DSpace at VNU: Nghiên cứu tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 nhằm đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa (Oryza sativa)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Đặng Ngọc Hoa NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Ngọc Hoa

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN

CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Ngọc Hoa

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN

CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa)

Chuyên ngành: Di truyền học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Thị Phúc

XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

thạc sĩ khoa học

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ Thị Phúc, Bộ môn Di truyền

học, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

đã thu nhận, hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn thạc sỹ khoa học

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô công tác tại bộ môn

Di truyền học và Khoa Sinh học đã chỉ bảo và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chia sẻ tận tình về chuyên môn của tập thể anh chị và các bạn trong phòng thí nghiệm Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp

đỡ quý báu đó !

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và tất cả các bạn đã động viên và chia sẻ khó khăn cùng tôi trong thời gian qua !

Đặng Ngọc Hoa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 7

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Cây lúa và khả năng chịu mặn 9

1.1.1 Giới thiệu về cây lúa (Oryza sativa) 9

1.1.2 Đáp ứng với stress mặn ở thực vật và cây lúa 11

1.2 Protein High-Affinity K+ Transporter (HKT) ở thực vật 16

1.2.1 Họ protein HKT ở thực vật 16

1.2.2 Họ protein HKT ở lúa 17

1.2.3 Gen OsHKT1;4 18

1.3 Một số phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình 20

1.3.1 Phương pháp PCR và PCR-RFLP 20

1.3.2 Phương pháp giải trình tự 21

1.4 Một số phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen 24

1.4.1 Lai northern blot và Lai huỳnh quang tại chỗ 24

1.4.2 RT-PCR và Real time PCR 24

1.4.3 Microarray 25

1.5 Tình hình nghiên cứu liên quan đến họ gen HKT ở lúa 26

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 27

2.1.1 Vật liệu 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Thiết bị 29

2.2 Nhóm phương pháp sử dụng trong phân tích đa hình gen 29

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 29

2.2.2 PCR khuếch đại vùng gen 29

2.2.3 Điện di trên gel agarose 30

2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA 30

2.2.5 Phân tích số liệu 31

2.3 Nhóm phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen 31

2.3.1 Trồng lúa trong dung dịch thủy canh và xử lý mặn 31

2.3.2 Tách chiết RNA tổng số 31

2.3.3 Xử lý với DNase I 32

2.3.4 Tổng hợp cDNA 32

2.3.5 RT-PCR 32

2.3.6 Phân tích số liệu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở lúa 34

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá lúa 34

3.1.2 Khuếch đại vùng promoter của gen OsHKT1;4 34

3.1.3 Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở lúa 35

3.1.4 Phân tích các yếu tố cis thuộc vùng promoter của gen OsHKT1;4

bằng công cụ tin sinh 38

3.2 Phân tích đa hình vùng mã hóa của gen OsHKT1;4 ở lúa 42

3.2.1 Khuếch đại vùng exon 2 và exon 3 của gen OsHKT1;4 42

3.2.2 Phân tích đa hình vùng exon 2 và exon 3 của gen OsHKT1;4 43

3.3 Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở lá lúa 44

3.3.1 Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn 45

3.3.2 Tách chiết RNA tổng số từ mô lá 45

3.3.3 Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 bằng phương pháp

RT-PCR 46

3.3.3.1 Tổng hợp cDNA 46

3.3.3.2 Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 bằng phương pháp RT-PCR 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các bậc phân loại và phân bố của cây lúa [8] 11

Bảng 1.2 Danh pháp, vị trí các locus của các gen thuộc họ HKT ở lúa [37] 18

Bảng 2.1 Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 2.2 Trình tự mồi cho phản ứng PCR 28

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 30

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen 30

Bảng 2.5 Thành phần và quy trình tổng hợp cDNA 32

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng RT-PCR 33

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 33

Bảng 3.1 Các vị trí đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở 9 giống lúa

thuộc nhóm II so với cơ sở dữ liệu 38

Bảng 3.2 Kết quả dự đoán các yếu tố cis vùng promoter của gen OsHKT1;4

ở 12 giống lúa nghiên cứu 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây lúa và các bộ phận của cây 9

Hình 1.2 Sơ đồ tiến hóa của cây lúa [13] 10

Hình 1.3 Mô hình hóa hệ thống một số kênh vận chuyển Na+ ở thân bẹ và rễ [65] 12

Hình 1.4 Tổng quan về cơ chế vận chuyển Na+ và các thành phần quan trọng trong

hệ thống đáp ứng stress mặn ở các tế bào rễ thực vật 14

Hình 1.5 Sự khác nhau về kích thước intron ở 2 phân họ HKT [37] 16

Hình 1.6 Vị trí phân bố và kích thước của gen OsHKT1;4 trên NST số 4 ở lúa 18

Hình 1.7 Mô hình vận chuyển Na+ của gen OsHKT1;4 ở thân bẹ [61] 19

Hình 1.8 Mô hình phân tử dạng toàn vẹn (A) và dạng sai khác do cắt nối luân phiên (B) của protein OsHKT1;4 [61] 20

Hình 1.9 Giải trình tự theo phương pháp Sanger 22

Hình 3.1 DNA tổng số tách từ mẫu lá của 12 giống lúa 34

Hình 3.2 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng promoter của gen OsHKT1;4

ở 12 giống lúa 35

Hình 3.3 Kết quả phân tích đa hình trình tự nucleotide vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở 12 giống lúa nghiên cứu so với cơ sở dữ liệu bằng phần mềm MUTALIN 37

Hình 3.4 Trình tự vùng promoter của gen OsHKT1;4 và vị trí của các yếu tố cis

của 9 giống lúa thuộc nhóm II 41

Hình 3.5 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon 2 của gen OsHKT1;4 sử dụng mồi OsHKT1;4-2 của 12 giống lúa 42

Hình 3.6 Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon 3 của gen OsHKT1;4 sử dụng mồi OsHKT1;4-3 của 12 giống lúa 43

Hình 3.7 Kết quả phân tích đa hình trình tự nucleotide exon 2 (A) và exon 3 (B)

của gen OsHKT1;4 ở 12 giống lúa và cơ sở dữ liệu 44

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số của giống Pokkali 46

Hình 3.9 Kết quả phản ứng RT-PCR ở 2 giống lúa Nipponbare (A) và Pokkali (B)

tại các mức độ điều kiện stress mặn khác nhau 47

Hình 3.10 Kết quả phân tích bán định lượng sự biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở mức độ phiên mã của 2 giống lúa Nipponbare (A) và Pokkali (B) 48

BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Hiện nay, nền nông nghiệp thế giới đang phải đối mặt với thử thách là cung cấp khoảng 70% nguồn thức ăn cho thêm 2,3 tỷ người đến năm 2050 [27] Năng suất cây trồng nông nghiệp thấp hơn chủ yếu là do các stress phi sinh học khác nhau như độ mặn cao, hạn hán, nhiệt độ đang là mối đe dọa đến an ninh lương thực trên toàn thế giới [82;53] Đáng chú ý, diện tích đất nhiễm mặn ngày càng tăng do nhiều yếu tố bao gồm biến đổi khí hậu, mực nước biển dâng cao, sự tồn tại của mỏ đá muối… có thể dẫn đến mất 50% diện tích đất canh tác nông nghiệp hiện nay vào năm 2050 [85]

Việt Nam có đường bờ biển dài 3.260 km, hệ thống sông chằng chịt đổ ra biển qua rất nhiều cửa sông Hai khu vực trồng cây nông nghiệp chính của cả nước

là đồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long hàng năm bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi sự xâm lấn của nước biển, là một trong những nguyên nhân chính gây ra nhiễm mặn đất trồng trọt Stress mặn dẫn đến ức chế nghiêm trọng sự tăng trưởng và phát triển của thực vật, gây mất cân bằng ion do tích lũy Na+ và Cl-, tăng cường peroxide lipid, tăng sản phẩm của các dạng phản ứng oxy như các gốc superoxide và hydroxyl

Hiện nay có 2 phương pháp khắc phục sự nhiễm mặn Một là cải tạo môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho cây trồng phát triển, phương pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở quy mô lớn, kinh phí tốn kém nên khó áp dụng trong viêc canh tác trồng trọt của người dân Phương pháp thứ 2 là lựa chọn và tạo ra các giống cây trồng có thể đáp ứng được với các điều kiện stress: dễ tiếp cận, ứng dụng rộng rãi hơn, hạn chế kinh phí, hiệu quả cao và lâu dài [91] Để cải thiện năng suất cây trồng trong điều kiện stress mặn thì việc cần thiết là hiểu các cơ chế phân tử cơ bản đằng sau các đáp ứng stress mặn ở thực vật Khả năng chịu mặn là một tính trạng số lượng được kiểm soát bởi nhiều gen [15]

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1 Đã phát hiện 15 vị trí đa hình ở vùng promoter của gen OsHKT1;4 (gồm 1 vị

trí đa hình một đoạn trình tự nucleotide và 14 vị trí đa hình đơn nucleotide) Các giống lúa được phân chia thành 2 nhóm (Nhóm I gồm 3 giống lúa: Nipponbare, nếp cúc, cườm dạng 2; nhóm II gồm 9 giống lúa: nước mặn dạng 1, chiêm rong, chiêm đen, pokkali, tép lai, chăm, cườm dạng 1, chăm biển, nước mặn dạng 2) dựa trên sự tương đồng về trình tự với cơ sở dữ liệu

2 Phân tích được 15 yếu tố cis ở vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở lúa, và

có 2 đa hình gây ảnh hưởng đến yếu tố cis GT-1 (thêm và mất một yếu tố

GT-1)

3 Không phát hiện được đa hình ở vùng exon 2 và exon 3 của gen OsHKT1;4 ở

12 giống lúa nghiên cứu

4 Mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở hai giống Nipponbare (mẫn cảm

mặn) và Pokkali (kháng mặn) là trái ngược nhau Ở giống Nipponbare mức

độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 tại các thời điểm thu mẫu 24 giờ, 48 giờ, 72

giờ sau khi xử lý mặn và ở các nhóm mẫu (xử lý mặn 50 mM và 100 mM) tăng khi tăng nồng độ muối trong dung dịch nuôi trồng thủy canh, trong khi

đó ở giống Pokkali là giảm

Kiến nghị

1 Tiếp tục giải trình tự nucleotide của exon 1 để thu được trình tự cDNA

hoàn chỉnh của gen OsHKT1;4, từ đó dự đoán trình tự axit amin suy diễn

hoàn chỉnh và cấu trúc bậc 2, bậc 3 của protein OsHKT1;4

2 Phân tích biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở mô rễ của cây

3 Sử dụng phương pháp Real-time RT-PCR để tăng độ nhạy và mức tin cậy trong phân tích biểu hiện

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Anh

1 Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR, (1977), "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and

hybridization with DNA probes" Proc Natl Acad Sci U.S.A, 74 (12): 5350-4

2 Ansorge W., Rosenthal, A., Sproat B., Schwager C., Stegemann J & Voss H (1988), “Nonradioactive automated sequencing of oligonucleotides by chemical

degradation”, Nucleic Acids Res 16, 2203-2206

3 Apse MP, et al, (1999), “Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis “ Science 285:1256–1258

4 Bassil E, et al, (2011), “The Arabidopsis intracellular Na+/H+ antiporters NHX5 and NHX6 are endosome associated and necessary for plant growth and

development”, Plant Cell, 23:224–239

5 Berthomieu, P.; Conejero, G.; Nublat, A.; Brackenbury, W.J.; Lambert, C.; Savio, C.; Uozumi, N.; Oiki, S.; Yamada, K.; Cellier, F.; et al, (2003),

“Functional analysis of AtHKT1 in Arabidopsis shows that Na+ recirculation

by the phloem is crucial for salt tolerance”, EMBO J 22, 2004-2014

6 Blumwald E, Poole RJ.(1985) “Na/H Antiport in Isolated Tonoplast Vesicles

from Storage Tissue of Beta vulgaris”, Plant Physiol 78:163–167

7 Boyer JS (1982) “Plant productivity and environment”, Science 218:443-8

8 Brar D S and G S Khush (2003), Utilization of wild species of genus Oryza in

rice improvement In: J S Nanda, S D Sharma (eds.), Monograph on Genus

Oryza, pp 283-309

9 Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (2005), "Quantitative real-time

RT-PCR a perspective" J Mol Endocrinol 34 (3): 597-601

10 Cao, Y.; Jin, X.; Huang, H.; Derebe, M.G.; Levin, E.J.; Kabaleeswaran, V.; Pan, Y.; Punta, M.; Love, J.; Weng, J.; et al (2011), “Crystal structure of a

potassium ion transporter, TrkH” Nature, 471, 336-340

11 Corratgé-Faillie, C.; Jabnoune, M.; Zimmermann, S.; Véry, A.A.; Fizames, C.; Sentenac, H (2010), “Potassium and sodium transport in non-animal cells: The

Trk/Ktr/HKT transporter family” Cell Mol Life Sci., 67, 2511-2532

12 Cui MH, et al.( 2013), “An Arabidopsis R2R3-MYB transcription factor, AtMYB20, negatively regulates type 2C serine/threonine protein phosphatases

to enhance salt tolerance” FEBS Lett; 587:1773–1778

13 Chang T T (1985), “Crop history and genetic conservation: Rice-A case

study” Iowa State J Res., 59: 425- 455

14 Chen PW, Chiang CM, Tseng TH, Yu SM (2006), “Interaction between rice MYBGA and the gibberellin response element controls tissue-specific sugar

sensitivity of alpha-amylase genes” Plant Cell 182326

15 Chinnusamy V, Jagendorf A, Zhu JK (2005), “Understanding and improving

salt tolerance in plants” Crop Sci 45:437-448

16 Dai Yin Chao, Yong Hai Luo, Min Shi, Da Luo and Hong Xuan Lin (2005),

xylem in Arabidopsis” Plant Cell Environ, 30, 497-507

18 Davis L M., Fairfield F R., Harger C A., Jett J H., Keller R A., Hahn J H., Krakowski L A., Marrone B L., Martin J C., Nutter H L., Ratliff R L., Shera

E B., Simpson D J & Soper S A (1991) “Rapid DNA sequencing based

upon single molecule detection” Genetic Analysis - Biomolec Engng 8, 1-7

19 DÖrre, K., Bralmann S., Brinkmeier M., Han K T., Riebeseel K., Schwille P., Stephan J., Wetzel T., Lapezyna M., Stuke M., Bader R., Hinz M., Seliger H., Holm J., Eigen M & Rigler R (1997), “Techniques for single molecule

sequencing” Bioimaging 5, 139-152

20 Duan L, et al (2013), “Endodermal ABA signaling promotes lateral root

quiescence during salt stress in Arabidopsis seedlings” Plant Cell 25:324–

341

21 Dubcovsky, J.; Maria, G.S.; Epstein, E.; Luo, M.C.; Dvorak, J (1996),

“Mapping of the K+ /Na+ discrimination locus Kna1 in wheat” Theor Appl

Genet., 92, 448-454

22 Durell, S.R.; Guy, H.R (1999), “Structural models of the KtrB, TrkH, and

Trk1,2 symporters based on the structure of the KcsA K+ channel” Biophys J

77, 789-807

23 Dvořak, J.; Noaman, M.M.; Goyal, S (1994), “Gorham, J Enhancement of the salt tolerance of Triticum turgidum L by the Kna1 locus transferred from the Triticum aestivum L chromosome 4D by homoeologous recombination”

Theor Appl Genet 87, 872-877

24 Dinneny JR, et al Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to

abiotic stress.Science 2008;320:942–945

25 Englund P T (1971) “Analysis of nucleotide sequences at 3’ termini of duplex deoxyribonucleic acid with the use of the T4 deoxyribonucleic acid

polymerase” J biol Chem 246, 3269-3276

26 Englund P T (1972) “The 3’-terminal nucleotide sequences of T7 DNA” J

molec Biol 66, 209-224

27 FAO (2009), High level expert forum - how to feed the world in 2050

Economic and social development department

28 Galvan-Ampudia CS, et al (2013), “Halotropism is a response of plant roots to

avoid a saline environment”, Curr Biol 23:2044–2050

29 Garciadeblas, B.; Senn, M.E.; Banuelos, M.A.; Rodriguez-Navarro, (2003), “A

Sodium transport and HKT transporters: The rice model” Plant J 34, 788-801

30 Geng Y, et al (2013), “A spatio-temporal understanding of growth regulation

during the salt stress response in Arabidopsis” Plant Cell 25:2132–2154

31 Golldack D, et al (2011), “Plant tolerance to drought and salinity: stress regulating transcription factors and their functional significance in the cellular

transcriptional network” Plant Cell Rep 30:1383–1391