI = được viết tắt từ chữ anthesis to silking interval)

Sự điều tiết áp suất thẩm thấu (OA = được viết tắt từ chữ osmotic adjustment) Hiện tượng biến dưỡng ABA (abscisic acid)

Hiện tượng nông học WUE (water use efficiency - có nghĩa là hiệu quả sử dụng nước)

Số QTL được tìm thấy đối với tính trạng chống chịu khô hạn thường thay đổi

từ 1 đến 4 đối với một tính trạng thuộc thành phần trong sự kiện chống chịu hạn và những QTL này thường trải rộng trên toàn bộ genome với nhiều nhóm liên kết gen Thí dụ, tính trạng WUE được tìm thấy với rất ít QTL, từ 4 đến 5 trong genome cây đậu nành [35]

Hệ thống rễ phát triển tốt là một tính trạng vô cùng quan trọng giúp cây trồng chống chịu khô hạn (cơ chế thoát hạn = drought avoidance mechanism) Người ta

đã sử dụng quần thể đơn bội kép (DH) của cặp lai IR64 x Azucena tại Viện Lúa Quốc Tế (IRRI)

Sau đó Shen và cộng tác viên (1999) đã phát triển quần thể gần như đẳng gen của IR64 được du nhập với những QTL chủ lực Các tác giả đã ghi nhận bốn đoạn trên nhiễm sắc thể số 1, 2, 7, và 9 là nơi định vị các QTL chủ lực trong phân tích chọn lọc từng QTL mục tiêu [43]

Hình 1.2 Vị trí của protein hạn hán trên các nhiễm sắc thể ở cây lúa (Theo

Nguyễn Thị Lang và cộng sự, 2010)

Người ta thực hiện nhiều cặp lai giữa các cây BC3F2 mang những đoạn mục tiêu của vật liệu cho gen điều khiển rễ lúa phát triển tốt, để loại trừ ảnh hưởng di truyền theo kiểu “genetic drag” và ảnh hưởng các QTL mục tiêu khác nhau chồng lấp theo hình tháp [42]

Zhikang Li và cộng tác viên (IRRI) đã sử dụng 260 vật liệu (trong đó có OM1723 của Việt Nam) từ 15 quốc gia để thực hiện hồi giao với IR64 và Teqing

Họ thanh lọc tính chống chịu khô hạn của 215 quần thể BC1F1, và 4.677 dòng lai cận giao (Ils) để nghiên cứu sự biến thiên di truyền chưa được biết (CGV: cryptic genetic variation) của gen chống chịu khô hạn thông qua phân tích QTL [2]

Purwantomo và cộng tác viên (trích theo Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003) khai thác vai trò của các gen có tính chất “homeobox” để phát triển giống lúa chống chịu khô hạn Trong khi đó, nhóm nghiên cứu của CIRAD, Pháp, tập trung nghiên cứu đặc tính của rễ lúa thích nghi với sự phát triển (E Guiderdoni) Sự phát triển hệ thống rễ lúa tương thích với stress đã được nghiên cứu và so sánh với cây Arabidopsis thaliana Một array biểu thị clone có qui mô 22K đối với áp suất thẩm thấu và stress do mặn (SSH), một receptor đặc biệt và một oligo đóng vai trò

chuyển mã đã được xác định Họ phát hiện ra gen mục tiêu có liên quan đến rễ lúa trong điều kiện bị stress [2]

Giáo sư Ray Wu, ĐH Cornell, Mỹ, đã phát triển 3 dòng lúa chuyển gen: (1) gen tổng hợp proline p5cs, (2) gen choline oxidase COX, (3) dung hợp cả hai gen TPS và TPP trong tổng hợp trehalose Gorantla và cộng tác viên nghiên cứu phổ thể hiện các gen điều khiển tính chống chịu khô hạn với nhiều gen mục tiêu đã được phát hiện (trích theo Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003) [2]

Toojinda và cộng tác viên thực hiện bản đồ QTL điều khiển tính trạng chống chịu khô hạn tại Thái Lan, với các tính trạng mục tiêu: năng suất hạt, sinh khối, ch

số thu hoạch HI, số hạt chắc và lép, số hạt / bông, t lệ bất thụ, trọng lượng 1000 hạt, số bông, số chồi, chiều cao, số ngày từ gieo đến trỗ,v.v QTL định vị trên các nhiễm sắc thể 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9 đã được phân tích, trên cơ sở quần thể DH của tổ hợp lai IR62266 / CT9993 tại 3 địa điểm khác nhau trong 3 năm liên tục Đặc biệt chú ý nhiễm sắc thể số 3 và số 5, nó tập hợp nhiều QTL có liên quan đến tính chống chịu khô hạn (trích theo Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003) [2]

Hiện tượng nông học WUE trong cây lúa đã được Karaba và ctv (2007) nghiên cứu khá hệ thống với sự thể hiện của gen HRD chuyển nạp từ Arabidopsis Cây lúa chống hạn tiêu thụ nước ít biểu thị sự kiện sinh khối rễ tăng lên trong điều kiện có tưới trở lại Gen HDR với yếu tố chuyển mã AP2/ERF, được phân lập trong dòng đột biến của Arabidopsis (theo kiểu gắn thêm chức năng) hrd-D, điều khiển tính trạng sức mạnh của rễ, sự phân nhánh, tế bào biểu

bì, độ dầy của lá với tỷ lệ lục lạp tăng cao trong tế bào mesophyll, làm thúc đẩy hiện tượng đồng hóa quang hợp và hiệu suất quang hợp (trích theo Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2003) [2]

Đặc biệt, Wang và cộng tác viên (2007) đã so sánh sự thể hiện gen giữa giống lúa nước và giống lúa cạn trong điều kiện bị stress do khô hạn, sử dụng phương pháp cDNA microarray Giống lúa cạn IRAT109, Haogelao, Han 297 và giống lúa nước Zhongzuo 93, Yuefu, Nipponbare đã được sử dụng Sau khi đọc chuỗi trình tự ADN, có 64 unique ESTs thể hiện ở mức độ cao ở giống lúa cạn và 79 ở giống lúa nước Tác giả dự đoán sự thể hiện của các gen mục tiêu ở mức độ cao trong lúa cạn

có thể cải tiến được khả năng chống chịu stress do khô hạn trong lúa nước và những loài cây trồng có liên quan gần về huyết thống [51]

1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền trên cây lúa

1.5.1 Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học là sự khác nhau giữa các sinh vật sống ở tất cả mọi nơi, bao gồm các hệ sinh thái trên cạn, trong đại dương và các hệ sinh thái thủy vực khác, cũng như các phức hệ sinh thái mà các sinh vật là một thành phần [63]

Đa dạng loài về số lượng và sự đa dạng của các loài được tìm thấy tại một khu vực nhất định của một vùng nào đó Đa dạng loài là tất cả sự khác biệt trong một hay nhiều quần thể của một loài cũng như đối với quần thể của các loài khác nhau

Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Xét cho cùng, đa dạng

di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần axít nucleic, tạo thành mã di truyền [63]

Đa dạng di truyền là cơ sở cho việc tuyển chọn lai tạo những giống, loài mới;

đa dạng về loài thường là đối tượng khai thác phục vụ mục đích kinh tế; đa dạng về

hệ sinh thái có chức năng bảo vệ môi trường sống; đồng thời các hệ sinh thái được duy trì và bảo vệ chính là nhờ sự tồn tại của các quần thể loài sống trong đó Phần đa dạng sinh học do con người khai thác sử dụng gọi là đa dạng sinh học nông nghiệp Giá trị của đa dạng di truyền thể hiện ở ba mặt chính [25]:

Giá trị ổn định (Portfolio Value): Đa dạng di truyền tạo ra sự ổn định cho các

hệ thống nông nghiệp ở quy mô toàn cầu, quốc gia và địa phương Sự thiệt hại của một giống cây trồng cụ thể được bù đắp bằng năng suất của các giống hoặc cây trồng khác

Giá trị lựa chọn (Option Value): Đa dạng di truyền tạo ra bảo hiểm sinh học cần thiết chống lại những thay đổi bất lợi của môi trường do việc tạo ra những tính trạng hữu ích như tính kháng sâu bệnh hay tính thích nghi Giá trị của đa dạng di truyền được thể hiện thông qua việc sử dụng và khai thác các tính trạng quý, hiếm của tài nguyên di truyền thực vật như tính chống chịu, năng suất, chất lượng và khả năng thích nghi

Năm 1946, giống lúa mỳ lùn Nhật Bản Norin 10 được nhập vào Mỹ và đã góp phần quan trọng trong cải tạo giống và tăng năng suất lúa mỳ Các giống lúa trồng có nguồn gốc Đông Bắc Ấn Độ được sử dụng là nguồn kháng sâu, bệnh cho các vùng khác nhau trên thế giới Những tính trạng này đã góp phần tăng sản lượng lúa bình quân của Châu Á lên 30% giữa những năm 1981 và 1986

Giá trị khai thác (Exploration Value): Đa dạng di truyền được xem là kho dự trữ tiềm năng các tài nguyên chưa biết đến Đây cũng là lý do cần phải duy trì cả các hệ sinh thái hoang dã lẫn các hệ thống nông nghiệp truyền thống

Ngoài ra, đa dạng di truyền còn có giá trị về thẩm mỹ (thưởng thức, giải trí)

và giá trị về đạo đức Có một số loài có cả giá trị sử dụng, thẩm mỹ và đạo đức; song về giá trị cũng không phải đều nhau giữa các mặt giá trị và giữa các loài [11]

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học nông nghiệp Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ xác định gen mục tiêu hoặc quá trình lai - chọn tạo giống thông qua lựa chọn các cặp bố mẹ trong phép lai Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác nhau Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu

1.5.2.1 Chỉ thị hình thái

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên ch thị hình thái là phương pháp đánh giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận) Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền cũng như quy trình phức tạp Hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biến trên cây trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường Tuy nhiên, việc sử dụng ch thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền

có những hạn chế: Thứ nhất, số lượng các ch tiêu hình thái có hạn, ch thị hình thái chịu tác động của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển; hạn chế thứ hai, việc đánh giá mang tính chất thông kê nên cần

thực hiện với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác; thứ ba, có nhiều tính trạng

do đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có thể đánh giá được Vì thế, các nhà chọn giống thường kết hợp sử dụng các ch tiêu hình thái với việc xác định bằng ch thị sinh hoá và ch thị phân tử ADN để đạt được kết quả chính xác nhất

1.5.2.2 Chỉ thị sinh hóa

Ch thị sinh hoá là loại ch thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm ch thị isozyme và các loại protein dự trữ

Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau,

vì vậy chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong quá trình điện di tạo thành những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể hiện thị bằng phương pháp nhuộm Cơ chế này được điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN, thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN  ARN  Protein

Ch thị protein và ch thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao đồng thời có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của protein Tuy nhiên, do

số lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng

và phát triển của cá thể, nên các ch thị protein và isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế

1.5.2.3 Chỉ thị phân tử ADN

Các ch thị phân tử ADN là những ch thị dựa trên bản chất đa hình ADN

Nó được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài, dùng để lựa chọn tổ hợp lai

Ch thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu, có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô với độ chính xác cao

mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường Ch thị phân tử được chia làm hai nhóm chính:

Ch thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: ch thị RFLP

Ch thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR, )

Một số chỉ thị phân tử thường dùng: RFLP, RAPD, AFLP, SSR, STS, MAS [2]

RFLP là marker có tính chất đồng trội (co-dominant) và rất đáng tin cậy

Kỹ thuật này sử dụng cDNA hoặc thể probe, được đánh dấu bằng phóng xạ, và sự phân cắt hạn chế của enzyme

RAPD là một dạng marker ADN được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR Mức

độ khuếch đại cao từ một cặp mồi đơn giản, ngắn, được thiết kế ngẫu nhiên (10 mer) Đây là marker có tính trội (dominant) và mức độ tin cậy thấp

STS là marker được thiết kế từ chuỗi ký tự của RFLP (20-24 mer), có tính chất đồng trội, được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR, đôi khi nó cũng thể hiện tính trội Đây là phương pháp có thể phải sử dụng enzyme phân cắt trong trường hợp sự

đa hình không thể hiện rõ Kết quả có độ tin cậy tốt

Microsatellite hoặc SSR là marker được thiết kế từ những vệ tinh có chuỗi

ký tự giản đơn, lặp lại nhiều lần Cặp mồi được thiết kế từ trước và sau những vệ tinh như vậy marker có tính chất đồng trội, mức độ tin cậy cao, khả năng dò tìm đa hình khá nhạy Do đó, nó đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD với các mô típ “di-nucleotide” hoặc “tri-nucleotide” (GA, GT, CAT, CTT) trong genome cây lúa

AFLP là một dạng trong những marker dựa trên cơ sở PCR, theo cách chọn lọc của hai “adaptor” (là những enzyme phân cắt hạn chế) Nó phối hợp cả hai tính chất của RFLP và RAPD nên nó có khả năng phát hiện đa hình rất tốt Nhưng

nó thường có tính chất trội (dominant) nên gặp hạn chế khi thể hiện allele lặn

Những marker phân tử nói trên đều có thể áp dụng đánh giá biểu hiện gen

để nghiên cứu tính chống chịu mặn của cây lúa Hướng ưu tiên hiện nay được người

ta quan tâm là sử dụng microsatellite

1.5.3 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa

1.5.3.1 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa trên thế giới

Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của nhiều loại ch thị ch thị cũng như số lượng của mỗi loại ch thị đã làm tăng hiệu quả trong quá trình đánh giá, bảo tồn, khai thác và sử dụng với mục đích khác nhau

Ch thị ADN được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật mà phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm soát các tính trạng, hay chọn giống

phân tử là các lĩnh vực được triển khai hiệu quả

Tác giả Virk và cộng sự (1995) tiến hành nghiên cứu 12 giống lúa trồng

ở châu Á đại diện cho các vùng sinh thái, địa lý khác nhau bằng ch thị RAPD Kết quả cho thấy 18 trong số 24 mồi cho 83 băng, trong đó có 48 băng đa hình

Số lượng băng đa hình xuất hiện từ 1- 5 băng/mồi, các băng nằm trong khoảng 300bp - 2700bp [50]

Olufowote và cộng tác viên (1997) nghiên cứu biến động di truyền trong giống của 71 giống lúa bằng cả hai loại ch thị SSR và RFLP Kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến Cả hai phương pháp đều cho thấy số lượng các allele ở các giống lúa địa phương cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến Ch thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đồng thời số lượng các allele cao hơn ch thị AFLP Các tác giả cũng ch ra rằng ch cần chọn cẩn thận 4 ch thị SSR là có thể nghiên cứu các allele dị hợp tử ở lúa [40]

Tác giả Xu và cộng tác viên (2004) sử dụng 113 ch thị RFLP và 60 ch thị SSR để định lượng đa dạng allele của 125 giống lúa thu từ các Bang miền Tây và miền Nam nước Mỹ và 111 giống từ tập đoàn lúa Quốc tế đang bảo quản tại IRRI Các tác giả nhận thấy cơ sở di truyền các giống lúa hiện có ở Mỹ hẹp hơn nhiều so với các giống lúa từ tập đoàn lúa Quốc tế (56% SSR allele so với 96% và 92% RFLP so với 99% AFLP) 31 trong số 236 giống lúa có số lượng các allele cao (chiếm tới 95% số allele của RFLP và 74% số allele của SSR) có thể được sử dụng làm tập đoàn hạt nhân Kết quả cũng cho thấy ch thị SSR sử dụng hữu hiệu hơn RFLP cả về khả năng phát hiện các allele lẫn chi phí và kỹ thuật [55]

Tác giả Mahmoud và cộng sự (2005) nghiên cứu biến động và quan hệ di truyền của 7 giống lúa bằng việc kết hợp của 8 mồi RAPD, 6 mồi SSR và 8 mồi AFLP cho thấy mức độ đa hình của các mồi tương ứng là 72,2%, 90% và 67,9% và khẳng định các kỹ thuật nêu trên đều có thể áp dụng tốt cho nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa [33]

Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa bằng ch thị SSR của tác giả Raj cho thấy hệ số đa dạng gen của các ch thị SSR dao động từ 0 đến

0,830 và trong nghiên cứu của Jayamani và cộng tác viên (2007) dao động từ 0,179 đến 0,894 [29]

Tác giả McCouch và cộng sự (2005) khi nghiên cứu quan hệ di truyền giữa

52 giống lúa thơm Basmati và 17 giống lúa khác của Ấn Độ bằng 30 ch thị SSR cho thấy số allele phát hiện được dao động từ 3 đến 22 và ch số thông tin di truyền (PIC) dao động từ 0,2 đến 0,9 Trong số 30 ch thị SSR thì 20 ch thị phân biệt được các giống lúa cổ truyền Basmati, 8 ch thị SSR có thể phân biệt được các giống lúa Basmati chất lượng cao với các giống Basmati cải tiến và các giống không phải là Basmati [34]

Quan hệ di truyền giữa các giống lúa Basmati hạt ngắn và Basmati hạt dài cũng được tác giả Sujatha nghiên cứu bằng ch thị SSR Kết quả nghiên cứu của 30 giống lúa thơm, bao gồm 22 giống lúa thơm hạt ngắn và 8 giống Basmati dựa trên 6

ch thị SSR cho thấy 20 trong số 22 giống lúa thơm hạt ngắn nằm cùng một nhóm lớn, 2 giống lúa thơm hạt ngắn còn lại nằm cùng nhau và tách riêng, 8 giống lúa Basmati nằm trong cùng một nhóm khác Tác giả khẳng định ch thị phân tử cung cấp ước lượng đa dạng di truyền chính xác so với các ch thị hình thái Kết quả nghiên cứu giúp cho việc phân biệt và chọn lọc các bố mẹ thích hợp trong công tác lai tạo giống lúa chất lượng [46]

Tác giả Victoria và cộng sự (2007) tiến hành nghiên cứu đa dạng trên 24 giống lúa ở Philippin có chất lượng tốt bằng 164 ch thị SSR Trong số 164 ch thị SSR có 151 ch thị cho đa hình với tổng số allele thu được là 890, trung bình 5,89 allele/locus Trong đó, có 89 ch thị cho 147 allele hiếm Hệ số đa dạng di truyền PIC từ 0,18 - 0,91 đạt trung bình 0,68/ch thị Theo kết quả phân tích UPGMA, ở

độ tương đồng 40%, tổng số 24 giống lúa được chia thành ba nhóm: Nhóm 1 gồm

8 giống Japonica, nhóm 2 và 3 là các giống lúa Indica Nghiên cứu này cho ta

thấy việc sử dụng ch thị SSR là rất hiệu quả trong phân nhóm các loài phụ của lúa, những giống lúa có chất lượng tốt thì thường có khoảng cách di truyền cao hơn và vì thế chúng là nguồn vật liệu cho công tác chọn giống [49]

1.5.3.2 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa tại Việt Nam

Việt Nam được xem là trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên di truyền lúa của nước ta phong phú cả về số lượng và chất lượng Những nghiên cứu

về đa dạng di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam còn hạn chế Tuy nhiên, trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm ứng dụng các kỹ thuật ch thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyên lúa nước ta

Và những thành tựu dưới đây sẽ cho thấy chúng ta hoàn toàn có khả năng thực hiện được những nghiên cứu sinh học sử dụng các phương pháp công nghệ tiên tiến, đẩy mạnh công tác chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi trong nước và hợp tác quốc tế trên nhiều lĩnh vực sinh học hiện đại

Tác giả Bùi Chí Bửu và cộng sự (2003) đã sử dụng 20 mồi RAPD để đánh giá đa dạng di truyền của 72 giống lúa địa phương Trong 20 mồi thử nghiệm thuộc nhóm OPA kit, có 10 mồi cho kết quả tốt với 59 băng Kết quả có hai nhóm chính bao gồm các giống lúa mùa, lúa chiêm ở đồng bằng sông Hồng, lúa nước sâu của đồng bằng sông Cửu Long, lúa nếp của Tây Nguyên và lúa nước trời của Duyên Hải Trung bộ [2]

Tác giả Trần Danh Sửu và cộng sự (2006) sử dụng 48 ch thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 17 giống lúa Tám Hệ số đa dạng gen thu được từ các giống lúa là 0,35 Số allele thu được trung bình 3,37 allele/mồi 17 giống lúa này

còn được phân loại Indica và Japonica dựa trên sự khác biệt của ADN lục lạp Kết quả 17 giống lúa Tám đều thuộc nhóm Japonica [13]

Tác giả Phạm Thị Bé Tư và cộng sự (2008) đã đánh giá đa dạng của 90 giống lúa mùa địa phương bằng ch thị SSR Hệ số đa dạng từ 0,68 - 9,95, trung bình là 0,88 Kết quả thu được từ 90 giống lúa mùa địa phương được phân thành 6 nhóm giống khác nhau [15]

1.6 Chọn tạo giống lúa chịu hạn

1.6.1 Chọn tạo lúa chịu hạn trên thế giới

Khô hạn là yếu tố chính làm giảm năng suất của lúa (Oryza sativa L.), dưới

điều kiện canh tác nước trời (rainfed) và sự kiện thiếu nước tưới ngày càng nghiêm trọng hơn ở vùng có nước tưới cũng như vùng lúa rẫy Người ta tập trung sự chú ý vào đối tượng khô hạn và mặn, hai dạng gây stress phi sinh học quan trọng đối với

sản xuất lúa, và đặt ra mục tiêu hướng tới để cải tiến giống lúa trên qui mô toàn cầu

Chọn giống truyền thống chống chịu khô hạn là cách tiếp cận rất cơ bản trong một thời gian dài, một vài thành công đã được ghi nhận trên cây ngô, cây lúa, cây lúa mì [60], [61] Tuy nhiên, một lỗ hổng lớn giữa các mức độ chống chịu hạn vẫn chưa được xác định trong hầu hết các loài cây trồng Đặc biệt là sự ổn định về năng suất vô cùng nhạy cảm với sự thiếu nước [56] Đáp ứng lại hiện tượng stress

do khô hạn, cây trồng có một cơ chế rất tiến bộ từ việc nhận tín hiệu đến truyền nó

đi vào hệ thống tinh vi của tế bào, kích thích hoạt động của gen mục tiêu [54]

Chống chịu khô hạn là tính trạng cực kỳ phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự thể hiện đồng thời cả một hệ thống gen mục tiêu và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố về môi trường, vật lý, hóa học [45], [48] Điều này làm cho những tiến bộ nhất định về biến đổi di truyền tính chống chịu khô hạn xảy ra rất chậm chạp Chiến lược có hiệu quả

đã được ghi nhận là làm gia tăng lượng đường dễ hòa tan, các hợp chất cần thiết thông qua tiếp cận với kỹ thuật chuyển nạp gen Những hợp chất đó là: proline, trehalose, betaine và mannitol, đóng vai trò như những thể bảo vệ thẩm thấu (osmoprotestants); trong vài trường hợp, chúng ổn định được các phân tử chức năng dưới điều kiện bị stress

Protein LEA (late embryogenesis abundant) cũng được chú ý trong điều kiện

bị stress do thiếu nước [56] Protein LEA được phân chia thành 5 nhóm chính trên

cơ sở chuỗi trình tự amino acid của nó và chúng được xét nghiệm lại thông qua công cụ tin sinh học [19], [25] Sự thể hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy vai trò bảo vệ cây chống chịu sự kiện mất nước [29] Mặc dù chúng ta có nhiều số liệu về cấu trúc và sự thể hiện của protein này, nhưng

rất ít công trình đề cập đến thao tác của các gen LEA nhằm cải tiến tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng [28] Thí dụ, gen HVA1 mã hóa nhóm protein 3 LEA của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.) Người ta đã chuyển nạp gen này

thành công vào cây lúa để tăng cường tính chống chịu khô hạn và chống chịu mặn,

ch trong điều kiện ở nhà lưới [56]

Vào những năm gần đây, do sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của các ch thị phân tử đặc biệt là ở lúa, các nhà khoa học đã

thiết lập được một số bản đồ phân tử cho các tính trạng số lượng như chịu hạn, chịu úng, chịu phèn Đối với đặc tính chống chịu hạn bằng sử dụng ch thị phân tử như SSR, AFLP, RFLP, SNP, các QTL kháng hạn đã được định vị ở nhiều loại cây trồng khác nhau cũng như cây lúa [53] Phương pháp phân tích sự đóng góp của các tính trạng có liên quan, với mô hình QTL (quantitative trait loci) Phương pháp tiếp cận này phù hợp với hầu hết các loài cây trồng chủ yếu như cây lúa, nhờ bản đồ di truyền với nhiều marker phân tử ADN phủ kín trên nhiễm sắc thể

Tại Đại học Texas Tech, Zhang và cộng sự (1999) đã thực hiện bản đồ di truyền QTL đối với 2 tính trạng quan trọng liên quan đến sự kiện chống chịu khô hạn, đó là: khả năng điều tiết áp suất thẩm thấu (OA), và những tính trạng hình thái của rễ lúa Quần thể lúa đã được sử dụng trước đây để lập bản đồ QTL tính trạng

OA là: Quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) của tổ hợp lai CO39 / Moroberekan, với

1 QTL; Quẩn thể đơn bội kép (DH) của tổ hợp lai CT9993 / IR62266, với 4 QTL; Quần thể cận giao tái tổ hợp (RIL) của tổ hợp lai CO39 / Moroberekan, với 5 QTL; Quần thể lúa đã được sử dụng để lập bản đồ QTL tính trạng tích lũy ABA là quần thể F2 của tổ hợp lai IR20 / 63-83, với 10 QTL [32], [41], [59]

Việc ứng dụng của công nghệ tế bào thực vật trong đánh giá và chọn dòng chịu hạn với kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể được sử dụng để đánh giá khả năng chống chịu của cây trồng ở nhiều mức độ khác nhau như mức gen, mức tế bào riêng rẽ, các loại mô, cơ quan nuôi cấy, phân lập và cây hoàn ch nh Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng chống chịu như chịu hạn mang lại hiệu quả cao trong chọn lọc các giống cây trồng phù hợp với điều kiện sinh thái của từng vùng miền khác nhau Mundy và Chua tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa đã nhận thấy ABA là chất làm tăng khả năng giữ nước và chống chịu mất nước của mô sẹo ở lúa Nồng độ ABA thích hợp cho xử lý tiền mô sẹo ở lúa là 10 - 5M và thời gian xử lý là

5 -7 ngày [24]

Nghiên cứu chuyển gen khô hạn ở lúa cũng đã thành công với các công trình

nghiên cứu Các kết quả nghiên cứu đều tập chung chuyển gen hrf1 làm tăng ABA

là chất làm tăng khả năng giữ nước và chống chịu mất nước ở cây lúa

1.6.2 Chọn tạo giống lúa chống chịu hạn ở Việt Nam

Sự khan hiếm về nguồn nước tưới cho nông nghiệp hiện nay và trong tương lai là vấn đề ngày càng trở nên nghiêm trọng có tính chất toàn cầu Do đó, các dự án nghiên cứu về cây trồng chống chịu khô hạn đang là hướng ưu tiêu đầu tư của các

dự án quốc tế và quốc gia

Ở nước ta, việc nghiên cứu, đánh giá chọn tạo các giống lúa chịu hạn đã có

từ những năm thập k 90 Cho đến nay, đã có rất nhiều các giống lúa chịu hạn được các nhà khoa học chọn tạo ra thông qua chọn tạo giống truyền thống cũng như ứng dụng công nghệ sinh học Các kết quả nghiên cứu sơ bộ trên một số giống lúa cho thấy nước ta có nguồn gen chịu hạn phong phú từ các giống lúa địa phương, các giống lúa có tiềm năng chịu hạn vùng núi phía Bắc, Trung, Nam [2]

Vũ Tuyên Hoàng và cộng sự (1992) đã nghiên cứu đặc điểm sinh lý ‎ của các giống lúa chịu hạn ở Việt Nam và đã đưa ra được các ch tiêu như độ ẩm của cây héo, hàm lượng nước trong thân lá cũng như cường độ thoát hơi nước trong thân lá [6]

Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Cường và cộng sự (2003) cho rằng, sự gia tăng hàm lượng proline của các giống lúa nghiên cứu có mối tương quan thuận với tính chống chịu lạnh, mặn và hạn Chu Hoàng Mậu và cộng sự (2005) khi nghiên cứu về hàm lượng proline ở các giống lúa cạn đã nhận thấy khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn có liên quan đến hàm lượng protein và hàm lượng proline [3], [10]

Đối với đặc tính chống chịu hạn bằng sử dụng ch thị phân tử như SSR, AFLP, RFLP, SNP, RAPD, các QTL kháng hạn đã được định vị ở nhiều loại cây trồng khác nhau cũng như cây lúa Tại Việt Nam, nghiên cứu lập bản đồ QTL kháng hạn ở giống lúa nương sử dụng ch thị phân tử do tổ chức Rockefeller tài trợ đã được tiến hành tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, viện Công nghệ Sinh học, viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, viện Bảo vệ Thực vật, trường Đại học Nông nghiệp [2]

Nhiều giống lúa chịu hạn từ các t nh miền núi phía Bắc, miền Trung và miền Nam Việt Nam đã được thu thập, phân tích, đánh giá về mặt sinh lý cũng như đa dạng di truyền của chúng Việc nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của các giống lúa cạn làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống lúa chịu hạn là một bước quan trọng trong công tác chọn tạo giống Các nghiên cứu của Chu Hoàng

Mậu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu trên 12 giống lúa cạn ở 3 t nh Sơn La, Bắc Kạn, Cao Bằng và đã chia các giống lúa thành 4 nhóm với khoảng cách di truyền giữa các giống lúa cạn là 7,69% - 34% và hệ số đa dạng di truyền của hệ gen lúa cạn Hg = 52,37% [10]

Từ kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn, Lò Thị Mai Thu và cộng sự tiếp tục đánh giá mối quan hệ di truyền ở mức độ phân tử ADN bằng

kỹ thuật RAPD đã nhân bản được 182 phân đoạn ADN từ hệ gen của 7 giống lúa cạn Năm mồi sử dụng cho nghiên cứu đều thể hiện tính đa hình, tính đa hình cao được thể hiện ở các mồi M4, M7, M13 (trong đó mồi M13 có 100% phân đoạn đa hình) Trên

cơ sở đó, các tác giả đã chia các giống lúa cạn nghiên cứu thành 2 nhóm chính: nhóm thứ nhất gồm 3 giống (LC, CB2, SL1) và nhóm thứ 2 gồm 4 giống (CB1, HG, SL2, LCh) với hệ số khác nhau là 26% Hai giống HG và SL1 có khả năng chịu hạn tốt nhất, đồng thời cũng có hệ số tương đồng di truyền cao nhất (97%) được xếp vào cùng một nhóm (trích theo Phạm Thị Bé Tư và cộng sự, 2008) [15]

Nghiên cứu của nhóm tác giả Phạm Anh Tuấn và cộng sự (2008) đã nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn của 50 giống lúa địa phương Kết quả cho thấy, 12 trong số 50 giống lúa nghiên cứu đã thể hiện khả năng chịu hạn tốt và đều đạt các

ch số độ cuốn lá, độ khô của lá và khả năng phục hồi trong khoảng điểm từ 0-3 Trong đó, có 5 giống là Blào đóng, Blào cô ném, Chạo lựu, Khẩu cụ và Bièo hồng súi chịu hạn cao với điểm của 3 ch tiêu đánh giá đều đạt trong khoảng 0-1 Các giống Q5, CR203 và Khang Dân mẫn cảm với điều kiện khô hạn với mức cấp phản ứng lần lượt là 9,0, 9,0 và 7,7 với cả 3 ch tiêu đánh giá Kết quả phân tích đa hình

di truyền đối với 15 giống lúa (gồm 12 giống có kiểu hình chịu hạn tốt và 3 giống mẫn cảm Khang Dân, Q5, CR203) với 10 cặp mồi SSR cho thấy 4 giống Blào đóng, Blào cô ném, Khẩu cụ và Bièo hồng súi chịu hạn cao tập trung thành một nhóm; các giống mẫn cảm liên kết thành một nhóm Các giống lúa Blào đóng, Blào cô ném, Khẩu cụ và Bièo hồng súi có thể sử dụng làm nguồn gen chống chịu hạn trong chương trình chọn tạo giống lúa [15]

Việc lập bản đồ QTL các giống lúa chịu hạn, Nguyen Thi Lang và cộng sự đã lập được bản đồ QTL khô hạn với các marker liên kết tập trung quần thể với 232

markers chiều dài 2.553.70cM phủ trên 12 nhiễm sắc thể, trung bình là 10.97cM [37]

Chương trình tuyển chọn và phát triển giống lúa cạn cải tiến LC93-1 phục vụ sản xuất lượng thực ở vùng cao của Viện Bảo Vệ Thực Vật Từ Liêm, Hà Nội với phương pháp chọn lọc từ tập đoàn lúa cạn IRRI nhập nội, năm 1993 đã chọn được giống LC93-1 có thời gian sinh trưởng 115 - 125 ngày, năng suất 3 - 4 tấn/ha, chịu hạn khá, chất lượng gạo tốt, thích hợp cho vùng đồng bào dân tộc nghèo ở vùng cao

Nghiên cứu chọn giống lúa chống chịu khô hạn của Viện Cây lương thực thực phẩm với phương pháp thu thập nguồn vật liệu giống lúa cạn chịu hạn địa phương và các dòng lúa cải tiến nhập nội từ IRRI với phương pháp lai hữu tính kết hợp với gây đột biến để tạo ra các tổ hợp lai có khả năng chịu hạn khá và năng suất cao như CH2, CH3, CH133, CH5 trồng rộng rãi ở vùng Trung du miền núi phía Bắc, Trung bộ, Đông Nam bộ và Tây Nguyên

Ở Việt Nam, cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng chống chịu như chịu hạn mang lại hiệu quả cao Tác giả Đinh Thị Phòng (2001) bằng các phương pháp thổi khô mô sẹo của các giống lúa CR203, CH133, Lốc, X11, C70 đã thu được

271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn Tác giả đã chọn tạo được giống DR1, DR2 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc [12]

Nguyễn Thị Thu Hoài (2005) khi nghiên cứu về khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn địa phương đã kết luận rằng khả năng chịu mất nước và tốc độ sinh trưởng của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô của các giống nghiên cứu có sự sai khác

rõ rệt, giống BC12 là giống chịu hạn tốt nhất so với các giống nghiên cứu [7]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Tổng số có 40 giống lúa (bảng 1), trong đó:

 39 giống lúa địa phương Việt Nam có khả năng chịu hạn tốt được cung cấp bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật và Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long

 01 giống lúa tham khảo (IR64) là giống mẫn cảm với khô hạn

Bảng 2.1 Danh sách, số đăng kí (SĐK) trong ngân hàng gen và kí hiệu các

giống lúa nghiên cứu

18 3588 Tan ngần H18 Yên Bái

* Hoá chất tách chiết ADN: Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như:

Nito lỏng, Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Ete, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN, Labscan

- Đệm tách chiết ADN của mẫu lá cây chuyển gen: - Đệm TE:

- Phenol: chloroform: isoamyl acohol 70% (25:24:1)

- Ethanol 100% (hoặc Isopropanol) và Ethanol 70%

* Hoá chất dùng cho phản ứng PCR:

- Đệm PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2, 5 mM KCl) hoặc đệm PCR 1X của Quiagen hoặc Invitrogen

- MgCl2 của Fermentas, Invitrogen

- dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP (hoặc dUTP)) của Fermentas, Invitrogen

- Mồi, của hãng Fermentas, Invitrogen

- Taq polymerase của Fermentas

- Mẫu dò có huỳnh quang của IDT, USA

- Nước cất hai lần khử ion

* Hoá chất chạy dùng để điện di gel agarose:

- Pha TAE 50X (1 lít): 242g Tris base; 57,1ml acetic acid; 100ml 0,5M EDTA PH=8; Chuẩn nước cất cho đến 1 lít

- TAE 1X: 1 lít TAE 1X được pha 20ml TAE 50X + 980ml nước cất

- Argarose: lấy tùy thể tích gel và nồng độ điện di

- Chất nhuộm màu Ethidium Bromide

- Marker øX17 - Hea III digest DNA, Marker 100bp, Marker λADN

* Các mồi SSR: 50 cặp mồi SSR được được sử dụng để phân tích thuộc các

locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 nhiễm sắc thể khác nhau đã được McCouch và cộng sự công bố

năm 2002 (bảng 2.2) [34]