Nghiên cứu tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 nhằm đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Ngọc Hoa NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Ngọc Hoa NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Thị Phúc XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Giáo viên hƣớng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn thạc sĩ khoa học TS Đỗ Thị Phúc PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Phúc, Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội thu nhận, hƣớng dẫn tận tình tạo điều kiện cho suốt trình thực luận văn thạc sỹ khoa học Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô công tác môn Di truyền học Khoa Sinh học bảo tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn Trong trình học tập nghiên cứu phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, nhận đƣợc giúp đỡ chia sẻ tận tình chuyên môn tập thể anh chị bạn phòng thí nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu ! Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình tất bạn động viên chia sẻ khó khăn thời gian qua ! Đặng Ngọc Hoa MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây lúa khả chịu mặn 1.1.1 Giới thiệu lúa (Oryza sativa) 1.1.2 Đáp ứng với stress mặn thực vật lúa 11 1.2 Protein High-Affinity K+ Transporter (HKT) thực vật 16 1.2.1 Họ protein HKT thực vật 16 1.2.2 Họ protein HKT lúa 17 1.2.3 Gen OsHKT1;4 18 1.3 Một số phƣơng pháp sử dụng nghiên cứu đa hình 20 1.3.1 Phƣơng pháp PCR PCR-RFLP 20 1.3.2 Phƣơng pháp giải trình tự 21 1.4 Một số phƣơng pháp sử dụng phân tích biểu gen 24 1.4.1 Lai northern blot Lai huỳnh quang chỗ 24 1.4.2 RT-PCR Real time PCR 24 1.4.3 Microarray 25 1.5 Tình hình nghiên cứu liên quan đến họ gen HKT lúa 26 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 27 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 27 2.1.1 Vật liệu 27 2.1.2 Hóa chất 27 2.1.3 Thiết bị 29 2.2 Nhóm phƣơng pháp sử dụng phân tích đa hình gen 29 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 29 2.2.2 PCR khuếch đại vùng gen 29 2.2.3 Điện di gel agarose 30 2.2.4 Tinh sản phẩm PCR giải trình tự DNA 30 2.2.5 Phân tích số liệu 31 2.3 Nhóm phƣơng pháp sử dụng phân tích biểu gen 31 2.3.1 Trồng lúa dung dịch thủy canh xử lý mặn 31 2.3.2 Tách chiết RNA tổng số 31 2.3.3 Xử lý với DNase I 32 2.3.4 Tổng hợp cDNA 32 2.3.5 RT-PCR 32 2.3.6 Phân tích số liệu 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân tích đa hình vùng promoter gen OsHKT1;4 lúa 34 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lúa 34 3.1.2 Khuếch đại vùng promoter gen OsHKT1;4 34 3.1.3 Phân tích đa hình vùng promoter gen OsHKT1;4 lúa 35 3.1.4 Phân tích yếu tố cis thuộc vùng promoter gen OsHKT1;4 công cụ tin sinh 38 3.2 Phân tích đa hình vùng mã hóa gen OsHKT1;4 lúa 42 3.2.1 Khuếch đại vùng exon exon gen OsHKT1;4 42 3.2.2 Phân tích đa hình vùng exon exon gen OsHKT1;4 43 3.3 Phân tích mức độ biểu gen OsHKT1;4 lúa 44 3.3.1 Trồng lúa thủy canh xử lý mặn 45 3.3.2 Tách chiết RNA tổng số từ mô 45 3.3.3 Phân tích mức độ biểu gen OsHKT1;4 phƣơng pháp RT-PCR 46 3.3.3.1 Tổng hợp cDNA 46 3.3.3.2 Phân tích mức độ biểu gen OsHKT1;4 phƣơng pháp RT-PCR 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các bậc phân loại phân bố lúa [8] 11 Bảng 1.2 Danh pháp, vị trí locus gen thuộc họ HKT lúa [37] 18 Bảng 2.1 Các mẫu sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR 28 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 30 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen 30 Bảng 2.5 Thành phần quy trình tổng hợp cDNA 32 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng RT-PCR 33 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 33 Bảng 3.1 Các vị trí đa hình vùng promoter gen OsHKT1;4 giống lúa thuộc nhóm II so với sở liệu 38 Bảng 3.2 Kết dự đoán yếu tố cis vùng promoter gen OsHKT1;4 12 giống lúa nghiên cứu 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây lúa phận Hình 1.2 Sơ đồ tiến hóa lúa [13] 10 Hình 1.3 Mô hình hóa hệ thống số kênh vận chuyển Na+ thân bẹ rễ [65] 12 Hình 1.4 Tổng quan chế vận chuyển Na+ thành phần quan trọng hệ thống đáp ứng stress mặn tế bào rễ thực vật 14 Hình 1.5 Sự khác kích thƣớc intron phân họ HKT [37] 16 Hình 1.6 Vị trí phân bố kích thƣớc gen OsHKT1;4 NST số lúa 18 Hình 1.7 Mô hình vận chuyển Na+ gen OsHKT1;4 thân bẹ [61] 19 Hình 1.8 Mô hình phân tử dạng toàn vẹn (A) dạng sai khác cắt nối luân phiên (B) protein OsHKT1;4 [61] 20 Hình 1.9 Giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger 22 Hình 3.1 DNA tổng số tách từ mẫu 12 giống lúa 34 Hình 3.2 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng promoter gen OsHKT1;4 12 giống lúa 35 Hình 3.3 Kết phân tích đa hình trình tự nucleotide vùng promoter gen OsHKT1;4 12 giống lúa nghiên cứu so với sở liệu phần mềm MUTALIN 37 Hình 3.4 Trình tự vùng promoter gen OsHKT1;4 vị trí yếu tố cis giống lúa thuộc nhóm II 41 Hình 3.5 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon gen OsHKT1;4 sử dụng mồi OsHKT1;4-2 12 giống lúa 42 Hình 3.6 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon gen OsHKT1;4 sử dụng mồi OsHKT1;4-3 12 giống lúa 43 Hình 3.7 Kết phân tích đa hình trình tự nucleotide exon (A) exon (B) gen OsHKT1;4 12 giống lúa sở liệu 44 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số giống Pokkali 46 Hình 3.9 Kết phản ứng RT-PCR giống lúa Nipponbare (A) Pokkali (B) mức độ điều kiện stress mặn khác 47 Hình 3.10 Kết phân tích bán định lƣợng biểu gen OsHKT1;4 mức độ phiên mã giống lúa Nipponbare (A) Pokkali (B) 48 BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT bp Basepair cDNA Complementary DNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate dS/m deci Siemens per meter EC Electric Conductivity EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid gDNA Genomic DNA Gly Glycine HKT High-Affinity K+ Transporter mRNA Messenger RNA Os Oryza sativa PCR Polymerase Chain Reaction ppm part per million QLT quantitative trait loci RFLP Restriction fragment length polymorphism RT Reverse Transcriptase RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Ser Serine IRRI International Rice Research Institute TF Transcription factor MỞ ĐẦU Hiện nay, nông nghiệp giới phải đối mặt với thử thách cung cấp khoảng 70% nguồn thức ăn cho thêm 2,3 tỷ ngƣời đến năm 2050 [27] Năng suất trồng nông nghiệp thấp chủ yếu stress phi sinh học khác nhƣ độ mặn cao, hạn hán, nhiệt độ mối đe dọa đến an ninh lƣơng thực toàn giới [82;53] Đáng ý, diện tích đất nhiễm mặn ngày tăng nhiều yếu tố bao gồm biến đổi khí hậu, mực nƣớc biển dâng cao, tồn mỏ đá muối… dẫn đến 50% diện tích đất canh tác nông nghiệp vào năm 2050 [85] Việt Nam có đƣờng bờ biển dài 3.260 km, hệ thống sông chằng chịt đổ biển qua nhiều cửa sông Hai khu vực trồng nông nghiệp nƣớc đồng sông Hồng sông Cửu Long hàng năm bị ảnh hƣởng nghiêm trọng xâm lấn nƣớc biển, nguyên nhân gây nhiễm mặn đất trồng trọt Stress mặn dẫn đến ức chế nghiêm trọng tăng trƣởng phát triển thực vật, gây cân ion tích lũy Na+ Cl-, tăng cƣờng peroxide lipid, tăng sản phẩm dạng phản ứng oxy nhƣ gốc superoxide hydroxyl Hiện có phƣơng pháp khắc phục nhiễm mặn Một cải tạo môi trƣờng, tạo điều kiện thuận lợi cho trồng phát triển, phƣơng pháp đòi hỏi phải thực quy mô lớn, kinh phí tốn nên khó áp dụng viêc canh tác trồng trọt ngƣời dân Phƣơng pháp thứ lựa chọn tạo giống trồng đáp ứng đƣợc với điều kiện stress: dễ tiếp cận, ứng dụng rộng rãi hơn, hạn chế kinh phí, hiệu cao lâu dài [91] Để cải thiện suất trồng điều kiện stress mặn việc cần thiết hiểu chế phân tử đằng sau đáp ứng stress mặn thực vật Khả chịu mặn tính trạng số lƣợng đƣợc kiểm soát nhiều gen [15] Kết cho thấy biểu gen OsHKT1;4 giống lúa tƣơng ứng với điều kiện stress mặn khác khau khác (Hình 3.9) Ở giống Nipponbare biểu gen nhóm đối chứng thay đổi Trong nhóm (xử lý mặn 50 mM), mức độ biểu gen tăng theo thời gian xử lý mặn cao thời điểm thu mẫu sau 72 xử lý mặn Ở nhóm (xử lý mặn 100 mM) biểu gen giảm dần theo thời gian xử lý mặn (Hình 3.10) Ở giống Pokkali có xu hƣớng giảm biểu gen theo thời gian xử lý mặn nhóm (xử lý mặn 50 mM) nhóm (xử lý mặn 100 mM) Tại thời điểm thu thập mẫu 24 sau xử lý mặn, biểu gen OsHKT1;4 có xu hƣớng tăng tăng nồng độ NaCl hai giống Nipponbare Pokkali Sau 48 xử lý mặn biểu gen nhóm giống Nipponbare không thay đổi, sau 72 xử lý mặn giảm mức độ biểu tăng nồng độ NaCl Trong đó, giống Pokkali biểu gen nhóm xử lý mặn (50 mM 100 mM) không thay đổi hai thời điểm 48 72 sau xử lý mặn Mức độ biểu gen OsHKT1;4 thời điểm thu mẫu 24 giờ, 48 giờ, 72 sau xử lý mặn nhóm mẫu (xử lý mặn 50 mM 100 mM) Mức độ biểu gen tƣơng đối Mức độ biểu gen tƣơng đối giống Nipponbare cao giống Pokkali B Pokkali A Nipponbare Hình 3.10 Kết phân tích bán định lƣợng biểu gen OsHKT1;4 mức độ phiên mã giống lúa Nipponbare (A) Pokkali (B) 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã phát 15 vị trí đa hình vùng promoter gen OsHKT1;4 (gồm vị trí đa hình đoạn trình tự nucleotide 14 vị trí đa hình đơn nucleotide) Các giống lúa đƣợc phân chia thành nhóm (Nhóm I gồm giống lúa: Nipponbare, nếp cúc, cƣờm dạng 2; nhóm II gồm giống lúa: nƣớc mặn dạng 1, chiêm rong, chiêm đen, pokkali, tép lai, chăm, cƣờm dạng 1, chăm biển, nƣớc mặn dạng 2) dựa tƣơng đồng trình tự với sở liệu Phân tích đƣợc 15 yếu tố cis vùng promoter gen OsHKT1;4 lúa, có đa hình gây ảnh hƣởng đến yếu tố cis GT-1 (thêm yếu tố GT-1) Không phát đƣợc đa hình vùng exon exon gen OsHKT1;4 12 giống lúa nghiên cứu Mức độ biểu gen OsHKT1;4 hai giống Nipponbare (mẫn cảm mặn) Pokkali (kháng mặn) trái ngƣợc Ở giống Nipponbare mức độ biểu gen OsHKT1;4 thời điểm thu mẫu 24 giờ, 48 giờ, 72 sau xử lý mặn nhóm mẫu (xử lý mặn 50 mM 100 mM) tăng tăng nồng độ muối dung dịch nuôi trồng thủy canh, giống Pokkali giảm Kiến nghị Tiếp tục giải trình tự nucleotide exon để thu đƣợc trình tự cDNA hoàn chỉnh gen OsHKT1;4, từ dự đoán trình tự axit amin suy diễn hoàn chỉnh cấu trúc bậc 2, bậc protein OsHKT1;4 Phân tích biểu gen OsHKT1;4 mô rễ Sử dụng phƣơng pháp Real-time RT-PCR để tăng độ nhạy mức tin cậy phân tích biểu 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR, (1977), "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes" Proc Natl Acad Sci U.S.A, 74 (12): 5350-4 Ansorge W., Rosenthal, A., Sproat B., Schwager C., Stegemann J & Voss H (1988), “Nonradioactive automated sequencing of oligonucleotides by chemical degradation”, Nucleic Acids Res 16, 2203-2206 Apse MP, et al, (1999), “Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis “ Science 285:1256–1258 Bassil E, et al, (2011), “The Arabidopsis intracellular Na+/H+ antiporters NHX5 and NHX6 are endosome associated and necessary for plant growth and development”, Plant Cell, 23:224–239 Berthomieu, P.; Conejero, G.; Nublat, A.; Brackenbury, W.J.; Lambert, C.; Savio, C.; Uozumi, N.; Oiki, S.; Yamada, K.; Cellier, F.; et al, (2003), “Functional analysis of AtHKT1 in Arabidopsis shows that Na+ recirculation by the phloem is crucial for salt tolerance”, EMBO J 22, 2004-2014 Blumwald E, Poole RJ.(1985) “Na/H Antiport in Isolated Tonoplast Vesicles from Storage Tissue of Beta vulgaris”, Plant Physiol 78:163–167 Boyer JS (1982) “Plant productivity and environment”, Science 218:443-8 Brar D S and G S Khush (2003), Utilization of wild species of genus Oryza in rice improvement In: J S Nanda, S D Sharma (eds.), Monograph on Genus Oryza, pp 283-309 Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (2005), "Quantitative real-time RTPCR a perspective" J Mol Endocrinol 34 (3): 597-601 10 Cao, Y.; Jin, X.; Huang, H.; Derebe, M.G.; Levin, E.J.; Kabaleeswaran, V.; Pan, Y.; Punta, M.; Love, J.; Weng, J.; et al (2011), “Crystal structure of a potassium ion transporter, TrkH” Nature, 471, 336-340 50 11 Corratgé-Faillie, C.; Jabnoune, M.; Zimmermann, S.; Véry, A.A.; Fizames, C.; Sentenac, H (2010), “Potassium and sodium transport in non-animal cells: The Trk/Ktr/HKT transporter family” Cell Mol Life Sci., 67, 2511-2532 12 Cui MH, et al.( 2013), “An Arabidopsis R2R3-MYB transcription factor, AtMYB20, negatively regulates type 2C serine/threonine protein phosphatases to enhance salt tolerance” FEBS Lett; 587:1773–1778 13 Chang T T (1985), “Crop history and genetic conservation: Rice-A case study” Iowa State J Res., 59: 425- 455 14 Chen PW, Chiang CM, Tseng TH, Yu SM (2006), “Interaction between rice MYBGA and the gibberellin response element controls tissue-specific sugar sensitivity of alpha-amylase genes” Plant Cell 182326 15 Chinnusamy V, Jagendorf A, Zhu JK (2005), “Understanding and improving salt tolerance in plants” Crop Sci 45:437-448 16 Dai Yin Chao, Yong Hai Luo, Min Shi, Da Luo and Hong Xuan Lin (2005), “ Salt-responsive genes in rice revealed by cDNA microarray analysis” Cell Research 15, 796-810 17 Davenport, R.J.; Munoz-Mayor, A.; Jha, D.; Essah, P.A.; Rus, A.; Tester, M (2007), “The Na+ transporter AtHKT1;1 controls retrieval of Na+ from the xylem in Arabidopsis” Plant Cell Environ, 30, 497-507 18 Davis L M., Fairfield F R., Harger C A., Jett J H., Keller R A., Hahn J H., Krakowski L A., Marrone B L., Martin J C., Nutter H L., Ratliff R L., Shera E B., Simpson D J & Soper S A (1991) “Rapid DNA sequencing based upon single molecule detection” Genetic Analysis - Biomolec Engng 8, 1-7 19 DÖrre, K., Bralmann S., Brinkmeier M., Han K T., Riebeseel K., Schwille P., Stephan J., Wetzel T., Lapezyna M., Stuke M., Bader R., Hinz M., Seliger H., Holm J., Eigen M & Rigler R (1997), “Techniques for single molecule sequencing” Bioimaging 5, 139-152 20 Duan L, et al (2013), “Endodermal ABA signaling promotes lateral root quiescence during salt stress in Arabidopsis seedlings” Plant Cell 25:324– 341 51 21 Dubcovsky, J.; Maria, G.S.; Epstein, E.; Luo, M.C.; Dvorak, J (1996), “Mapping of the K+ /Na+ discrimination locus Kna1 in wheat” Theor Appl Genet., 92, 448-454 22 Durell, S.R.; Guy, H.R (1999), “Structural models of the KtrB, TrkH, and Trk1,2 symporters based on the structure of the KcsA K+ channel” Biophys J 77, 789-807 23 Dvořak, J.; Noaman, M.M.; Goyal, S (1994), “Gorham, J Enhancement of the salt tolerance of Triticum turgidum L by the Kna1 locus transferred from the Triticum aestivum L chromosome 4D by homoeologous recombination” Theor Appl Genet 87, 872-877 24 Dinneny JR, et al Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.Science 2008;320:942–945 25 Englund P T (1971) “Analysis of nucleotide sequences at 3’ termini of duplex deoxyribonucleic acid with the use of the T4 deoxyribonucleic acid polymerase” J biol Chem 246, 3269-3276 26 Englund P T (1972) “The 3’-terminal nucleotide sequences of T7 DNA” J molec Biol 66, 209-224 27 FAO (2009), High level expert forum - how to feed the world in 2050 Economic and social development department 28 Galvan-Ampudia CS, et al (2013), “Halotropism is a response of plant roots to avoid a saline environment”, Curr Biol 23:2044–2050 29 Garciadeblas, B.; Senn, M.E.; Banuelos, M.A.; Rodriguez-Navarro, (2003), “A Sodium transport and HKT transporters: The rice model” Plant J 34, 788-801 30 Geng Y, et al (2013), “A spatio-temporal understanding of growth regulation during the salt stress response in Arabidopsis” Plant Cell 25:2132–2154 31 Golldack D, et al (2011), “Plant tolerance to drought and salinity: stress regulating transcription factors and their functional significance in the cellular transcriptional network” Plant Cell Rep 30:1383–1391 52 32 Griffin H G & Griffin A M (1993), “DNA sequencing - recent innovations and future trends” Appl Biochem Biotechnol 38, 147-159 33 Horie T, Costa A, Kim TH, Han MJ, Horie R, Leung HY, Miyao A, Hirochika H, AnG, Schroeder JI (2007), “Rice OsHKT2;1 transporter mediates large Na+ influx component into K+-starved roots for growth” EMBO Journal 26:3003-3014 34 Huang N, Sutliff TD, Litts JC, Rodriguez RL (1990), Classification and characterization of the rice alpha-amylase multigene family Plant Mol Biol 14: 655 35 Hwang YS, Karrer EE, Thomas BR, Chen L, Rodriguez RL (1998), “Three ciselements required for rice alpha-amylase Amy3D expression during sugar starvation” Plant Mol Biol 36331 36 Inukai Y, Sakamoto T, Ueguchi-Tanaka M, Shibata Y, Gomi K, Umemura I, Hasegawa Y, Ashikari M, Kitano H, Matsuoka M (2005), “Crown rootless1, which is essential for crown root formation in rice, is a target of an AUXIN RESPONSE FACTOR in auxin signaling” Plant Cell 171387 37 J Damien Platten , Olivier Cotsaftis , Pierre Berthomieu , Hans Bohnert , Romola J Davenport, David J Fairbairn, Tomoaki Horie, Roger A Leigh, Hong-Xuan Lin, Sheng Luan, Pascal Ma¨ser, Omar Pantoja, Alonso Rodrı´guez-Navarro, Daniel P Schachtman, Julian I Schroeder, Herve´ Sentenac, Nobuyuki Uozumi, Anne-Alie´nor Ve´ry, Jian-Kang Zhu, Elizabeth S Dennis and Mark Tester (2006), “Nomenclature for HKT transporters, key determinants of plant salinity tolerance” Trends Plant Sci.11(8):372-4 38 Jett J H., Keller R A., Martin J C., Marrone B L., Moyzis R K., Ratliff R L., Seitzinger N K., Shera, E B & Stewart C C (1989) “Highspeed DNA sequencing - an approach based upon fluorescence detection of single molecules” J biomolec struct Dyn 7, 301-309 53 39 Jiang C, et al (2013), “An Arabidopsis soil-salinity-tolerance mutation confers ethylene-mediated enhancement of sodium/potassium homeostasis” Plant Cell 25:3535–3352 40 Jiang Y, Deyholos MK (2009), “Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 andWRKY33 transcription factors in abiotic stresses” Plant Mol Biol 69:91–105 41 Jiang Y, et al (2009), “Functional characterization of the Arabidopsis bHLH92 transcription factor in abiotic stress” Mol Genet Genomics 282:503– 516 42 Jump up^ Streit S, Michalski CW, Erkan M, Kleeff J, Friess H (2009) "Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues" Nat Protoc 4(1): 37-43 43 Kader MA, Seidel T, Golldack D, Lindberg S (2006), “Expressions of OsHKT1, OsHKT2, and OsHVA are differentially regulated under NaCl stress in salt-sensitive and salt-tolerant rice (Oryza sativa L.) cultivars” Journal of Experimental Botany; 57:4257-4268 44 Karley A.J., Leigh R.A & Sanders D (2000), “Differential ion accumulation and ion fluxes in the mesophyll and epidermis of barley” Plant Physiology 122, 835-844 45 Kasuga M, et al (1999), “Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor” Nat Biotechnol 17:287–291 46 Lan, W.-Z.; Wang, W.; Wang, S.-M.; Li, L.-G.; Buchanan, B.B.; Lin, H.-X.; Gao, J.-P.; Luan, S (2010), “A rice high-affinity potassium transporter (HKT) conceals a calcium-permeable cation channel” Proc Natl Acad Sci USA, 107, 7089-7094 47 Laurie, S.; Feeney, K.A.; Maathuis, F.J.M.; Heard, P.J.; Brown, S.J.; Leigh, R.A (2002), “A role for HKT1 in sodium uptake by wheat roots” Plant J 32, 139-149 54 48 Leidi EO, et al (2010), “The AtNHX1 exchanger mediates potassium compartmentation in vacuoles of transgenic tomato” Plant J 61:495–506 49 Lin HX, Zhu MZ, Yano M, Gao JP, Liang ZW, Su WA, Hu ZH, Ren ZH, Chao DY (2004), “QTLs for Na+ and K+ uptake of the shoots and roots controlling rice salt tolerance” Theoretical and Applied Genetics 108:253-260 50 Lu CA, Ho THD, Ho SL, Yu SM (2002), “Three Novel MYB Proteins with One DNA Binding Repeat Mediate Sugar and Hormone Regulation of alpha-Amylase Gene Expression” Plant Cell 14 :1963 51 Lu CA, Lim EK, Yu SM (1998) “Sugar response sequence in the promoter of a rice alpha-amylase gene serves as a transcriptional enhancer” J Biol Chem 273: 10120 52 Ma, H., K Chong and X.W Deng (2007) “Rice research: past, present and future” J Integr Plant Biol., 49: 729-730 53 Mantri N, Patade V, Penna S, Ford R, Pang E (2012), “Abiotic stress responses in plants: present and future In: Ahmad P, Prasad MNV (ed) Abiotic stress responses in plants: metabolism, productivity and sustainability” Springer, New York, pp 1-19 54 Mäser, P.; Eckelman, B.; Vaidyanathan, R.; Horie, T.; Fairbairn, D.J.; Kubo, M.; Yamagami, M.; Yamaguchi, K.; Nishimura, M.; Uozumi, N.; et al (2002) “Altered shoot/root Na+ distribution and bifurcating salt sensitivity in Arabidopsis by genetic disruption of the Na+ transporter AtHKT1” FEBS Lett., 531, 157-161 55 Maxam A M & Gilbert W (1977) “A new method for sequencing DNA” Proc natn Acad Sci USA 74, 560-564 56 Munns, R.; Tester, M (2008), “Mechanisms of salinity tolerance” Annu Rev Plant Biol 59, 651-681 57 Nag R, Maity MK, Dasgupta M (2005), “Dual DNA binding property of ABA insensitive like factors targeted to promoters responsive to ABA and auxin” Plant Mol Biol 59:821 55 58 Nyrén P (1987) “Enzymatic method for continuous monitoring of DNA polymerase activity” Analyt Biochem 167, 235-238 59 O, et al (2009), “The Arabidopsis basic leucine zipper transcription factor AtbZIP24 regulates complex transcriptional networks involved in abiotic stress resistance” Gene 436:45–55 60 Oka H I (1988), “Origin of cultivated rice” Japan Sci Soc Press, Tokyo 245 p 61 Olivier Cotsaftis, Darren Plett, Neil Shirley, Mark Tester, and Maria Hrmova (2012), “A Two-Staged Model of Na+ Exclusion in Rice Explained by 3D Modeling of HKT Transporters and Alternative Splicing” Published:DOI: 10.1371/journal pone 0039865 62 O'Neill SD, Kumagai MH, Majumdar A, Huang N, Sutliff TD, Rodriguez RL (1990), “The alpha-amylase genes in Oryza sativa: characterization of cDNA clones and mRNA expression during seed germination” Mol Gen Genet 221235 63 Pandey N, et al (2013), “CAMTA regulates drought responses in Arabidopsis thaliana” BMC Genomics 14:216 64 Plett, D.; Safwat, G.; Gilliham, M.; Møller, I.S.; Roy, S.; Shirley, N.; Jacobs, A.; Johnson, A.; Tester, M (2010), “Improved salinity tolerance of rice through cell type-specific expression of AtHKT1;1” PLoS One 5, e12571 65 Plett, D.C.; Møller, I.S (2010), “Na+ transport in glycophytic plants: What we know and would like to know” Plant Cell Environ 33, 612-626 66 Qin Y, Ma X, Yu G, Wang Q, Wang L, Kong L, Kim W, Wang HW (2014), “Evolutionary history of trihelix family and their functional diversification” DNA Res 21:499 67 Quirino BF, Noh YS, Himelblau E, Amasino RM (2000), “Molecular aspects of leaf senescence” Trends Plant Sci ; 5:278-82 68 Ren, Z.-H et al (2005), “A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter” Nat Genet 37, 1141-1146 56 69 Rengasamy, P (2006), “World salinization with emphasis on Australia” J Exp Bot 57, 1017-1023 70 Reyes JC, Muro-Pastor MI, Florencio FJ (2004), “The GATA family of transcription factors in Arabidopsis and rice” Plant Physiol 134:1718 71 Richterich P (1989), “Non-radioactive chemical sequencing of biotin labeled DNA” Nucleic Acids Res 17, 2181-2186 72 Ronaghi M., Karamohamed S., Pettersson B., Uhlén M & Nyrén P (1996) “Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release” Analyt Biochem 242, 84-89 73 Sanger F & Coulson A R (1975), “A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase” J molec Biol 94, 441448 74 Sanger F., Nicklen S & Coulson A R (1977) “DNA sequencing with chainterminating inhibitors” Proc natn Acad Sci USA 74, 5463-5467 75 Sassi, A.; Mieulet, D.; Khan, I.; Moreau, B.; Gaillard, I.; Sentenac, H.; Véry, A -A (2012), “The rice monovalent cation transporter OsHKT2;4: Revisited ionic selectivity” Plant Physiol 160, 498-510 76 Schachtman, D.P.; Schroeder, J.I (1994), “Structure and transport mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants” Nature, 370, 655-658 77 Stephen R Grattan (2002), Rice is more sentitive to salinity than previous thought, California agriculture, 56, pp.189-192 78 Sutoh K, Yamauchi D (2003) “Two cis-acting elements necessary and sufficient for gibberellin-upregulated proteinase expression in rice seeds” Plant J 34:635 79 Tester, M and Davenport, R (2003), “Na+ tolerance and Na+ transport in higher plants” Ann Bot (Lond.) 91, 503-527 80 Tetzu Chang, Eliseo A.Bardenas (1965), “The morphology and varietal characteristics of the rice plant”, Technical Bulletin , pp.5 57 81 Toyofuku K, Umemura T, Yamaguchi J (1998), “Promoter elements required for sugar-repression of the RAmy3D gene for alpha-amylase in rice” FEBS Lett 428275 82 Thakur P, Kumar S, Malik JA, Berger JD, Nayyar H (2010), “Cold stress effects on reproductive development in grain crops: an overview” Environ Exp Bot 67:429-443 83 Tran LS, et al (2004), “Isolation and functional analysis of Arabidopsis stressinducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive ciselement in the early responsive to dehydration stress promoter” Plant Cell ;16:2481–2498 84 Vandepoele K, Vlieghe K, Florquin K, Hennig L, Beemster GT, Gruissem W, Van de Peer Y, Inzé D, De Veylder L (2005) “Genome-wide identification of potential plant E2F target genes” Plant Physiol 139316 85 Wang W, Vinocur B, Altman A (2003), “Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance” Planta 218:1-14 86 Welchen E, Gonzalez DH (2006) “Overrepresentation of elements recognized by TCP-domain transcription factors in the upstream regions of nuclear genes encoding components of the mitochondrial oxidative phosphorylation Machinery” Plant Physiol 141:540 87 Weng H, et al (2012), “Poplar GTL1 is a Ca2+/calmodulin-binding transcription factor that functions in plant water use efficiency and drought tolerance” PLoS One 7:e32925 88 Wong ML, Medrano JF (2005) "Real-time PCR for mRNA quantitation" BioTechniques 39 (1): 75-85 89 Xie Z, Zhang ZL, Zou X, Huang J, Ruas P, Thompson D, Shen QJ (2005), “Annotations and functional analyses of the rice WRKY gene superfamily reveal positive and negative regulators of abscisic acid signaling in aleurone cells” Plant Physiol 137:176 58 90 Yoo JH, et al (2005), “Direct interaction of a divergent CaM isoform and the transcription factor, MYB2, enhances salt tolerance in Arabidopsis “ J Biol Chem 280:3697–3706 91 Geetha, S., Shanthi, P., Jebaraj, S and Mohamed, S.E.N (2006) “Gene action of sodicity tolerance in rice” Indian Journal of Crop science 1: 201-202 92 Tetzu Chang, Eliseo A.Bardenas (1965), “The morphology and varietal characteristics of the rice plant”, Technical Bulletin , pp.5 93 Peng-Wen Chen et al.(2006), “Interaction between Rice MYBGA and the Gibberellin Response Element Controls Tissue-Specific Sugar Sensitivity of αAmylase Genes”, The Plant Cell, 18(9), pp 2326-2340 94 Nguyen Thị Anh (2015), “Amplification and sequencing of OsHKT1;1 gene in rice” Bachelor thesis, VNU University of Science, Viet Nam 95 Pham Quynh Hoa (2015), “Expression analysis of the rice OsHKT2;1 gene under salinity stress conditions using RT-PCR technique” Bachelor thesis, VNU University of Science, Viet Nam 59 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần dung dịch sử dụng thí nghiệm Các hóa chất tách chiết DNA tổng số Dung dịch CTAB 2X Tris-HCl 1M, pH8 NaCl 5M EDTA 0,5M, pH8 CTAB Nước cất (ddH2O) Dung dịch CI (24:1) Chloroform Isoamylacohol Dung dịch Ethanol 70% 100 % Ethanol Nước cất (ddH2O) Dung dịch đệm TE Nước cất (dH2O) Tris-HCl 1M, pH8 EDTA 0,5M, pH8 10 ml ml 2,8 ml 0,4 ml 0,2 g Bổ sung đến 10ml 10 ml 9,6 ml 0,4 ml 10 ml ml ml 10 ml 9,7 ml 0,1 ml 0,1 ml Dung dịch YOSHIDA Yếu tố Yếu tố đa lượng N P K Ca Mg Yếu tố vi lượng Mn Mo Zn B Cu Fe Công thức hóa học Nồng độ (ppm) NH4NO3 NaH2PO4.2H2O KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O 40 10 40 40 40 MnCl2.4H2O (NH4)6 Mo7O24.4H2O ZnSO4.2H2O H3BO3 CuSO4.2H2O FeCl3.6H2O 0.50 0.05 0.01 0.20 0.01 2.00 Phụ lục Hình ảnh ACGTABOX WRKY71 GATABOX CTCTGCACTA GATAGTGTCT ACGTACGGGT TCTCTAATCT CTATCCTGAC TAGCTATACC OS GT-1 TATCCCTTTC CCGTACTTTG TGATCTTCTC ATCATTAGAC CCATTTGAAT CGTGGGAAAA GT-1 GT-1 GAAAAAAAAT ACAGAATTTT GATGGGAATA CAAGTGTAAA ACAGAAAAAA AAACACAATA GT-1 GATABOX GT-1 GATTGGACCA TACGAAAAAC ACAGGAATTG GGAAAGATAG ACTCAAAGAA AATTTTAAGA GTTGGTTGGT AAACAGAACA ATAGCCGTTT GGTTGAAACT CTTACTAAGT TTTTTAAAAA ATCTATATGT AATGAGCCAT TTCATAGGAA TTTCATATAA TTTGAAAAGT GT-1 CTCAATCCTT TGAAAATCAT TTGATTCAAA GGGACTCTAA ATCCTATTGT TACTTTGAGA ACTTGAACAA AGCAAAACAC TATTTATGTT TTTTAATATA TGATGCGGTT AAATTTTATA TACACATTTA ACCATTTGTA ATATAAAAAA TAATTATCAT TTATTTTATT GTGAGTTGTC TTATCACTAA GTTTTTAAAA GTATAATTTA TATCTTTTAC ATATTTCTAT ATAATATTTT TAAATAAGTC GAATGGTCAA ATGTGTATAA AAAAATCAAT AGGAACATCT ATTAAAAAGC ATAGGGAGTA ATTAGTTTAA GTAAAAGCCT AAGGCAAGAA TGAATAGGAT GATABOX CCAATCATAC AGACCAAGTC GATCTGTTAA CTCTCGGCCG TAGGTCTTAA AATTTTTTAA AAAGATAAAA GT-1 GT-1 TCCTCAAAAA CATAGGAAAT TTGTAGGCTA GGTTAACCAC AAAGCTCTGA GTACCAAGTA TACATTTTTT ARFAT GATABOX E2FCONSENSUS TTTCAAGACA ATGTTCAGTG TTCTTTGTCT CGCTTTCTAA GGACTAAGAA TATTATGGAT AATCTTTTTG GCGGACTGGC ATAGAGAATT AGGAATATTT GAGCACATAT TTTCCAATAG CACAAGTCTT TGGAATATAT GAGCAAATAT CATTTATATT CTATTTCTTT CTGAAATGAA GT-1 GGATGTGCTT TTGTAGCTCT TCAGGAAAAG AAATGCACAT GATABOX AMYBOX1/GARE1OSREP GT-1 AGATATCTAA CAGACTGATC GAATATCATC AAAGAGGAAA GT-1 GAAAATCTTA ATCTTTAGGA GTTTTAAAAA TATGCATGCC SITEIIATCYT AMYBOX2/ OSAMY/MOTIFOSRAMY3D C GGCCTTAGTT TCTATCCATA TATTTTAGGT TCAATCATTA GT-1/ POLASIG1 AAAATAAAAA TGTCTTATAG CTCAGAACGG AGAGAGTAAC CTCTTCGTTC TATATTAATT ATTATATAAA WRKY71 GT-1 TTCACTTAAT ATGACTATGT GATGGAAAAA OS RYREPEATVFLEB4 AACGAGCATT TGTAACTGCA TGCATGCATG GATABOX TAAATGAAAG GATGATTATA TATGATAATC GT-1 AGAATTGAGG GAGTATTACT CTATTCGAAA TTCTTAGGGT TTCCACAATT TCCATGTTTT POLASIG2 CATTAAAGAT GATGAGAGGT CTAAATTAAA TTTCTATATA GGAAGAACAT TTTTCAAAAA ATAATCTAGT AGTTAGTAGC TAAAAAACTG WRKY71 GTACACAAAT TTTAAATATT GACTTTGCAG OS GAAATACTTT ATCATTTTTT CTTATTTACT CTTTTTAGTC AAGATCATGA AAACCTTAAC TTCCCTATAT ATAGAAACAA GCATACTTCA ACTTTCTCGC ATGCATAAGA GATABOX TAGACTAAAT TTACATGCCT AGATACAATA ATGCCACACT AGTTTAGAAA TTCTGGTTTT GATTATATAA TAATCAATGT TTGGATGACA TCAAATGGTT AGTGGTACGT AGGACGCGTG GCCTATTTTG TTGCTCAGCC ATAGCTCCCA GCCTCCCACG TCCGCACGAC TATATATAGC GCGGCAGCAC GATCGATCGC CGGAGCTCAT CCACAAGCTC GCCGAGCCAG CCGTTGCACC GGCCGCGCCG GAGCGAGCAC START CODON ACGGCGGCCG CGTGCGTGCT CCAATATGCA CGTCGCCTAC TTCCTCGCCA TCT Hình p.2 Trình tự vùng promoter gen OsHKT1;4 vị trí yếu tố cis giống lúa Nipponbare Hình p.3 Kết so sánh trình tự sản phẩm phản ứng RT-PCR với mồi RT-HKT1;4 với trình tự gen NCBI Query: trình tự khuếch đại với mồi RT-HKT1;4 Subject: sở liệu