3. Nội dung của đề tài
2.3.2.Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và đtg [26] nhƣ sau:
- Hóa chất: Nitơ lỏng, đệm rửa (Tris HCl 1 M; EDTA 0,5 M, pH = 8; Sorbitol 2 M; NaH2PO4 0,4%; H2O), đệm tách (Tris HCl 1 M; NaCl 5 M; EDTA; CTAB 4%; H2O), cồn 70%, Chloroform : Isoamyl (24:1), Isopropannol 100%.
- Quy trình tách DNA:
+ Thu 0,2 – 0,3g mẫu lá ngô, dùng cối, chày sứ nghiền mẫu cùng với Nitơ lỏng thành dạng bột min.
+ Bổ sung 0,8 ml đệm rửa, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi. Bƣớc này làm hai lần.
+ Thêm 700 µl đệm tách, trộn nhẹ. Ủ 65oC ít nhất 1giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Thêm 600 µl Chloroform : Isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút (dùng máy trộn càng tốt).
+ Ly tâm khoảng 13000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Hút 500 µl dịch trong ở pha trên sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
+ Thêm 500 µl Isopropannol, trộn nhẹ, đặt lên đá (để tủ lạnh qua đêm) chờ có tủa trắng.
+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. + Bổ sung 300 µl cồn 70% búng nhẹ.
+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần). + Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt.
+ Hòa tan DNA trong 50 µl nƣớc khử ion. + Điện di kiểm tra
+ Mẫu đƣợc giữ ở - 200C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phƣơng pháp:
- Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:
Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng.
Độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 đƣợc coi là đảm bảo chất lƣợng.
- Phƣơng pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.3.2.3. Kỹ thuật PCR
Thực hiện phản ứng PCR nhân gen NAC với chu trình nhiệt: 94o
C - 4 phút, 94o C - 30 giây, 54o C - 30 giây, 72o C - 1 phút (30 chu kỳ); 72o C -7 phút, 4o C-.
Để khuếch đại đƣợc gen NAC từ 5 giống ngô địa phƣơng, chúng tôi dựa vào trình tự gen NAC có mã số EU810024 đƣợc công bố trên ngân hàng gen NCBI để phục vụ việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu. Gen NAC đƣợc khuếch đại có kích thƣớc khoảng 1040 bp. Cặp mồi đặc hiệu đƣợc chúng tôi đặt tổng hợp tại hãng Bioneer (Hàn Quốc).
Để có thể tiếp tục sử dụng cặp mồi, nhân gen NAC phục vụ việc chuyển gen sau này nên trong khi thiết kế mồi ngoài phần đặc hiệu của mồi chúng tôi đã bổ sung thêm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn (6 nucleotide) vào 2 đầu của mồi xuôi và mồi ngƣợc. Mồi xuôi đƣợc thiết kế bổ sung thêm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn BamHI, mồi ngƣợc đƣợc thiết kế bổ sung thêm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn SacI.
Trình tự cặp mồi thể hiện trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Cặp mồi nhân gen NAC
Mồi Trình tự mồi Nhiệt độ
gắn mồi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MN GGAGCTCTCAGAACTGTCCCAACCCG 54o C
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen NAC
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Buffer PCR10X 2,5 2 MgCl2 (25mM) 2,5 3 dNTP (2,5 mM) 2,0 4 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2,0 5 Mồi ngƣợc (10 pM/µl) 2,0 6 Taq-polymerase (5U/1µl) 1,0 7 DNA tổng số 2,0 8 H2O 11,0 Tổng 25,0
Sau khi thu đƣợc sản phẩm nhân gen chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm nhân gen: điện di sản phẩm nhân gen trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.3.2.4. Làm sạch sản phẩm PCR (thôi gel)
Sau khi nhân đƣợc gen, bƣớc tiếp theo là cần thu nhận gen ở dạng sạch và không lẫn gel agarose để sử dụng cho công việc tạo dòng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thôi gel để làm sạch sản phẩm PCR theo bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo.
Điện di sản phẩm PCR, nhuộm EtBr, soi trên đèn UV, cắt lấy phần gel có chứa đoạn gen có kích thƣớc yêu cầu, cho vào Epp 2ml.
- Bổ sung Binding Buffer vào Epp có chứa gel với tỉ lệ 1 : 1 (v/w). vd: bổ sung 100 µL của Binding Buffer cho mỗi 100mg gel
- Giữ Epp ở 55-600C trong 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn - Hút chuyển phần dịch lên cột tinh sạch
- Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC. Bỏ phần dịch - Thêm 700µl Wash Buffer vào cột tinh sạch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Ly tâm thêm 1 lần 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC để loại bỏ hoàn toàn Wash Buffer trên cột tinh sạch. Bỏ phần dịch
- Tùy lƣợng DNA sử dụng bổ sung 20-50µl H2O - Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC
- Điện di kiểm tra
- Sản phẩm đƣợc giữ ở -20oC
2.3.2.5. Tách dòng gen
Tạo plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm PCR đã làm sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector pBT với thành phần phản ứng trong bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen NAC vào vector
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Buffer T4 ligase 1,0 2 Sản phẩm thôi gel 5,0 3 Vector pBT 1,0 4 T4 ligase (2 unit/µl) 1,0 5 H2O 2,0 Tổng 10,0 Hỗn hợp đƣợc ủ ở nhiệt độ 22o
C trong 1 giờ và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 .
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5
Tế bào khả biến lấy trong tủ -800C. Sau đó để trên đá lạnh tan từ từ trong 10 phút.
Cho 10µl vector vào ống chứa tế bào khả biến E.coli DH5α, mix nhẹ, đặt ổn định trên đá 10 phút.
Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây, đặt trong đá 10 phút. (Sốc nhiệt để giúp giãn màng tế bào vi khuẩn tạo thàh các lỗ nhỏ, để vector tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi khuẩn).
Bổ sung 500µl LB lỏng vào ống tế bào đã sốc nhiệt, sau đó đem đi nuôi phục hồi ở 37o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lấy ra cấy trải trên môi trƣờng LB đặc (peptone, cao nấm men, NaCl và agar) có kháng sinh ampicilin (100 mg/l), IPTG (0,1 mM) và X - gal (40 mg/l). Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin 100 mg/l).
Kiểm tra sản phẩm chọn dòng
Lấy dịch nuôi chứa khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thực hiện tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR nhân gen cystatin, nhƣng DNA tổng số thay bằng DNA plasmid (2 µl). Sản phẩm PCR chọn dòng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tách plasmid tái tổ hợp * Giữ chủng khuẩn :
Cho 300µl glycerol và 700µl khuẩn cho vào nito lỏng . Sau đó đƣa vào tủ -80oC để bảo quản. * Tách plasmid A. Chuẩn bị 1.SolI: 50mM glucose 25mM Tris-HCl pH=8,0 10mM EDTA pH=8,0 2.SolII: 0,2N NaOH 1% SDS 3.SolII: 60ml CH3COOK 5M 11,5ml acetic acid 28,5ml H2O
4. Dung dịch: Phenol: Chloroform(1:1) lạnh 5. Lysozyme : 20mg/ml
B. Quy trình
1.Hút 2ml dịch khuẩn cho vào eppendorf, ly tâm 5000 rpm 5 phút,40C 2. Bỏ dịch nổi, thu sinh khối cặn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3. Bổ sung 200µL Sol I(lạnh),vortex cho tan đều.
4. Bổ sung 10µL lysozyme 20mg/ml, đảo nhẹ, để lắng trong đá 10 phút 5. Bổ sung 400µL Sol II lắc nhẹ nhàng 5 lần cho tan đều đặt ngay trong đá 6. Bổ sung 300µL Sol III(lạnh) đảo nhẹ vài lần để trong đá lạnh (3-5 phút) 7. Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 40C. Hút dịch nổi (pha trên) cho vào ống eppendorf mới
8. Thêm phenol: Chloroform(1:1) hoặc chloroform: Isoamyl (24:1) theo tỉ lệ 1:1 (v/v) vortex đều, ly tâm 12000 rpm trong 15 phút ở 4oC. Hút dịch pha trên cho vào ống eppendorf mới
9. Bổ sung Isopropanol theo tỉ lệ 1:1 để trong tủ -20oC trong 30 phút 10. Ly tâm 12000 rpm 15 phút,40C, Loại dịch thu cặn
12. Thêm 1ml cồn 70% để rửa. Ly tâm 10000rpm 10 phút, 40C 13. Bỏ dịch, thu cặn, làm khô
14. Hòa tan cặn trong 30µL nƣớc chứa RNAse 15. Giữ trong tủ -20 để bảo quản