Nghiên cứu phân lập gen nac liên quan đến khả năng chịu hạn ở một số giống ngô địa phương Hà Giang, Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VĂN TƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN NAC LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƢƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VĂN TƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN NAC LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƢƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH THÁI NGUYÊN - 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Thái Nguyên, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Tác giả Nguyễn Văn Tƣờng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin cảm ơn các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Sinh học, Khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và các cán bộ phòng DNA ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành một số thí nghiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó! Thái Nguyên, ngày 10 tháng 05 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Tƣờng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Những chữ viết tắt trong luận văn v Danh mục các bảng trong luận văn vi Danh mục các hình trong luận văn vii MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu của đề tài 2 3. Nội dung của đề tài 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. CÂY NGÔ 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây ngô 3 1.1.3. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô 5 1.1.4. Giá trị kinh tế của cây ngô 6 1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 7 1.2. HẠN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ 11 1.2.1. Hạn và ảnh hƣởng của hạn đối với cây trồng 11 1.2.2. Đặc tính chịu hạn của cây ngô 12 1.2.3. Tình hình nghiên cứu đặc tính chịu hạn của cây ngô 14 1.2.4. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và di truyền của tính chịu hạn của cây ngô 16 1.2.5. Các gen điều khiển phiên mã 19 1.2.6. NAC và vai trò của NAC với tính chịu hạn của cây ngô 21 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. VẬT LIỆU 25 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 2.3.1. Phƣơng pháp sinh lí, hóa sinh 26 2.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 33 2.3.3. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 38 2.3.4. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen 38 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 38 2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 38 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HOÁ SINH HẠT CỦA 5 MẪU NGÔ ĐỊA PHƢƠNG NGHIÊN CỨU 39 3.1.1. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng hạt 39 3.1.2. Hàm lƣợng protein và lipid 39 3.1.3. Hoạt tính α - amylase 41 3.1.4. Hoạt tính protease 41 3.1.5. Chiều dài rễ của 5 mẫu ngô địa phƣơng ở giai đoạn cây non 42 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA 5 MẪU NGÔ ĐỊA PHƢƠNG Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON 43 3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN NAC 46 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 46 3.3.2. Kết quả nhân gen NAC 47 3.3.3. Kết quả tách dòng gen NAC 48 3.3.4. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp 49 3.3.5. Kết quả xác định trình tự gen NAC 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ABA Abscisic Acid (Axit abxisic) DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid) ASTT Áp suất thẩ m thấ u Bp Base pair (Cặ p base) CTAB Cetyltrimethyl – amonium bromide Đtg Đồng tác giả CYS Cystatin NAC NAM - ATAF – CUC HSP Heat shock protein (Protein số c nhiệ t) LEA Late embryogenesis abundant protein (Protein tí ch lũ y vớ i số lƣợ ng lớ n ở giai đoạ n cuố i củ a quá trì nh hì nh thà nh phôi) LTP Lipid transfer protein (Protein vậ n chuyể n lipid) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗ i polymerase) TAE Tris Acetate EDTA P5CS Pyroline – 5 – carboylate synthase MX mồi xuôi MN mồi ngƣợc NAM No Apical Merstem CUC Cup Shaped Cotyledon JA Jasmonic acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Trang Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn 2009 - 2011 8 Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô của một số quốc gia trên thế giới năm 2011 9 Bảng 1.3. Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô của Việt Nam từ 2008 - 2011 10 Bảng 2.1. Nguồn gốc 5 mẫu ngô nghiên cứu 25 Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị sử dụng 26 Bảng 2.3. Cặp mồi nhân gen NAC 34 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen NAC 35 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen NAC vào vector 36 Bảng 3.1. Hình thái và khối lƣợng hạt của 5 mẫu ngô địa phƣơng 39 Bảng 3.2. Hàm lƣợng protein và lipid của 5 mẫu ngô địa phƣơng 40 Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme α – amylase của 5 mẫu ngô địa phƣơng 41 Bảng 3.4. Hoạt tính protease của 5 mẫu ngô địa phƣơng 42 Bảng 3.5. Chiều dài rễ của 5 mẫu ngô địa phƣơng 43 Bảng 3.6. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của 5 mẫu ngô địa phƣơng 44 Bảng 3.7. Phổ hấp phụ DNA ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm của 5 mẫu ngô nghiên cứu 46 Bảng 3.8. Hệ số tƣơng đồng di truyền gen NAC ở 3 mẫu QB, VX, EU810024 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH SÁCH CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Trang Hình 2.1. Hình thái hạt của 5 mẫu ngô địa phƣơng 25 Hình 3.1. Đồ thị rada biểu diễn khả năng chịu hạn của 5 mẫu ngô nghiên cứu 45 Hình 3.2. Hình ảnh của 5 mẫu ngô nghiên cứu sau 7 ngày gây hạn 45 Hình 3.3. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 5 mẫu ngô địa phƣơng 46 Hình 3.4. Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen NAC ở 2 mẫu ngô VX, QB 47 Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen NAC ở 2 mẫu ngô VX và QB 48 Hình 3.6. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen NAC 49 Hình 3.7. Kết quả so sánh gen NAC của 3 mẫu QB, VX và EU810024 50 Hình 3.8. Kết quả so sánh đoạn mã hóa của gen NAC ở 2 mẫu nghiên cứu QB và VX 52 Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của protein NAC ở 2 mẫu nghiên cứu QB, VX và EU810024 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cây ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây lƣơng thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới. Ngô là thức ăn xanh và ủ chua rất tốt cho chăn nuôi gia súc, gia cầm. Ngoài ra, ngô còn là nguyên liệu của các nhà máy sản xuất rƣợu, cồn, tinh bột dầu, đƣờng glucose, bánh kẹo. Theo ƣớc tính có khoảng 670 mặt hàng khác nhau trong các ngành lƣơng thực, thực phẩm, dƣợc phẩm và công nghiệp nhẹ đƣợc sản xuất từ ngô. Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau lúa gạo của nông dân vùng trung du và miền núi phía Bắc và là cây lƣơng thực chính của đồng bào các dân tộc thiểu số ở các vùng núi cao. Ngô đƣợc trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác. Ngày nay các giống ngô lai có năng suất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật, đang đƣợc trồng phổ biến ở các vùng miền trong cả nƣớc. Trong khi đó các giống ngô địa phƣơng hạt dẻo, thơm ngon, có khả năng chịu hạn tốt nhƣng do có năng suất thấp nên ít đƣợc quan tâm phát triển. Mặt khác, nƣớc ta có 75% diện tích là đồi núi, lƣợng mƣa hàng năm không đồng đều giữa các vùng, tình trạng hạn hán thƣờng xuyên xảy ra. Do đó, diện tích trồng các giống ngô địa phƣơng có xu hƣớng giảm, nhiều giống ngô quý hiếm đã bị mất dần. Hơn thế nữa, tại một số tỉnh miền núi nhƣ: Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Sơn La, Điện Biên, Cao Bằng đặc biệt là ở Hà Giang do khó khăn về sản xuất lúa nƣớc nên phần lớn đồng bào dân tộc ít ngƣời nhƣ: dân tộc H.Mông, Dao, Tày, Nùng đã sử dụng ngô làm lƣơng thực, thực phẩm chính thay gạo. Nhƣng do tập quán canh tác lạc hậu nên năng suất của các giống ngô này còn thấp. Nhân tố phiên mã NAC là một họ protein có chức năng rất đa dạng, giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật, quá trình lão hóa, phát triển hình thái, con đƣờng truyền tín hiệu, điều chỉnh nội tiết tố và phản ứng với những tác động khác nhau từ ngoại cảnh [...]... mẫu ngô địa phƣơng - Xác định chiều dài rễ ở giai đoạn cây non của 5 mẫu ngô địa phƣơng - Đánh giá khả năng chịu hạn của 5 mẫu ngô nghiên cứu bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo - Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân gen NAC liên quan đến khả năng chịu hạn ở 2 mẫu ngô địa phƣơng nghiên cứu - Tách dòng và xác định trình tự gen NAC ở 2 mẫu ngô nghiên cứu: một mẫu ngô có khả năng chịu hạn tốt và một mẫu ngô chịu hạn. .. chịu hạn của cây ngô non trong điều kiện hạn nhân tạo [20], đánh giá chất lƣợng hạt và khả năng phản ứng đối với hạn của một số giống ngô địa phƣơng miền núi [10]… Tuy nhiên, còn rất ít công trình đề cập đến phân lập gen liên quan đến khả năng chịu hạn của cây ngô địa phƣơng Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: Nghiên cứu phân lập gen NAC liên quan đến khả năng chịu hạn ở một số. .. việc nghiên cứu và chọn tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn, là việc làm hết sức cần thiết, góp phần bảo tồn nguồn gen, tạo vật liệu cho lai giống và làm tăng năng suất của các giống ngô địa phƣơng Từ những năm 90 của thế kỷ XX đến nay, đã có một số công trình quan tâm nghiên cứu đến khả năng chịu hạn của cây ngô nhƣ: Đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô trên đồng ruộng [16], đánh giá khả năng chịu. .. quan đến khả năng chịu hạn ở một số giống ngô địa phƣơng Hà Giang - Việt Nam 2 Mục tiêu của đề tài - Đánh giá chất lƣợng hạt và khả năng chịu hạn thông qua một số đặc điểm sinh lí, hóa sinh - Tạo dòng và xác định đƣợc trình tự gen NAC liên quan đến khả năng chịu hạn của một số mẫu ngô địa phƣơng ở Hà Giang - Việt Nam 3 Nội dung của đề tài - Xác định hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, hoạt tính của α... RAPD, nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen ở ngô, xây dựng phƣơng pháp tạo dòng thuần bằng nuôi cấy bao phấn, phân lập gen dehydrin, và nghiên cứu chiếu xạ một số giống cây ngô nhằm phát triển các giống ngô cho năng suất cao Tuy nhiên, vẫn còn ít công trình đi sâu nghiên cứu tính đa dạng di truyền, khả năng chịu hạn, và mối quan hệ giữa khả năng chịu hạn của các giống ngô địa. .. đổi thành phần hoá sinh trong tế bào Hiện nay, trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về tính chịu hạn của cây ngô Võ Quốc Việt đã tiến hành nghiên cứu 15 giống ngô chịu hạn nhập nội, kết quả chọn đƣợc 2 giống chịu hạn cao và đã đƣa ra trồng thử nghiệm tại một số địa phƣơng miền núi (BT1 và BT2) [21] Phan Thị Vân, Ngô Hữu Tình, Luân Thị Đẹp đánh giá khả năng chịu hạn của... phát triển ở các mô gốc làm kéo dài rễ liên quan đến khả năng chịu hạn của cây Việc nghiên cứu các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp thành tế bào nhằm ứng dụng trong sản suất sinh khối thực vật ở quy mô công nghiệp [25] Wei và đtg đã phân lập đƣợc 6 gen NAC (MaNAC1, MaNAC 2, MaNAC3, MaNAC4, MaNAC5, MaNAC6 ) tham gia vào quá trình chín của trái cây chuối thông qua sự tƣơng tác với thành phần... gây ra bởi JA là: GRAB2, RIM1 (ONAC054), ANAC019, ANAC055, và ATAF-2 (ANAC081)…[33], [34] Những nghiên cứu khác trên các đối tƣợng thuộc chi Arabidopsis các nhà khoa học đã phân lập đƣợc khoảng 149 gen NAC Gen NAC1 ở Arabidopsis đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của rễ bên Gen NAC có chức năng kiểm soát sự phân chia và mở rộng tế bào trong nhị hoa và cánh hoa Một số gen NAC khác ở chi Arabidopsis... Arabidopsis liên quan đến khả năng chịu hạn nhƣ ATAF-1 (ANAC002) , ANAC019, ANAC055, NTL6 (ANAC062), và RD26 (ANAC072) [24] Phân tích biểu hiện gen ở Arabidopsis và lúa cho thấy quá trình hình thành cấu trúc của thành tế bào thứ cấp là một cơ chế kiểm soát kết hợp của 3 nhóm gen NAC: SND, NST và VND Hầu hết cả ba gen này ƣu tiên thể hiện ở thân cây đặc biệt ở lóng thứ hai Các gen SND (SND1, SND2) và gen NST... núi với nhóm gen liên quan Do vậy, tiếp tục sƣu tập và nghiên cứu các giống ngô địa phƣơng góp phần bảo tồn nguồn gen cây ngô là việc làm cần thiết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 16 1.2.4 Cơ sở sinh lý, hóa sinh và di truyền của tính chịu hạn của cây ngô 1.2.4.1 Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn của cây ngô Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của . tài: Nghiên cứu phân lập gen NAC liên quan đến khả năng chịu hạn ở một số giống ngô địa phƣơng Hà Giang - Việt Nam . 2. Mục tiêu của đề tài - Đánh giá chất lƣợng hạt và khả năng chịu hạn thông. giá khả năng chịu hạn của 5 mẫu ngô nghiên cứu bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo. - Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân gen NAC liên quan đến khả năng chịu hạn ở 2 mẫu ngô địa phƣơng nghiên cứu. . NGUYỄN VĂN TƢỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN NAC LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở MỘT SỐ GIỐNG NGÔ ĐỊA PHƢƠNG HÀ GIANG - VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH