nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu mặn của việt nam bằng chỉ thị ssr

Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn cóhiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Lúa gạo là cây lương thực quan trọng đối với con người Trên thế giới cây lúađược xếp vào vị trí thứ hai sau cây lúa mì về diện tích và sản lượng Ở Châu Á, lúa gạođược coi là cây lương thực quan trọng nhất, chiếm diện tích 135 triệu ha trong tổng số148,4 triệu ha trồng lúa của toàn thế giới Trong tương lai, xu thế sử dụng lúa gạo sẽcòn tăng hơn vì đây là loại lương thực được sử dụng khá phổ biến, dễ bảo quản, dễ chếbiến và cho năng lượng khá cao

Theo tính toán của Peng và cộng sự, đến năm 2030 sản lượng lúa của thế giớicần phải đạt 800 triệu tấn mới có thể đáp ứng được nhu cầu lương thực của con người[52] Với tình hình dân số tăng nhanh, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lươngthực Theo một nghiên cứu của Lobell, đến năm 2030 sản lượng lương thực ở châu Á

sẽ giảm khoảng 10%, đặc biệt là sản phẩm lúa gạo [38] Nguyên nhân năng suất và sảnlượng lúa gạo giảm đi do ảnh hưởng bởi thiên tai, sâu bệnh và các yếu tố môi trường.Trong đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất nhiễm mặn Trên thế giới, đất trồng trọt

bị ảnh hưởng mặn ước khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 tổng diện tích đất canh tác [3]

Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng nămnhững vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển.Theo số liệu thống kê, diện tích đất ngập mặn năm 1982 là 494.000 ha, đến năm 2000

là 606.792 ha [9] Theo báo cáo mới nhất của Cục trồng trọt, tại đồng bằng sông CửuLong, xâm ngập mặn đã ảnh hưởng đến 620.000 ha/1.545.000 ha lúa đông xuân 2009-

2010, chiếm 40% diện tích toàn vùng (tại các tỉnh ven biển như Tiền Giang, Trà Vinh,Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang và Bến Tre) Trong đó, diện tích có nguy

cơ bị xâm ngập mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha, chiếm 16% diện tích canh táclúa của các tỉnh trên Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiệntượng băng tan ở hai cực, nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp venbiển Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn chochiến lược phát triển sản lượng lúa gạo và là một thử thách lớn của mục tiêu đảm bảo

an ninh lương thực và xuất khẩu lúa gạo của Việt nam Chính vì vậy, việc chọn tạogiống lúa chịu mặn đang được đặt ra là hết sức cấp bách và cần thiết

Trong tập đoàn quĩ gen lúa của Việt Nam có rất nhiều nguồn gen lúa chịu mặnthích nghi với điều kiện sinh thái ở các địa phương khác nhau, nhưng chưa đượcnghiên cứu và đánh giá một cách đầy đủ Hầu hết các giống chịu mặn có năng suất cònrất thấp Một số giống lúa được cải tiến, lai tạo và chọn lọc vẫn chưa đáp ứng được

nhu cầu của sản xuất Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng

di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu mặn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR”

nhằm cung cấp các thông tin về các nguồn gen lúa chịu mặn phục vụ công tác bảo tồn

và chọn tạo giống lúa chịu mặn

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của tập đoàn giống lúa chịu mặn bản địacủa Việt Nam ở mức phân tử và xác định mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen ởcác địa phương khác nhau phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệuquả các nguồn gen lúa chịu mặn bản địa của Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Hiểu biết về đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa chịu mặn tạo cơ sở lý luậncho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa chịumặn trong sản xuất

Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chịu mặn có ý nghĩa quan trọngtrong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồngen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảotồn đa dạng nguồn gen lúa chịu mặn ở mức phân tử

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng:

Đối tượng nghiên cứu là cứu là tập đoàn 38 giống lúa có đặc tính chịu mặnđược thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảotồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngânhàng gen của Viện Lúa đồng bằng sông Cửa Long

4.2 Phạm vi nghiên cứu:

Đề tài nghiên cứu, đánh giá nguồn gen ở mức phân tử bằng chỉ thị SSR; Các thínghiệm được tiến hành tại Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di Truyền Nông nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của cây lúa

Tổ tiên cây lúa đã tồn tại từ đầu kỷ Phấn trắng Vào giữa kỷ này, xuất hiện

một trong những loại nguyên thuỷ nhất thuộc tộc Oryzae, đó là loại Streptochasta Schrad Đến cuối kỷ Phấn trắng xuất hiện loại tre (Bambusa) và loại lúa (Oryza).

Một số loại khác xuất hiện muộn hơn vào kỷ thứ ba, thời kỳ phát triển mạnh nhất

của họ Hoà thảo (Gramineae) Các loài lúa Oryza spp có cùng tổ tiên chung vào

thời địa cầu Gondwanaland, sau khi trái đất tách rời thành năm lục địa cách đâykhoảng 85-90 triệu năm [4]

Theo Chang, lúa trồng Oryza sativa được tiến hoá từ cây lúa dại hàng năm Oryza nivara Do thích ứng với điều kiện khí hậu, đặc biệt là nhiệt độ, lúa Oryza sativa lại tiếp tục tiến hoá làm ba nhóm: Indica thích hợp với khí hậu nhiệt đới, Japonica thích ứng với khí hậu lạnh và cho năng suất cao và Javanica có đặc tính trung gian [18]

Theo Oka (1988) lại cho rằng Oryza sativa có nguồn gốc từ cây lúa dại lâu năm Oryza rufipogon [50]

Tác giả Cheng khi nghiên cứu di truyền tiến hoá của 101 giống lúa, bao gồm cả lúa

trồng và lúa dại cho thấy loài lúa trồng Oryza sativa chia thành hai nhóm tương ứng với hai loài phụ là Indica và Japonica Trong khi đó Oryza rufipogon chia thành bốn nhóm, một nhóm là Oryza rufipogon hàng niên và ba nhóm Oryza rufipogon đa niên Kết quả cho thấy các giống lúa Japonica có quan hệ gần gũi với một nhóm Oryza rufipogon đa niên, còn các giống lúa Indica có quan hệ gần với nhóm lúa Oryza rufipogon hàng niên [20]

Ở châu Phi cả hai loài lúa dại Oryza longistaminata (đa niên) và Oryza brevigulata (hàng niên) đều hiện diện, vì vậy, nhiều tác giả cho rằng Oryza breviligulata là nguồn gốc của Oryza glaberrima [4].

Hiện nay, nhiều chuyên gia lúa gạo đồng ý rằng lúa glaberrima và lúa sativa

có cùng chung nguồn thủy tổ vào thời kỳ lục địa nguyên thuỷ Gondwanaland,

nhưng sau khi các lục địa tách rời nhau, lúa sativa và glaberrima tự tiến hoá từ các

loài lúa dại bản địa ở hai châu lục là châu Á và châu Phi (Khush, 1997) [36]

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hoá của hai loài lúa trồng (Khush, 1997) [36]

Việc thuần hoá cây lúa diễn ra ở bán đảo Trung Ấn và được bắt đầu khoảng10.000 - 15.000 năm trước, còn cây lúa trồng đã xuất hiện ở châu Á cách đây khoảng8.000 năm [19,39]

Theo tác giả Chang thì O sativa được thuần hóa ở Nam Himalaya, vùng núi

Đông Nam Á và Đông Nam Trung Quốc

Từ trung tâm phát sinh, cây lúa theo thời gian đã được di thực đi nhiều vùngsinh thái mới Qua quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo, cây lúa có khả năngthích nghi ngày càng rộng Hiện nay, cây lúa được trồng trong những điều kiệnsinh thái và khí hậu rất khác nhau Lúa được trồng ở Tây Bắc Trung Quốc (50o vĩBắc), ở miền Trung Xumatra trên đường xích đạo và ở cả New South Wales, châu

Úc (35o vĩ Nam) Lúa cũng được trồng từ những vùng thấp hơn mực nước biển, ởKerala (Ấn Độ) đến những vùng có độ cao 2000 mét ở Kasmia (Ấn Độ) và có thểtrồng trên cạn hoặc điều kiện nước sâu tới 1,5 - 5 mét [8]

1.1.2 Phân loại

Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima Loài Oryza sativa là lúa trồng ở châu Á và Oryza glaberrima là lúa trồng ở châu Phi Năm

1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi Oryza gồm tất cả 19 loài [4]

Morinaga là người đầu tiên đã sử dụng kỹ thuật phân tích genome để định danhcác loài lúa dại Công trình nghiên cứu dựa trên cơ sở khoa học này đã giúp phân tíchcác loài lúa được chính xác hơn [4]

Hội nghị Di truyền lúa Quốc tế họp tại Philippines năm 1963 đã thống nhất

chia chi Oryza thành 19 loài Tại Hội nghị di truyền lúa Quốc tế tiếp theo ở Viện nghiên cứu lúa Quốc tế tại Philippines (năm 1967) lại khẳng định chi Oryza có 22 loài

trong đó có 20 loài lúa dại và hai loài lúa trồng [19]

Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New Ginea là

loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia thành bốn nhóm

genome Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài ở Bảng 1.1(Vaughan, 1994) [62]

Ngày nay, các nhà phân loại học đều nhất trí là chi Oryza có 23 loài trong đó 21 loài hoang dại và hai loài lúa trồng là Oryza sativa và Oryza glaberrima thuộc loại nhị bội 2n = 24 có bộ gen AA Loài Oryza glaberrima phân bố chủ yếu ở Tây và Trung Phi còn loài Oryza sativa được gieo trồng khắp thế giới và được chia thành hai loài phụ

là Indica và Japonica

Tác giả Vitte cũng cho rằng hai loài phụ Indica và Japonica được phân hoá độc

lập với nhau, cách đây khoảng 200.000 năm [63] Trong khi đó tác giả Jianxin dựa vào

kết quả phân tích ADN nhân tế bào lại cho rằng lúa Indica và lúa Japonica được tách

ra từ một tổ tiên chung, cách đây khoảng 440.000 năm [34]

Theo Tateoka (1963, 1964) Oryza được phân thành 22 loài Trong đó, tác giả cũng thống nhất 2 loài lúa trồng O sativa L và O glaberrima Steud, nhưng xem dạng lúa Châu Phi (O perennis Moench) như là một loài riêng, dạng lúa Châu Á và Châu

Mỹ thuộc về loài O rufipogon Griff Tateoka cũng bổ sung 2 loài mới là O longiglumis Jansen và O angustifolia Hubbard (Bảng 1) [59,60]

Bảng 1.1 Các loài Oryza theo Takeoka (1963) với số nhiễm sắc thể,

kiểu gen và phân bố địa lý

Nhóm Oryzae

breviligulata A Chev et Roehr 24 AA Châu Phi

punctata Kotschy 24, 48 BB, BBCC Châu Phi

Nhóm Angustifoliae

brachyantha A Chev et Roehr 24 FF Châu Phi

Nhóm Coarctatae

Nguồn: Oka, 1988

Bảng 1.2 Đặc trưng hình thái và sinh lý tổng quát của 3 nhóm giống lúa

Thân - Thân cao - Thân cao trung bình - Thân thấp

Chồi - Nở bụi mạnh - Nở bụi thấp - Nở bụi trung bình

- Trấu có lông dài

- Tính quang cảm rất thayđổi

Nguồn: Chang, 1965

Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm hơn 1/10 diện tích đất trồng trọt trên thếgiới và có 15 nước trên thế giới trồng lúa với diện tích hơn hơn 1 triệu ha (trong đó cótới 13 nước thuộc Châu Á) Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tíchtrồng lúa và 56% sản lượng lúa toàn cầu Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi nướcđều có diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mĩ Latinh Cả châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam,nhưng sản lượng lúa lại thấp hơn Việt Nam từ 2-3 lần [12]

1.2 Đất nhiễm mặn

Đất mặn được xem là một trong những vấn đề cần quan tâm trên thế giới, bởi

nó ảnh hưởng rất lớn đến diện tích và năng suất cây trồng Tính chất vật lý và hoá họccủa đất mặn rất đa dạng, biến thiên tuỳ thuộc vào nguồn gốc của hiện tượng mặn, độ

pH của đất, hàm lượng chất hữu cơ trong đất, chế độ thuỷ văn và nhiệt độ [24]

Đất mặn chứa một lượng muối hoà tan trong nước ở vùng rễ cây, làm ảnhhưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây trồng Mức độ gây hại của đất mặn tuỳ thuộcvào loài cây trồng, giống cây, thời gian sinh trưởng, các yếu tố môi trường đi kèm vàtính chất của đất Do đó, người ta rất khó định nghĩa đất mặn một cách chính xác vàđầy đủ Hội Khoa học Đất của Mỹ (SSSA) đã xác định đất mặn là đất có độ dẫn điện(EC) lớn hơn 2 dS/m, không kể đến hai giá trị khác: tỉ lệ hấp thu sodium (SAR) và pH

Tuy nhiên, hầu hết các định nghĩa khác đều chấp nhận đất mặn là đất có độ dẫn điện

EC cao hơn 4 dS/m ở điều kiện nhiệt độ là 250C, tỉ lệ phần trăm sodium trao đổi ESPkém hơn 15, và pH nhỏ hơn 8,5 [6]

Đất mặn khá phổ biến ở vùng sa mạc và cận sa mạc Muối tích tụ và mao dẫnlên, chảy tràn trên mặt đất theo kiểu rửa trôi Đất mặn có thể phát triển ở vùng nóng

ẩm, cận nóng ẩm trên thế giới trong điều kiện thích hợp như vùng ven biển; hoặc mặn

do nước biển xâm nhập khi triều cường, lũ lụt; hoặc mặn do nước thấm theo chiềuđứng hay chiều ngang từ thủy cấp bị nhiễm mặn [53]

Đất bị ảnh hưởng mặn chiếm 7% diện tích đất toàn thế giới (ước tính hơn 1 tỷha) Đất bị ảnh hưởng mặn ở đại lục thuộc châu Âu và Bắc Mỹ rất ít có khả năng trồngtrọt Ở châu Phi và Nam Mỹ, khoảng 30% đất bị nhiễm mặn có khả năng trồng trọt Ởchâu Á, hơn 80% đất bị ảnh hưởng mặn có khả năng trồng trọt và đã được khai tháccho sản xuất nông nghiệp Hiện tượng đất nhiễm mặn là mối đe dọa lớn nhất đến việcgia tăng sản lượng lúa gạo [24]

1.3 Các vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, do tác động của biển, các vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu ở haivùng châu thổ lớn là đồng bằng sông Hồng (ĐBSH) và đồng bằng sông Cửu Long(ĐBSCL) Ảnh hưởng của nước biển ở vùng cửa sông và đất liền ở ĐBSH chỉ khoảng

15 km, nhưng ở vùng ĐBSCL có thể xâm nhập tới 40-50 km Nhóm đất mặn có diệntích khoảng 1 triệu ha Căn cứ vào nồng độ muối hoà tan với tỷ lệ clo trong đó, HộiKhoa học Đất Việt Nam chia đất mặn ra theo bảng sau

1.3.1 Vùng lúa nhiễm mặn ở vùng đồng bằng sông Hồng

Ở đồng bằng sông Hồng trong mùa khô, sự xâm nhập mặn trở nên phổ biến đãảnh hưởng xấu đến sản xuất nông nghiệp, làm trở ngại cho nuôi trồng thủy hải sản

Các con sông bị xâm nhập mặn hàng năm là rất lớn (bảng 1.4)

Các vùng lúa nhiễm mặn ở ĐBSH thuộc các tỉnh: Thái Bình, Hải Phòng, NamĐịnh, Ninh Bình, Thanh Hóa Một số vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị nhiễm mặnkhoảng 20.000 ha ở cả hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm nhiễm từ0,3-0,5%, chủ yếu tập trung tạo các huyện: Kiến Thuỵ, Tiên Lãng, Thủy Nguyên, VĩnhBảo Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000 ha nhiễm mặn chủ yếu ở các huyện Thái Thụy,Tiền Hải, Kiến Xương Tỉnh Nam Định có khoảng 10.000 ha chủ yếu ở các huyệnNghĩa Hưng, Xuân Trường, Giao Thủy Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000 ha đấtnhiễm mặn ở các huyện Hậu Lộc, Nga Sơn, Hoằng Hóa, Hà Trung riêng huyện HậuLộc có 8.000 ha do nước biển tràn vào sau mùa lũ năm 2005 [3]

Bảng 1.4 Tình hình xâm nhập mặn một số con sông ở châu thổ sông Hồng

Tên sông 0,1 L max.(km)* 0,1 L min.(km) 0,4 L max.(km)

272218158101115

121286321010 Nguồn: Chu Đinh Hoàng, 1993

* 0,1%; 0,4% = độ mặn; Lmax = chiều dài xâm nhập tối đa;

Lmin = Chiều dài xâm nhập tối thiểu

Dọc theo ven biển các tỉnh miền Trung đất cũng bị nhiễm mặn như Hà Tĩnh cókhoảng 17.919 ha, Quảng Bình có hơn 9.300 ha bị nhiễm mặn và Ninh Thuận có gần2.300 ha đất bị nhiễm mặn

1.3.2 Vùng lúa nhiễm mặn ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

Diện tích tự nhiên khoảng 3,96 triệu ha, chiếm 12% diện tích cả nước, đồngbằng sông Cửu Long giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Đây làvùng đất có ưu thế lớn về nông nghiệp với diện tích đất sản xuất nông nghiệp khoảng2,9 triệu ha (sản lượng lương thực chiếm 50% tổng sản lượng lương thực của cả nước)[1] Theo Trần Thanh Cảnh (1998), vùng ĐBSCL có các nhóm đất chính sau: (1) Đấtphù sa có diện tích khoảng 1.180.000 ha, chiếm 30,1% diện tích toàn vùng; (2) Đất

phèn mặn có diện tích khoảng 1.600.000 ha, ước tính 40,7% diện tích toàn vùng; (3)Đất mặn có diện tích là 744.000 ha, chiếm 18,9%, có độ phì tự nhiên cao nhưng bịnhiễm mặn nên việc tăng vụ, tăng năng suất trong sản xuất bị hạn chế; (4) Đất xám códiện tích khoảng 134.656 ha, chiếm 3,4% bao gồm đất xám trên phù sa cổ, đất xámđọng mùn gley trên phù sa cổ Toàn bộ diện tích tự nhiên của 8 tỉnh ven biển đồngbằng sông Cửu Long là 2,86 triệu ha, trong đó được phân bố ra 4 loại đất: phù sa cổ,phù sa mới, đất mặt acid và đất mặn (hình 1.2)

Hình 1.2 Sự Phân bố tình trạng đất ở đồng bằng sông Cửu long

Do ảnh hưởng của thủy triều, nước mặn từ biển thường tràn vào sâu trong đấtliền vào mùa khô Các vùng lúa ven biển ĐBSCL thuộc các tỉnh: Sóc Trăng, Bến Tre,Tiền Giang, Trà Vinh, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang đều bị nhiễm mặn, nhiều hay íttùy thuộc vào ảnh hưởng của thủy triều và hệ thống kênh ngòi, đê ngăn mặn của từngvùng Độ mặn lớn nhất trong sông theo quy luật thường xuất hiện trùng với kỳ triềucường trong tháng, nước biển mặn vào sâu trong đất liền ở các vùng triều mạnh và có

ít nước thượng nguồn đổ về Do vậy, mức độ xâm nhập mặn tùy thuộc vào sự xâmnhập của nước biển và tùy vào mùa trong năm Cao điểm vào các tháng có lượng mưathấp, khoảng tháng 3-4 dương lịch [12]

Trước đây, diện tích bị xâm nhập mặn ở vùng ven biển ĐBSCL ở mức 1g/l là2,1 triệu ha, mức 4 g/l là 1,7 triệu ha Gần đây, diện tích này đã giảm và đang biến đổi

do sự phát triển hạ tầng thủy lợi Qua chuỗi số liệu thực đo 10 năm (1991-2000) ởĐBSCL, Lê Sâm đã phân tích diễn biến nồng độ mặn, xác định đường đẳng trị mặnứng với các trị số: 0,4 g/l, 2 g/l, 4 g/l, 16 g/l theo thời gian từng tháng trong mùa khô,tìm ra diễn biến mặn trung bình tháng 4 (tháng có nồng độ mặn cao nhất trong năm)trong thời gian 10 năm diện tích bị xâm nhập mặn >0,4 g/l là 2.126.635 ha (bảng 1.5)[6]

Bảng 1.5 Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL trung bình tháng 4 (1991-2000)

STT Khu vực Độ mặn (g/l) Diện tích (ha) Tỷ lệ (%)

và tiềm ẩn các hậu quả xấu về môi trường

1.4 Tính chống chịu mặn của cây lúa

Đối với cây lúa, tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổitheo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây [28] Tính trạng bất thụ của bông lúakhi bị stress do mặn được điều khiển bởi một số gen trội, nhưng các gen này khôngtiếp tục thể hiện ở các thế hệ sau Phân tích diallel về tính trạng chống chịu mặn, người

ta ghi nhận cả hai hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính với hệ số di

truyền thấp (19,18%) và ảnh hưởng của môi trường rất lớn [54]

Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến độngrất khác nhau giữa các giống lúa Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn cóhiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọngiống Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởnghoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyềntính chống chịu mặn [25]

Hiện nay, chúng ta có rất ít thông tin về kiểu hình chống chịu mặn ở giai đoạntrưởng thành của cây lúa Hầu hết các thí nghiệm đều được tiến hành trên giai đoạn mạvới quy mô quần thể hạn chế và chỉ số Na/K thường được dùng như một giá trị chỉ thị[28,44] Cây lúa nhiễm mặn có xu hướng hấp thu Na nhiều hơn cây chống chịu.Ngược lại, cây chống chịu mặn hấp thu K nhiều hơn cây nhiễm Ngưỡng chống chịuNaCl của cây lúa là EC = 4 dS/m [44] Trong quá trình bị nhiễm mặn, nồng độ ion K+trong tế bào được điều tiết tương thích với cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và khảnăng tăng trưởng tế bào Nhiều loài thực vật thuộc nhóm halophyte và một phần củanhóm glycophyte thực hiện hoạt động điều tiết áp suất thẩm thấu làm cản trở ảnhhưởng gây hại của mặn Hoạt động này sẽ giúp cây duy trì một lượng lớn K+ và hạnchế hấp thu Na+ [45]

1.4.1 Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa

Ảnh hưởng của mặn đến hoạt động sinh trưởng và phát triển của cây lúa, ở từnggiai đoạn khác nhau thì mức độ thiệt hại khác nhau [54] Nhưng việc khám phá ra cơchế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dưới những điềukiện ngoại cảnh kiểm soát được Do đó, để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chếchống chịu mặn của cây lúa phải chia ra nhiều giai đoạn về sự sinh trưởng và pháttriển Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa được biết thông qua nhiều công trình nghiêncứu [45]

Nhiễm mặn gây tổn hại đến cây lúa là do mất cân bằng thẩm thấu và tích lũyquá nhiều ion Cl- [44] Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng nguyên nhân

gây tổn hại cho cây lúa trong môi trường mặn là do tích lũy qúa nhiều ion Na+, ion nàytrực tiếp gây độc trên cây.

Ion Na+ có tác động phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất trong cây.Ion K+ có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tínhchống chịu mặn của cây Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na-K trong cây sẽ làm giảmnăng suất hạt Do vậy, cây lúa chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu

Na+ và gia tăng hấp thu K+ để duy trì sự cân bằng Na-K trong chồi [53]

Theo Gregorio và cs, mặn gây hại trên cây lúa bắt đầu bằng triệu chứng giảmdiện tích lá, những lá già nhất bắt đầu cuộn tròn và chết, theo sau đó là những lá già kếtiếp và cứ thế tiếp diễn Cuối cùng, những cây sống sót có những lá già bị mất, những

lá non duy trì sự sống và xanh Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lượng khô có xuhướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá.Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lượng khô của chồi và rễ suy giảm tươngứng với mức độ thiệt hại [30]

Nhiều nghiên cứu còn cho thấy rằng, cây lúa chống chịu mặn trong suốt giaiđoạn nẩy mầm lại trở nên rất nhiễm trong giai đoạn mạ non (giai đoạn 2-3 lá), sau đóchống chịu trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, rồi lại nhiễm trong suốt giai đoạnthụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chống chịu hơn trong giai đoạn chín [50,56].Theo một nghiên cứu khác của Aslam và cs (1993), thấy rằng tại giai đoạn trổ bôngcây lúa không mẫn cảm với mặn [16]

Theo Yeo và Flowers (1984) [66], những thay đổi sinh lý của cây lúa liên quanđến tính chống chịu mặn được tóm tắt như sau:

- Cây lúa không hấp thu (hoặc hạn chế ở mức rất thấp) lượng muối dư thừa nhờhiện tượng hấp thu có chọn lọc

- Cây lúa hấp thu lượng muối thừa nhưng tái hấp thu lại trong mô libe, do đó

Na+ không di chuyển đến chồi thân

- Sự vận chuyển của Na+ từ rễ đến chồi là rất thấp

- Lượng muỗi hấp thu thừa sẽ được vận chuyển đến các lá già và được giữ lạitại đó

- Tăng tính chống chịu của cây lúa do lượng muối hấp thu dư thừa sẽ được giữlại tại các không bào, làm giảm mức gây hại đến quá trình sinh trưởng của cây lúa

- Cây làm loãng nồng độ muối dư thừa nhờ tăng tốc độ sinh trưởng và gia tănghàm lượng nước trong chồi

Tất cả những cơ chế trên đều nhằm hạ thấp nồng độ Na+ trong các mô chứcnăng, do đó làm giảm tỉ lệ Na+/K+ trong chồi (<1)

Theo Yeo và Flowers, hầu hết tất cả các giống lúa đều bị ảnh hưởng rõ rệt ởnồng độ 50 mol NaCl/m3 trong giai đoạn mạ (14 ngày), thời gian làm cho 50% số cáthể chết tại nồng độ mặn này thay đổi từ 9 đến 60 ngày tùy theo giống lúa Vì vậy, môitrường có nồng độ 50 mol NaCl/m3 dung dịch được xem như một môi trường hữudụng để thanh lọc mặn cây lúa [66]

Ở cây lúa, hàm lượng muối đi vào chồi được điều chỉnh rất thấp Điều này cóthể là do sự hấp thu chọn lọc rất hiệu quả đối với K+ Một khả năng khác là ion Na+được hấp thu với hàm lượng lớn nhưng lại được hấp thu lại trong nhựa xylem trongnhững phần của đầu rễ hoặc chồi và sau đó được dự trữ hoặc được chuyển trở lại đất[66] Theo Aslam và cs (1993), khi cây lúa được đặt trong dung dịch NaCl, hàm lượngsodium, calcium, kẽm, phosphorus và chloride đều gia tăng, trong khi hàm lượngpotasium và magnesium đều giảm trong nhựa của chồi Khả năng chống chịu mặn củacác giống lúa cao hay thấp có quan hệ với hiệu quả ngăn chặn Na+ và Cl- vào cây Sosánh khả năng hấp thu lựa chọn K+ cho thấy rằng, đã có sự khác nhau lớn giữa cácgiống lúa về khả năng hấp thu chọn lọc K+ trong môi trường

Theo Zhu (2001), ion K+ tham gia làm tăng hoạt hóa một số enzyme ở tế bàothực vật và tỷ lệ “Na+/K+” thấp hay đúng hơn là hàm lượng K+ trong dung dịch củachồi lúa xác định tính chống chịu mặn của những dòng lúa khác nhau [47] Người tacòn thấy vai trò của kẽm (Zn) trong chồi có liên quan đến tính chống chịu mặn của câylúa khi hàm lượng Zn trong chồi của giống NIAB6 cao, tính chống chịu mặn cao.Muhammad và cs (1987) cũng đã chứng minh rằng, ở giống chống chịu mặn KS282,nồng độ của Zn cao hơn so với dòng nhiễm IR28 Vai trò của Zn khi tham gia vào tínhchống chịu mặn có thể là do nó làm gia tăng hàm lượng N trong chồi [44] Điều nàydẫn tới việc sinh trưởng nhanh hơn và năng suất lúa cao hơn trong điều kiện mặn Như

vậy, có sự liên quan giữa tính chống chịu mặn của cây với sự ngăn chặn hiệu quả cácion Na+, Cl- đồng thời, hấp thu ưu tiên và có chọn lựa các ion K+ và Zn2+ để có tỷ lệ K+/

Na+ và Zn/P phù hợp [16]

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, các giống lúa chống chịu mặn sẽ duy trìnồng độ Na+ và Cl- thấp, nồng độ của K+ và Zn2+ cao hơn và tỷ lệ Na+/K+ thấp trongmầm lúa Kết quả phân tích trên một số giống lúa chịu mặn như Pokkali, SR26B vàgiống nhiễm mặn điển hình như IR28, IR29 cho thấy: tỷ lệ Na+/K+ trong giống pokkalirất thấp (0,397) và giống SR26B (0,452) trong khi đó rất cao ở IR28 (0,652) và IR29(0,835) [53]

Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ, trongdung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn EC = 12 dS/m, các yếu tố môi trường đượckiểm soát trong 19 ngày Kết quả cho thấy, sự tăng khả năng hấp thu K+ là duy trì tốt

tỷ lệ cân bằng Na+/K+ trong chồi Tỷ lệ này được kiểm soát bởi hiệu quả gen cộng vàgen trội Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối tương quan giữa số lượng muối được đivào rễ cây với nồng độ muối trên chồi Sự tương quan này đã được xác định bởi mốiquan hệ giữa tốc độ sinh trưởng của chồi với sự di chuyển thực của những ion ngoài

rễ Giá trị này là số lượng thực của những ion được di chuyển tới chồi trên đơn vịtrọng lượng của rễ trong một đơn vị thời gian

Quan sát kiểu chết của lá lúa trong điều kiện nhiễm mặn cho chúng ta thấyrằng, có sự khác nhau về hàm lượng Na+ trong những lá khác nhau, tại bất cứ thời giannào Những lá già bị chết trong khi những lá non hơn vẫn giữ màu xanh và sinhtrưởng Đây là đặc điểm đặc trưng nhất trong cơ chế chống chịu mặn ở họ hòa thảo.Cây lúa là một tập hợp gồm lá cây, đốt, bộ rễ, những nhánh có khả năng sống độc lậpđược tách ra Dạng sinh trưởng này giúp cây một lá mầm tự hủy những phần, bộ phậncủa cây dễ dàng hơn so với những cây hai lá mầm Vì vậy, rụng lá là một hiện tượngthông thường ở những cây một lá mầm có khả năng chống chịu mặn Do đó, khi phântích trên những lá lúa sống trong môi trường mặn cho thấy rằng: có sự chênh lệch hàmlượng muối từ lá này tới lá khác, muối luôn được tích lũy với nồng độ cao trong những

lá già và hiện tượng chết của những lá già là một cơ chế loại muối ra khỏi cơ thể Tất

cả những cơ chế này đều nhằm hạ thấp nồng độ Na+ trong các mô chức năng, do đó

giảm tỷ lệ Na+/K+ trong chồi Tỷ lệ Na+/K+ trong chồi được xem như là chỉ tiêu chọnlọc giống lúa chống chịu mặn Mỗi một giống lúa đều có một hoặc hai cơ chế chốngchịu mặn nêu trên Phản ứng của cây trồng đối với môi trường mặn rất phức tạp, làtổng hợp của nhiều yếu tố riêng lẻ [66]

1.4.2 Nghiên cứu di truyền về giống lúa chống chịu mặn

1.4.2.1 Nghiên cứu di truyền số lượng về tính chống chịu mặn của cây lúa

Rất nhiều nghiên cứu cho rằng: yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến độngrất khác nhau giữa các giống lúa Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn cóhiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọngiống Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởnghoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyềntính chống chịu mặn [25]

Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn giai đoạn mạ của cây lúatrong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao (EC = 12 dS/m) trongmôi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, người ta thấy rằng, tính trạng chiềudài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, khối lượng khô của chồi và rễ thể hiện sựkhác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chống chịu và giống nhiễm, tính trạng nàychủ yếu được điều khiển do hoạt động của một nhóm gen cộng tính Hệ số di truyềntính chống chịu thông qua các tính trạng này rất thấp [61]

Theo Mishra và cs (1990), trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính trạngchiều cao cây, năng suất, trong điều kiện mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính[42]

Do ảnh hưởng rất lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rấtthấp trong các tính trạng Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ Gregorio và Senadhira(1993) cho rằng: có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương trình ưu thế lai.Nghiên cứu về di truyền số lượng tính chống chịu mặn thông qua lai diallel 6 x 6, năngsuất thể hiện hoạt động của một nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong điều kiệnbình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn Năng suất lúa bịgiảm là do ảnh hưởng của mặn Trong một số giống lúa, ưu thế hoạt động của gen

cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống cho môi trườngmặn [30]

Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và cs (1996) cho rằng, chiều dàibông và khối lượng hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi trường, nếu như chọngiống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này sẽ không hiệu quả Khối lượng bông,

số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có hệ số path rất cao trong môi trường mặn Chính

ba tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trườngmặn [42] Thêm nữa, theo nghiên cứu của Narayanan và cs (1990), số hạt chắc trênbông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng suất của các giống lúatrong những vùng đất bị nhiễm mặn [46]

1.4.2.2 Nghiên cứu di truyền phân tử về tính chống chịu mặn của cây lúa

Bản đồ QTL (Quantitative Trait loci) được áp dụng trong trường hợp những

tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (tính chống chịu mặn, hạn, lạnh, ) Ditruyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt gắnvới tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kếtcủa nó với những gen khác Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng markerphủ trên toàn bộ nhiễm sắc thể trong hệ gen cây trồng có thể cung cấp cho chúng tacông cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gentrên những nhiễm sắc thể và xác định các gen mục tiêu liên kết với gen khác

Teng (1994) đã sử dụng quần thể cận giao tái tổ hợp (RI) thế hệ F8 bao gồm

324 cá thể thuộc tổ hợp lai giữa IR29/Nona Broka để nghiên cứu di truyền tính chốngchịu mặn của cây lúa Các dòng RI được thanh lọc mặn trong nhà lưới ở điều kiện EC

= 15 dS/m và điều kiện đồng ruộng Phân tích RFLP với 5 enzyme phân cắt hạn chế

(DraI, EcoRV, HindIII, ScaI, XbaI) cho thấy trong 266 RFLP marker, có 117 RFLP

marker thể hiện đa hình (43,98%), phủ trên hệ gen cây lúa với mật độ 15 cM/quãng.RG100 và RZ323 được ghi nhận cho đa hình rõ nhất Có13 marker định vị gần RG100

và RZ323 trên nhiễm sắc thể số 3 cũng được sử dụng để xem xét liên kết gen Phântích ANOVA một chiều chứng minh Nona Broka mang allele (allele) kháng liên kếtvới RG100 và RZ323 tại các loci số lượng Khi phân tích ANOVA hai chiều, tác giảphát hiện thêm RZ323 (trên nhiễm sắc thể số 3) và RG333 (trên nhiễm sắc thể số 8)

liên kết với QTL chống chịu mặn Các cá thể tái tổ hợp mang allele từ Nona Broka ởlocus RZ323 và từ IR29 ở locus RG333 có kiểu hình sống sót lâu hơn trong môitrường mặn so với những tổ hợp khác [61]

Bản đồ QTL (trên cơ sở AFLP và STS marker) cho thấy gen chủ lực điều khiểntính trạng chống chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số 1 (saltol) Bên cạnh gen chủlực, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng hấp thu K cao, 4 QTL có quan hệvới tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan hệ với tính trạng tỷ số Na/K thấp.Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số 1, 3, 4, 10 và 12 [14, 23, 33]

Kawasaki và cs (2001) đã sử dụng kĩ thuật microarray để theo dõi sự thể hiệncủa phân tử transcript và từng quá trình thể hiện gen điều khiển tính chống chịu mặntrong cây lúa Trên cơ sở thư viện cDNA ly trích từ rễ lúa và bộ marker EST của hệgen cây lúa chống chịu mặn pokkali, người ta đã áp dụng kỹ thuật microarray để kiểmsoát những transcript trong việc so sánh với nghiệm thức không xử lý mặn, thời gianthay đổi từ 15 phút đến 1 tuần lễ trong điều kiện gây mặn nhân tạo Vật liệu được sửdụng là giống lúa pokkali (chuẩn kháng) và giống IR29 (chuẩn nhiễm) Nhóm tác giảnày tập trung xem xét phản ứng đối với stress do mặn trong quần thể lai có 1782transcript dẫn suất từ rễ của cây bị xử lý mặn (NaCl ở nồng độ 150mM) Kết quả nàycho thấy một tiến trình điều tiết gen chức năng với nhiều mức đồ khác nhau củatranscript Trong giai đoạn đầu tiên, đáp ứng của IR29 chậm hơn so với pokkali Sau3-6 giờ xử lý mặn, mức độ phong phú của transcript thay đổi nhanh trong Pokkali, cònIR29 có sự suy giảm trong vòng 3 giờ đầu gây nên cái chết của giống này ngay sau đó[22]

1.5 Chỉ thị phân tử SSR và ứng dụng trong nghiên cứu, xác định gen chống chịu mặn

1.5.1 Chỉ thị phân tử SSR

Simple sequence repeat (SSR) là một trong những chỉ thị phân tử quan trọngnhất SSR marker được sử dụng rộng rãi trong dấu chuẩn phân tử ADN, lập bản đồ,MAS, và trong những nghiên cứu về đá dạng di truyền và di truyền quần thể SSR haymicrosatelites (các vi vệ tinh) là trình tự ADN lặp tồn tại trong hệ gen sinh vật, cóchiều dài khác nhau, phân bố một cách ngẫu nhiên Mỗi đơn vị lặp thường có số lượng

không vượt quá 5 nucleotit (có tài liệu nói đoạn lặp có thể có từ 1-6 nucleotit) [61] Sốlần lặp lại của mỗi đơn vị có thể từ 10 đến 100 lần Ở lúa người ta đã phát hiện ra cáckiểu trình tự lặp như: GA, GT, CAT, CTT

Các đoạn ADN nhắc lại có trình tự hai đầu rất đặc trưng Bởi vậy trình tự đặctrưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại được sử dụng để thiết kế mồi cho phản ứng PCR Do

có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại mà kỹ thuật này rất phù hợp trongnghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen Cũng giống như kỹ thuật RADP, kỹthuật SSR đơn giản, thuận tiện, không tốn kém Mặt khác, SSR là chỉ thị đồng trội nên

nó được sử dụng để phát hiện các cá thể dị hợp tử, và lập bản đồ gen khi sử dụng quầnthể F2 [5]

1.5.2 Ứng dụng của chỉ thị SSR trong xác định gen chống chịu mặn

Trên thực tế, việc chọn giống chống chịu stress mặn dựa trên kiểu hình rất khó

do có sự tương tác giữa các gen Nhờ chỉ thị phân tử mà công việc xác định gen chốngchịu mặn, chọn, tạo giống chống chịu trở lên dễ dàng, chủ động và chính xác hơn

Xác định gen kháng bằng chỉ thị phân tử nghĩa là sử dụng các chỉ thị phân tửliên kết chặt với các gen kháng và các QTLs để chọn được các cá thể mang gen khángtrong quần thể phân li Độ chính xác của phương pháp này có thể lớn hơn 99,75% khigen kháng kẹp giữa hai chỉ thị liên kết với gen kháng đó và khoảng cách di truyền từchỉ thị phân tử đến gen kháng nhỏ hơn 5cM Bằng cách chọn lọc này, các tổ hợp genkháng khác nhau được chọn lọc là dựa trên kiểu gen thay vì dựa trên kiểu hình [68]

Về cơ bản các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ di truyềnhoặc nghiên cứu sự đa dạng di truyền hoặc phân lập gen, hoặc xác định gen,… Tuynhiên, mỗi loại chỉ thị có ưu nhược điểm riêng vì thế tuỳ vào mục đích, yêu cầu vàđiều kiện cụ thể của mỗi nghiên cứu mà lựa chọn sử dụng chỉ thị nào cho thích hợp

Trong số các chỉ thị phân tử, thì SSR có nhiều ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện,nhanh, chính xác, độ đa hình cao và kinh tế

Sự phát triển của marker phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gầnđây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịumặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau Các nghiên cứu củaGregorio (1997) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất chi tiết cho QTL

“Saltol” hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng 40-65% tính chốngchịu mặn của lúa [26, 47]

Mohammadi và cs (2008) [43] thí nghiệm 33 SSR marker đa hình trên đoạnSaltol của nhiễm sắc thể số 1 nhằm xác định mức độ liên kết và hữu dụng của cácmarker này trong chọn giống chống chịu mặn Các SSR marker này được dùng để thửnghiệm trên 36 giống lúa được phân loại thành 5 nhóm: rất chống chịu, chống chịu,chịu mặn trung bình, nhiễm mặn và rất nhiễm mặn qua thanh lọc mặn nhân tạo Trong

số 33 marker, 6 marker: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412, RM493 và RM140liên kết chặt với đoạn Saltol ở vị trí 10.8-12.28 Mb Đoạn Saltol được có thể nằmtrong vị trí có chứa các marker RM8094, RM3412, RM493 Các giống lúa: IR70023,IR65858, IR69588, IR74105, IR71832, IR74099, Cherivirrupo và IR66946-3R-178-1-

1 (FL478) có sản phẩm PCR giống như sản phẩm PCR của Pokkali khi được nhân bảnbởi marker RM 8094 và cho tính chống chịu rất tốt hoặc tốt đối với mặn Do đó,marker RM8094 thể hiện liên kết thuận và chặt chẽ với tính kháng mặn ở giai đoạn

mạ Mohammadi và cs (2008) càng khuyến cáo việc sử dụng hai marker RM8094 vàRM10745 trong xác định kiểu gen của cây lúa chống chịu mặn có mang đoạn QTLSaltol trong các chương trình lai tạo giống lúa chịu mặn [43]

Hình 1.3 Đoạn gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 của lúa, vị trí xác định

của các SSR marker [46]

Lang và cs (2001) đã sử dụng 74 chỉ thị RFLP kết hợp với 91 cặp mồi SSR trênquần thể RIL F8 của tổ hợp lai Tenasai 2 / CB và đã lập được bản đồ QTL của một sốtính trạng mục tiêu liên quan đến hiện tượng chống chịu mặn ở cây lúa (Hình 1.4) [3]

Bùi Chí Bửu và cs (2000) đã sử dụng 30 SSR marker để lập bản đồ gen cho tínhchống chịu mặn của quần thể F3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28/Đốc Phụng Các tác giả đã xác định 10 SSR marker cho đa hình của các sản phẩmPCR giữa các cá thể phân ly và bố mẹ Tuy nhiên chỉ có marker RM223 liên kết vớigen chống chịu mặn với khoảng cách là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8 RM223 nhânbản đoạn ADN có kích thước 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn, từ giống ĐốcPhụng và sản phẩm PCR có kích thước 160 bp từ giống nhiễm IR28 [3] Nguyễn ThịLang và cs (2001) báo cáo marker OSR1 và RM315 liên kết với QTL cho tính chốngchịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1 [3]

1.6 Chọn tạo giống lúa chịu mặn

1.6.1 Chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới

Các quốc gia trên thế giới, đã và đang tiến hành chọn tạo và canh tác có hiệuquả một số giống lúa chịu mặn Nhiều nguồn giống lúa mùa địa phương như NonaBroka, Burarata chống chịu tốt với điều kiện mặn tương đương với giống Pokkali đãđược xác định

Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi

di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng năng suất cao, chất lượng gạo tốt,kháng một số sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô hạn,ngập úng, mặn Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, Viện nghiên cứulúa quốc tế (IRRI), từ năm 1977-1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chốngchịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2, IR9884-54-3 Năngsuất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm Những giống lúa cải tiến nàycho năng suất cao hơn những lúa cổ truyền 2 tấn/ha [53]

Gregorio và cs (2002) đã báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo ra cácbiến dị soma chống chịu mặn Từ giống lúa Pokkali (lúa mùa cao cây, cảm quang, yếu

rạ, lá dài to bản và rũ, đẻ chồi ít, gạo màu đỏ, phẩm chất gạo xấu), tác giả đã thu đượcdòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trưởngmạnh, chống chịu mặn cao như Pokkali, gạo có màu trắng và phẩm chất gạo tốt hơngiống gốc, cho năng suất cao hơn nhiều so với Pokkali Giống lúaTCCP226-2-49-B-B-

3 đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống lúa chịu mặn tại nhiều trung tâm

nghiên cứu lúa trên thế giới [27]

Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chống chịu mặnkhá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29 Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyểngen chống chịu mặn từ Pokkali và một số giống lúa mùa địa phương có tính chốngchịu mặn bằng phương pháp hồi giao vào các nguồn giống lúa cao sản thích nghi vớitừng vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt [30] Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháplai tạo truyền thống là mất nhiều thời gian Thông thường thì 6-8 lần hồi giao cầnđược thực hiện, tương đương với 3-4 năm lai tạo Một khó khăn khác thường gặptrong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên kết khá chặt chẽ giữa tính trạng chốngchịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn, thường được lai chuyển vào conlai cùng lúc Các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đếnbiểu hiện của con lai Do đó, lai tạo cho tính trạng chống chịu mặn trong vài trườnghợp mất đến 10 hoặc 15 năm để phát triển một giống lúa mới [22]

Ngoài ra, việc lai tạo giống lúa chống chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất

đa gen của tính trạng chống chịu mặn Biểu hiện tính chống chịu mặn của một giốnglúa bị ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh Theo Islam (2004) thì hệ số ditruyền của tính chống chịu mặn thấp (<19,18%), nên tính chống chịu mặn của cácdòng con lai thường không cao như bố me có gen sẵn có [31]

Để khắc phục một phần nhược điểm của phương pháp lai tạo truyền thống,người ta kết hợp với các phương pháp sinh học phân tử

Xu và cs (1996) đã chuyển gen hvaI của lúa mạch vào giống lúa Nipponbare.Cây lúa chuyển gen và không chuyển gen sau 3 tuần tuổi được xử lý mặn 2 vòng: lầnđầu với 200 mM NaCl trong 10 ngày, tiếp theo là không xử lý mặn 10 ngày; lần hai xử

lý mặn 30 ngày với 50 mMNaCl Tác giả ghi nhận là cây lúa chuyển gen có tốc độsinh trưởng và phục hồi tốt hơn cây lúa không chuyển gen khi bị xử lý mặn và không

xử lý mặn [65]

Jang và cs (2003) đã chuyển gen trehalose 6-phosphate synthase và trehalose6-phosphate phosphatase dưới sự kiểm soát của promoter ubiquitine của bắp, đã làmgia tăng sự tích luỹ của treholose trong cây lúa chuyển nạp gen và làm tăng tính chốngchịu mặn, hạn, lạnh [54]

Ohta và cs (2002) cũng đã chuyển gen Na+/H+ antipoter vào giống lúa mẫncảm với mặn Kinhuikari Cây lúa chuyển nạp gen sống sót sau khi thanh lọc mặn ởmức 300 mM NaCl trong 3 ngày, các cây lúa không được chuyển gen đều chết [49]

Nagamiya và cs (2007) lại chuyển nạp gen kat E, một catalase gen, vào giốnglúa japonica Các cây lúa được chuyển gen sống và phát triển hơn 14 ngày trong môitrường mặn có hàm lượng muối 250 mM, trổ bông và cho hạt ở nồng độ muối 100

mM Khi đánh giá mức độ biểu hiện của gen catalase trong cây lúa được chuyển gen,hoạt động của enzyme Catalase tăng lên khoảng 1,5-2,5 lần so với cây lúa không đượcchuyển gen [47]

1.6.2 Chọn tạo giống lúa chống chịu mặn ở Việt Nam

Từ năm 1992-1995 Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam đã tiến hành thanhlọc mặn cho 88 giống lúa địa phương và 100 giống lúa nước của IRRI với giốngPokkali làm đối chứng chống chịu mặn Kết quả chọn được 14 giống triển vọng, trong

đó có 2 giống từ bộ giống của IRRI là: FRG67, ROHYD15 và 12 giống lúa từ tập đoàngiống của cổ truyền là: lúa Tiêu, Ba Lê, Đốc Đỏ, Nàng Thước Dài, Chân Hương, Tamsắc, Nàng Quốc Nhuyễn, Nưng Hương 2, Nàng Hương 3, Nàng Co đỏ, Bảy Dảnh, MộtBụi trong đó đặc biệt chú ý đến giống FRG67, có nguồn gốc từ Pakistan, cho năngsuất cao, chống chịu mặn tốt, phẩm chất gạo tốt [12]

Nguyễn Thị Lang và cs, 2002 đánh giá tính chống chịu mặn của 62 giống lúa cổtruyền, với Pokkali là giống chuẩn kháng và giống IR29 là giống chuẩn nhiễm đã thuđược các giống chống chịu mặn là: Nếp áo Già, Trắng Điệp, Móng Chim, Móng ChimRơi và Nếp Bờ Giếng [7]

Đặng Minh Tâm và Nguyễn Thị Lang (2003) đã nuôi cấy mô 10 giống, baogồm lúa mùa địa phương và cao sản chống chịu mặn khá (cấp 3-5) Kết quả cho thấy :trong môi trường có chứa NaCl ở mức 1,0 và 1,5% cho tỷ lệ tái sinh cao [10]

Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một

số giống lúa địa phương vùng đồng bằng ven biển Bắc Bộ Kết quả gây đột biến nguồnCoban (Co60) đã cho ra những biến dị có lợi cho chọn giống Các giống lúa CM1,CM5, là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những đặc tính chống chịumặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao [2]

Ngô Đình Thức (2006) cũng đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và nuôi cấy túiphấn trong chọn tạo giống lúa chịu mặn đạt được kết quả khả quan Tác giả tạo được 8dòng biến dị soma từ OM576, IR64, Basmati và VD20 có khả năng chống chịu mặn ởcấp 5 khi thanh lọc ở giai đoạn mạ với EC = 12 dS/m [13]

Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2009 đến nay đã bước đầu tìm 30dòng lúa có triển vọng chịu mặn là những dòng lúa kế thừa, được phát hiện chịu mặn

qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lưới Một số giống lúa mới của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long xác định có khả năng kháng mặn khá cao như:

OM6976, OM6677, OM5464, OM5629, OM5166, OM 5451, OM 4059 và OM 6164

đã và đang được khảo nghiệm ở một số tỉnh như Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Bạc

Liêu Kết quả khảo nghiệm ban đầu ghi nhận khá khả quan, trong đó giống lúa

OM5464 đang được đề nghị nhân rộng và trình Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận

là giống lúa sản xuất thử trong năm 2010 Hai giống OM6976 và OM5166 đang được

tiếp tục khảo nghiệm, xác định biện pháp kỹ thuật thích hợp để tăng tính chịu mặn và

năng suất của giống Hai giống lúa mới này dự kiến xin công nhận trong năm 2011.

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn 38 giống có đặc tính chịu mặn được thu thập ởnhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngânhàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân hàng gen củaViện Lúa đồng bằng sông Cửa Long (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Danh sách tập đoàn 38 giống lúa nghiên cứu

Bảng 2.1: Danh sách tập đoàn 38 giống lúa nghiên cứu

 Hoá chất tách chiết ADN

Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như: Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN và Labscan.

- Đệm tách chiết ADN tổng số (đệm CTAB):

CTAB 1%

Tris-HCl 0,1MEDTA 0,5M, pH 8,0NaCl 5M

-mercapthoethanol 14M

- TBE 5x (Tris-borat buffer):

Tris baseBoric acidEDTA 0,5M, pH 8,0

- TE buffer pH = 8,0

Tris 1M, pH = 8,0 NaCl 5M

EDTA 0,5M, pH 8,0

 Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR:

- Đệm PCR 1x (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2 , 5 mM KCl)hoặc đệm PCR 1x của Quiagen, Invitrogen

- MgCl2 của Fermentas, Invitrogen

- dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP) của Fermentas, Invitrogen

- Mồi, Marker 1 kb, Marker GeneRulerTMADN Ladder Ultra Low của

hãng Fermentas, Invitrogen

- Taq polymerase của Fermentas, Invitrogen

 Hoá chất chạy điện di:

- Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: acrylamide, APS, Temed, chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide.

 Các mồi SSR:

30 cặp mồi SSR được được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM đượcchọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin vềtrình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ởtrên 12 NST khác nhau đã được McCouch (2002) và cộng sự công bố (bảng 2.1)[40]

Bảng 2.2: Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu

Bảng 2.2: Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu (tiếp theo)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số và đo độ tinh sạch

2.2.1.1 Tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp CTAB của Obara và Kako(1998) [48] Quy trình tách chiết như sau:

1 Nghiền 1,5 – 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ

2 Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đãđược làm nóng đến 650C)

3 Đảo đều và ủ mẫu ở 650C trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần

4 Làm lạnh đến nhiệt độ phòng Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1),đảo đều trong 10 phút

5 Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng

6 Sau đó chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới (4ml) Bổ sungmột thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở nhiệt độ - 200C trong 30phút

7 Tủa DNA bởi máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút Rửa tủa 2 - 3lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%

8 Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl RNase A (10 mg/ml)

11 Loại bỏ lớp Ete bên trên Cẩn thận chuyển phần bên dưới vào ống mới

12 Thêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút Lấy DNA rabằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh

13 Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%

14 Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa

15 Giữ dung dịch DNA ở - 20°C

2.2.1.2 Đo độ tinh sạch của ADN

Độ tinh sạch và nồng độ của ADN được kiểm tra bằng phương pháp điện ditrên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5x (108g Tris base (MW = 121,10);27,5g Axít boric (MW = 61,83); 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) và dùng marker ADN chuẩn có nồng độ (50 ng/µl) để so sánh Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm bản gelbằng ethidium bromide Việc chụp ảnh mẫu và đo nồng độ được thực hiện bằng máyMolecular imager FX