4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học nông nghiệp. Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ xác định gen mục tiêu hoặc quá trình lai - chọn tạo giống thông qua lựa chọn các cặp bố mẹ trong phép lai. Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác nhau. Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu.
1.5.2.1. Chỉ thị hình thái
Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên ch thị hình thái là phương pháp đánh giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận). Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền cũng như quy trình phức tạp. Hiện nay phương pháp này vẫn được sử dụng phổ biến trên cây trồng để giúp các nhà nghiên cứu phân biệt các giống khác nhau bằng mắt thường. Tuy nhiên, việc sử dụng ch thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: Thứ nhất, số lượng các ch tiêu hình thái có hạn, ch thị hình thái chịu tác động của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển; hạn chế thứ hai, việc đánh giá mang tính chất thông kê nên cần
thực hiện với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác; thứ ba, có nhiều tính trạng do đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có thể đánh giá được. Vì thế, các nhà chọn giống thường kết hợp sử dụng các ch tiêu hình thái với việc xác định bằng ch thị sinh hoá và ch thị phân tử ADN để đạt được kết quả chính xác nhất.
1.5.2.2. Chỉ thị sinh hóa
Ch thị sinh hoá là loại ch thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm ch thị isozyme và các loại protein dự trữ.
Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau, vì vậy chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong quá trình điện di tạo thành những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể hiện thị bằng phương pháp nhuộm. Cơ chế này được điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN, thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN ARN Protein.
Ch thị protein và ch thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao đồng thời có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của protein. Tuy nhiên, do số lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cá thể, nên các ch thị protein và isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế.
1.5.2.3. Chỉ thị phân tử ADN
Các ch thị phân tử ADN là những ch thị dựa trên bản chất đa hình ADN. Nó được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa loài, dùng để lựa chọn tổ hợp lai.
Ch thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu, có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô với độ chính xác cao mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường. Ch thị phân tử được chia làm hai nhóm chính:
Ch thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: ch thị RFLP.
Ch thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR,...).
Một số chỉ thị phân tử thường dùng: RFLP, RAPD, AFLP, SSR, STS, MAS [2].
RFLP là marker có tính chất đồng trội (co-dominant) và rất đáng tin cậy. Kỹ thuật này sử dụng cDNA hoặc thể probe, được đánh dấu bằng phóng xạ, và sự phân cắt hạn chế của enzyme.
RAPD là một dạng marker ADN được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR. Mức độ khuếch đại cao từ một cặp mồi đơn giản, ngắn, được thiết kế ngẫu nhiên (10 mer). Đây là marker có tính trội (dominant) và mức độ tin cậy thấp.
STS là marker được thiết kế từ chuỗi ký tự của RFLP (20-24 mer), có tính chất đồng trội, được sản sinh nhờ kỹ thuật PCR, đôi khi nó cũng thể hiện tính trội. Đây là phương pháp có thể phải sử dụng enzyme phân cắt trong trường hợp sự đa hình không thể hiện rõ. Kết quả có độ tin cậy tốt.
Microsatellite hoặc SSR là marker được thiết kế từ những vệ tinh có chuỗi ký tự giản đơn, lặp lại nhiều lần. Cặp mồi được thiết kế từ trước và sau những vệ tinh như vậy marker có tính chất đồng trội, mức độ tin cậy cao, khả năng dò tìm đa hình khá nhạy. Do đó, nó đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD với các mô típ “di- nucleotide” hoặc “tri-nucleotide” (GA, GT, CAT, CTT) trong genome cây lúa.
AFLP là một dạng trong những marker dựa trên cơ sở PCR, theo cách chọn lọc của hai “adaptor” (là những enzyme phân cắt hạn chế). Nó phối hợp cả hai tính chất của RFLP và RAPD nên nó có khả năng phát hiện đa hình rất tốt. Nhưng nó thường có tính chất trội (dominant) nên gặp hạn chế khi thể hiện allele lặn.
Những marker phân tử nói trên đều có thể áp dụng đánh giá biểu hiện gen để nghiên cứu tính chống chịu mặn của cây lúa. Hướng ưu tiên hiện nay được người ta quan tâm là sử dụng microsatellite.