Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu mặn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR

Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn trên thế giới...7 1.2.2.2 Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn ở Việt Nam...8 II.. Sử dụng các chỉ thị SS

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ 3

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Các vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam 5

1.2 Chỉ thị phân tử SSR và ứng dụng trong nghiên cứu, xác định gen chống chịu mặn 5

1.2.1 Chỉ thị phân tử SSR 5

1.2.2 Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn 6

1.2.2.1 Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn trên thế giới 7

1.2.2.2 Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn ở Việt Nam 8

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 Vật liệu 9

2.2 Phương pháp nghiên cứu 11

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch 11

2.2.2 Sử dụng các chỉ thị SSR liên kết chặt với QTL chịu mặn Saltol để xác định sự có mặt của gen chịu mặn trên các giống lúa nghiên cứu 12

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 15

3.2 Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi 15

3.3 Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa chịu mặn nghiên cứu 17

3.4 Xác định các allele hiếm xuất hiện trong tập đoàn lúa chịu mặn nghiên cứu 19

3.5 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống lúa Chịu mặn nghiên cứu 20

IV KẾT LUẬN 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lúa gạo là cây lương thực quan trọng đối với con người Trên thế giới cây lúađược xếp vào vị trí thứ hai sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng Ở Châu Á, lúa gạođược coi là cây lương thực quan trọng nhất, chiếm diện tích 135 triệu trong tổng số 148,4triệu ha trồng lúa của toàn thế giới Trong tương lai, xu thế sử dụng lúa gạo sẽ còn tănghơn vì đây là loại lương thực dễ bảo quản, dễ chế biến và cho năng lượng khá cao Theotính toán của Peng và cộng sự (1999), đến năm 2030 sản lượng lúa của thế giới phải đạt

800 triệu tấn mới có thể đáp ứng được nhu cầu lương thực của con người [14]

Trong tình trạng nguồn lương thực khan hiếm và giá lương thực tăng như hiện nay,thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lương thực Theo một nghiên cứu của trườngĐại học Stanford, đến năm 2030 sản lượng lương thực ở châu Á sẽ giảm 10% hoặc hơn,đặc biệt là sản phẩm lúa gạo Năng suất và sản lượng lúa luôn bị đe doạ bởi thiên tai, sâubệnh và các yếu tố môi trường Trong đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất nhiễm mặn.Đất trồng trọt bị ảnh hưởng mặn ước khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 diện tích đất trồngtrên toàn thế giới

Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng nămnhững vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển Theothống kê, năm 2000 là 606.792 ha [5] Theo báo cáo mới nhất của Cục trồng trọt, tạiĐồng bằng sông Cửu Long, xâm ngập mặn đã ảnh hưởng đến 620.000 ha/1.545.000 halúa đông xuân năm 2009 - 2010, chiếm 40% diện tích toàn vùng, tại các tỉnh ven biểnnhư Tiền Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang và Bến Tre Trong

đó, diện tích có nguy cơ bị xâm ngập mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha, chiếm16% diện tích canh tác lúa của các tỉnh trên [4] Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàncầu đang thay đổi, hiện tượng băng tan ở hai cực, nước biển dâng lên đe dọa các vùng đấtcanh tác thấp ven biển Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khókhăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo, và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảmbảo an ninh lương thực thế giới sẽ khó hoàn thành Do đó, việc hạn chế mức độ gây hạicủa sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu

Để đáp ứng được yêu cầu này, việc chọn tạo ta các giống cây trồng chịu mặn là rất

cần thiết Vì vậy, chúng tôi tiến hành chuyên đề “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu mặn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR”

Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu và vật liệu cho các nghiên cứu khoahọc tiếp theo về cây trồng chống chịu mặn, đồng thời, góp phần vào công tác chọn tạogiống lúa có khả năng chịu mặn, phẩm chất gạo tốt, năng suất cao, phù hợp với điều kiệncanh tác lúa vùng nhiễm mặn và cơ cấu sản xuất lúa vùng nhiễm mặn ở Việt Nam, giúpngười nông dân trồng lúa vùng nhiễm mặn tăng thêm thu nhập, giảm đói nghèo

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, do tác động của biển, các vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu ở haivùng châu thổ lớn là Đồng bằng Sông Hồng và Đồng bằng sông Cửu Long Ảnh hưởngcủa nước biển ở vùng cửa sông và đất liền ở Đồng bằng Sông Hồng chỉ khoảng 15 km,nhưng ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long lại có thể xâm nhập tới 40 - 50 km Nhóm đấtmặn có diện tích khoảng một triệu ha, căn cứ vào nồng độ muối hoà tan với tỷ lệ Clo (Cl)trong đó, Hội Khoa học Đất Việt Nam chia đất mặn ra theo bảng sau

số lượng không vượt quá 5 nucleotit (có tài liệu nói đoạn lặp có thể có từ 1-6 nucleotit)[16] Ví dụ về trình tự lặp như (AT)n, (CT)n, (ATT)n (n là số lần lặp lại và có sự biếnthiên giữa các alen) Số lần lặp lại của mỗi đơn vị có thể từ 10 đến 100 lần ở lúa người ta

đã phát hiện ra các kiểu trình tự lặp như: GA, GT, CAT, CTT

Các đoạn ADN nhắc lại có trình tự hai đầu rất đặc trưng Bởi vậy trình tự đặctrưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại được sử dụng để thiết kế mồi cho phản ứng PCR Do có

sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại mà kỹ thuật này rất phù hợp trongnghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen Cũng giống như kỹ thuật RADP, kỹ thuậtSSR đơn giản, thuận tiện, không tốn kém Mặt khác, SSR là chỉ thị đồng trội nên nó được

sử dụng để phát hiện các cá thể dị hợp tử, và lập bản đồ gen khi sử dụng quần thể F2 [3]

1.2.2 Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn

Trên thực tế, việc chọn giống chống chịu stress mặn dựa trên kiểu hình rất khó do

có sự tương tác giữa các gen Nhờ chỉ thị phân tử mà công việc xác định gen chống chịumặn, chọn, tạo giống chống chịu trở lên dễ dàng, chủ động và chính xác hơn

Xác định gen kháng bằng chỉ thị phân tử nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tử liênkết chặt với các gen kháng và các QTLs để chọn được các cá thể mang gen kháng trongquần thể phân li Độ chính xác của phương pháp này có thể lớn hơn 99,75% khi genkháng kẹp giữa hai chỉ thị liên kết với gen kháng đó và khoảng cách di truyền từ chỉ thịphân tử đến gen kháng nhỏ hơn 5cM Bằng cách chọn lọc này, các tổ hợp gen kháng khácnhau được chọn lọc là dựa trên kiểu gen thay vì dựa trên kiểu hình [18]

Về cơ bản các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ di truyềnhoặc nghiên cứu sự đa dạng di truyền hoặc phân lập gen, hoặc xác định gen,… Tuynhiên, mỗi loại chỉ thị có ưu nhược điểm riêng vì thế tuỳ vào mục đích, yêu cầu và điềukiện cụ thể của mỗi nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng chỉ thị nào cho thích hợp

Trong số các chỉ thị phân tử thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện,nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế

Sự phát triển của marker phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây

đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn củacây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau Các nghiên cứu của Gregorio (1997) vàNiones (2004) đã lập được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL “Saltol” hiện diện trên nhiễmsắc thể số 1, quyết định tới khoảng 40 - 65% tính chống chịu mặn của lúa [6, 11]

Hình 1.1 Đoạn gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 của lúa, vị trí xác định của các SSR

marker [11]

1.2.2.1 Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn trên thế giới

Mohammadi - Nejad và ctv (2008) thí nghiệm 33 SSR marker đa hình trên đoạnSaltol của nhiễm sắc thể số 1 nhằm xác định mức độ liên kết và hữu dụng của các markernày trong chọn giống chống chịu mặn Các SSR marker này được dùng để thử nghiệmtrên 36 giống lúa được phân loại thành 5 nhóm: rất chống chịu, chống chịu, chịu mặntrung bình, nhiễm mặn và rất nhiễm mặn qua thanh lọc mặn nhân tạo Trong số 33 marker

có 6 marker: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412, RM493 và RM140 liên kết chặtvới đoạn Saltol ở vị trí 10,8 - 12,28 Mb Đoạn Saltol được có thể nằm trong vị trí có chứacác marker RM8094, RM3412, RM493 Các giống lúa IR70023, IR65858, IR69588,IR74105, IR71832, IR74099, Cherivirrupo và IR66946-3R-178-1-1 (FL478) có sản phẩmPCR giống như sản phẩm PCR của Pokkali khi được nhân bản bởi marker RM8094 vàcho tính chống chịu rất tốt hoặc tốt đối với mặn Do đó, marker RM8094 thể hiện liên kếtthuận và chặt chẽ với tính kháng mặn ở giai đoạn mạ Mohammadi - Nejad và ctv (2008)càng khuyến cáo việc sử dụng hai marker RM8094 và RM10745 trong xác định kiểu gen

của cây lúa chống chịu mặn có mang đoạn QTL Saltol trong các chương trình lai tạogiống lúa chịu mặn [10]

1.2.2.2 Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn ở Việt Nam

Lang và ctv (2001) đã sử dụng 74 chỉ thị RFLP kết hợp với 91 cặp mồi SSR trênquần thể RIL F8 của tổ hợp lai Tenasai 2/CB và đã lập được bản đồ QTL của một số tínhtrạng mục tiêu liên quan đến hiện tượng chống chịu mặn ở cây lúa (Hình 1.2) [1]

Bùi Chí Bửu và ctv (2000) đã sử dụng 30 SSR marker để lập bản đồ gen cho tínhchống chịu mặn của quần thể F3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp laiIR28/Đốc Phụng Các tác giả xác định 10 SSR marker cho thể đa hình của các sản phẩmPCR giữa các cá thể phân ly và bố mẹ Tuy nhiên chỉ có marker RM223 liên kết với genchống chịu mặn với khoảng cách là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8 RM223 nhân bảnđoạn ADN có kích thước 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống Đốc Phụng

và sản phẩm PCR có kích thước 160 bp từ giống nhiễm IR28 [1] Nguyễn Thị Lang vàctv (2001) báo cáo marker OSR1 và RM315 liên kết với QTL cho tính chống chịu mặn ởlúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1 [1]

Hình 1.2: Bản đồ QTL của những tính trạng mục tiêu liên quan đến hiện tượng chống chịu mặn trên quần thể F8 (RIL) của tổ hợp lai Tenasai 2/CB

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Vật liệu nghiên cứu là 38 giống lúa Chịu mặn được thu thập ở nhiều địa phươngkhác nhau, đang được lưu giữ và bảo tồn tại Ngân hàng gen hạt của Trung tâm Tàinguyên Thực vật (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Danh sách 38 giống lúa thu thập dùng trong nghiên cứu

TT Kí

hiệu Tên giống Vùng trồng TT Kí hiệu Tên giống Vùng trồng

Đà Nẵng 21 M21 Nàng quất điểm Tiền Giang

3 M3 Nếp mặn Quảng NamĐà Nẵng 22 M22 Nàng neo Long An

4 M4 Nước mặn Quảng NamĐà Nẵng 23 M23 Ngoi tía Nam Định

5 M5 Háu trắng Thừa Thiên Huế 24 M24 Nếp cúc Ninh Bình

9 M9 Quảng trắng Quảng Trị 28 M28 Nàng Co Đỏ 2 Bạc Liêu

10 M10 Nếp trứng Quảng Trị 29 M29 Ba túc Trà Vinh

11 M11 Chiêm đỏ Quảng Trị 30 M30 Một Bụi Đỏ Bạc Liêu

12 M12 Chiêm mặn Quảng Trị 31 M31 Thần Nông Đuôi Bạc Liêu

13 M13 Lúa nước mặn Quảng Ngãi 32 M32 Một bụi vàng Bạc Liêu

14 M14 Nếp Quảng Ngãi Bình Định 33 M33 Móng chim rơi Bạc Liêu

15 M15 Lúa ngoi Quảng Ninh 34 M34 Ba bụi sớm Bạc Liêu

16 M16 Lúa bông dừa Trà Vinh 35 M35 Đốc phụng 2 Bạc Liêu

18 M18 Trắng chùm TP Hồ Chí Minh 37 M37 OM5166 Vĩnh Long

Sử dụng 30 cặp mồi SSR để phân tích đa dạng di truyền của các giống lúachịu mặn thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogencung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗilocus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau.

Bảng 2.2: Thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch

2.2.1.1 Tách chiết ADN tổng số

Mẫu lá của từng giống được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theophương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến [12] Quy trình tách chiết nhưsau:

1 Nghiền 1,5 - 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ

2 Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đã đượclàm nóng đến 650C)

3 Đảo đều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần

4 Làm lạnh đến nhiệt độ phòng Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảođều trong 10 phút.

11 Loại bỏ lớp Ete bên trên Cẩn thận chuyển phần bên dưới vào ống mới

12 Thêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở - 20°C trong 30 phút Lấy ADN rabằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh

13 Rửa tủa 3 lần với 1,5 ml ethanol 70%

14 Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa

15 Giữ dung dịch ADN ở - 20°C

2.2.1.2 Đo độ tinh sạch của ADN

Sau khi tách chiết, độ tinh sạch và nồng độ của ADN được đánh giá bằng phươngpháp điện di trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X với thang ADN  (nồng

độ 50 ng/µl) làm chuẩn, trong 30 phút, nguồn điện 100V Sau khi chạy điện di, tiến hànhnhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm ethidium bromide Việc chụp mẫu và đo nồng độ đượcthực hiện bằng máy Molecular imager FX

2.2.2 Sử dụng các chỉ thị SSR liên kết chặt với QTL chịu mặn Saltol để xác định sự có mặt của gen chịu mặn trên các giống lúa nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp PCR với mồi SSR

Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Mastercycler - personal

Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần được trình bày ở bảng 2.3

Bảng 2.4: Các bước phản ứng trong máy PCR

Bảo quản mẫu ở 40C

2.2.2.2 Kiểm tra kết quả trên gel Polyacrylamide

Sản phẩm thu được từ phản ứng PCR được kiểm tra trên gel polyacrylamide 12%,trong môi trường đệm TAE 1X, sử dụng ladder 50 bp làm chuẩn

Việc kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR được tiến hành cụ thể như sau:

- Chuẩn bị gel polyacrylamide:

Bảng 2.5: Thành phần gel polyacrylamide

Acrylamide 6% APS 10% TEMED Nước đề icon

- Nhuộm gel và ghi nhận kết quả:

Sau khi điện di, tiến hành nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (0,5ng/ml) trong 30 phút Soi và chụp ảnh băng sản phẩm điện di trên máy soi UV của hãngUVP, dựa vào đó xác định sản phẩm PCR thu được

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp CTAB của Obara và Kako(1998) có cải tiến để tách chiết ADN hệ gen từ lá của các giống lúa nghiên cứu Nguyên

lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng chất tẩy cetyl-trimethyl-amonium-bromid(CTAB), chất này có khả năng hòa tan các chất giải phóng ra từ màng tế bào sau khimàng của chúng bị phá vỡ, ADN dễ hòa tan hơn nhiều so với các chất khác Vì vậy,CTAB đóng vai trò là chất chính trong tách chiết axit nucleic [12]

Sau khi tách chiết và thu được ADN, chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng ADN(dùng 3µl và 5 µl ở nồng độ 50ng/µl làm chuẩn để đo nồng độ ADN) bằng phương phápđiện di trên gel agarose 1%, trong thời gian 30 phút, sau đó nhuộm bằng ethidiumbromide Sử dụng máy chuyên dụng (Molercular imager FX) để xác định nồng độ Ảnhđiện di (hình 3.1) cho thấy các băng gọn sắc nét, ADN không bị đứt gẫy, có độ tinh sạchcao, đủ tiêu chuẩn dùng cho các phản ứng PCR tiếp theo

Hình 3.1: AND tổng số của 38 giống lúa nghiên cứu

3.2 Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi

Phân tích 30 cặp mồi SSR trên tập đoàn 38 giống lúa chịu mặn thu được tổng số

1128 băng ADN thuộc 156 loại allele khác nhau Cả 30 cặp mồi đều cho các locus đahình, trong đó có 3 cặp mồi chỉ thu được 2 allele, 2 cặp mồi thu được 3 allele, 7 cặp mồi

thu được 4 allele, 6 cặp mồi thu được 5 allele, 4 cặp mồi thu được 6 allele, 3 cặp mồi thuđược 7 allele, 4 cặp mồi thu được 8 allele và 1 cặp mồi thu được 9 allele (bảng 3.1)

Bảng 3.1: Số allele thể hiện và hệ số PIC của 30 cặp mồi SSR

TT cặp mồi Tên

Vị trí gắn mồi

Số allele

Vị trí gắn mồi

Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được coi là thước đo tính đa hình

của các allele ở từng locus SSR Số liệu ở bảng 3.1 cho thấy: Tập đoàn lúa chịu mặn bảnđịa của Việt Nam rất đa dạng về thành phần các allele ở những locus gen nghiên cứu Hệ

số PIC của 30 cặp mồi thay đổi từ 0,145 (ở cặp mồi chỉ xuất hiện 2 loại allele - RM345)đến 0,842 (ở cặp mồi xuất hiện 8 loại allele - RM337) Hệ số PIC trung bình của 30 cặpmồi nghiên cứu khá cao là 0,661 Kết quả này tương tự với một số kết quả nghiên cứutrên các tập đoàn lúa địa phương ở Việt Nam và trên thế giới Kết quả sử dụng 12 cặp mồiSSR để đánh giá đa dạng di truyền các giống lúa của Ấn Độ, Raj (2006) đã chỉ ra hệ sốPIC dao động từ 0 đến 0,830 [15] Tác giả Jayamani (2007) khi đánh giá đa dạng ditruyền của 179 giống lúa ở 19 địa phương của Bồ Đào Nha bằng các chỉ thị SSR cũng đãchỉ ra hệ số PIC dao động từ 0,179 đến 0,894 [7] McCouch (2005), khi nghiên cứu đadạng di truyền giữa 52 giống lúa thơm Basmati và 17 giống lúa khác của Ấn Độ bằng 30