3. Nội dung của đề tài
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN NAC
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Lấy lá non của 5 mẫu ngô địa phƣơng sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Sau khi tách chiết và tinh sạch, hàm lƣợng và độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Đồng thời, DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X và chụp ảnh trên máy soi gel để đánh giá chất lƣợng DNA. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.3
Hình 3.3. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 5 mẫu ngô địa phƣơng
(1: VX, 2: ĐV, 3: QB, 4: MV, 5: BM)
Tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lƣợng của DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Phổ hấp phụ DNA ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm
của 5 mẫu ngô nghiên cứu
Tên giống A260 A280 A260/280 Hàm lƣợng
DNA (ng/μl) VX 0,326 0,167 1,952 815,00 MV 0,250 0,134 1,865 625,00 ĐV 0,263 0,139 1,892 657,50 QB 0,317 0,164 1,933 792,50 BM 0,255 0,136 1,875 637,50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ bảng 3.7 cho thấy: tỷ số A269/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0 chứng tỏ các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Kết quả nhân gen NAC
Sau khi tiến hành kiểm tra và đảm bảo độ tinh sạch của DNA tổng số thu đƣợc, chúng tôi đã tiến hành nhân gen NAC của 2 mẫu ngô, một mẫu ngô có khả năng chịu hạn tốt, một mẫu ngô có khả năng chịu hạn kém bằng phƣơng pháp PCR. Thành phần phản ứng PCR đƣợc thể hiện ở bảng 2.4. Nhiệt độ gắn mồi đƣợc chúng tôi tính toán dựa trên đặc điểm trình tự mồi đã thiết kế. Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 54oC. Sau 30 chu kì phản ứng, kết quả nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với marker 1kb và đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen NAC ở 2 mẫu ngô VX, QB
Ghi chú: M. marker 1kb (Guangzhou Geneshun Biotech Ltd)
Qua hình 3.4 cho thấy băng DNA sáng rõ gọn và đẹp. So sánh với marker chúng tôi nhận thấy, đã khuếch đại đƣợc gen NAC ở cả 2 mẫu ngô địa phƣơng VX và QB với kích thƣớc khoảng 1100 bp, kích thƣớc này đúng với kích thƣớc dự kiến khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu.
1100bp 500bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.3. Kết quả tách dòng gen NAC
Sản phẩm PCR nhân gen NAC có các sản phẩm phụ không mong muốn, các nucleotid dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme…Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiện quả cao nhất, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản phẩm PCR bằng bộ kít: GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo.
Sản phẩm PCR nhân gen NAC đƣợc làm sạch bằng bộ kít thôi gel, sau đó đƣợc gắn vào vector pBT để tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ở 42oC. Sau đó, nuôi vi khuẩn E.coli DH5 đã biến nạp trên môi trƣờng LB đặc nhƣ mô tả ở mục 2.3.2. 5.
Sau 16 giờ nuôi ổn định ở 37o C, trên đĩa petri xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng.
Chọn 4 khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn đều trên đĩa thạch chuyển sang nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin). Lấy dịch nuôi khuẩn thực hiện phản ứng colony - PCR với chính cặp mồi M13 để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm colony - PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di sản phẩm colony - PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen NAC
ở 2 mẫu ngô VX và QB
Ghi chú: Marker 1kb (hãng Guangzhou Geneshun Biotech Ltd)
1.3 1.4 M 1.5 1.6 2.1 2.2 2.3 2.4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.4. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp
Chọn khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với 2 mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony - PCR ở trên tách plasmid tái tổ hợp. Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di tách plasmid đƣợc thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen NAC
M: marker 1kb (Guangzhou Geneshun Biotech Ltd) VX: Plasmid mang gen NAC của mẫu ngô VX QB: Plasmid mang gen NAC của mẫu ngô QB
Kết quả điện di trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen NAC.
3.3.5. Kết quả xác định trình tự gen NAC
Để xác định trình tƣ̣ nucleotide của ge n NAC đã tách dòng, chúng tôi gửi đọc trình tự nucleotide của gen NAC trên thiết bị giải trình tƣ̣ tƣ̣ động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Kết quả xác định trình tự gen đƣợc so sánh trên phần mềm BLAST của Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen NAC mà chúng tôi phân lập có độ tƣơng đồng cao so với trình tự gen NAC trên NCBI. Nhƣ vậy, trình tự gen NAC của 2 mẫu ngô nghiên cứu đã đƣợc xác định chính xác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh trình tự gen NAC của 2 mẫu ngô nghiên cứu với 1 mẫu có mã số EU810024 trên ngân hàng gen NCBI, kết quả so sánh trình bày ở hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả so sánh gen NAC của 3 mẫu QB, VX và EU810024
Chiều dài gen NAC phân lập từ mẫu QB dài 1041 bp tính từ mã mở đầu đến mã kết thúc, với 2 exon và 1 intron. Exon 1 dài 471 bp, exon 2 dài 468 bp; intron dài 102 bp (từ vị trí 472 đến 573); kích thƣớc của gen NAC ở mẫu QB bằng với mẫu đã đăng kí trên Ngân hàng gen với mã số EU810024.
Chiều dài gen NAC phân lập từ mẫu VX là 1035 bp (ngắn hơn mẫu QB 6 nucleotide); Exon 1 dài 471 bp, exon 2 dài 468 bp; intron dài 96 bp (từ vị trí 472 đến 567).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả so sánh 3 mẫu QB, VX, EU810024 cho thấy, hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng 98,4-99,5%. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Hệ số tƣơng đồng di truyền gen NAC ở 3 mẫu QB, VX, EU810024
EU810024 QB VX EU810024 100 99,5 98,4
QB 100 98,5
VX 100
Tuy chiều dài gen NAC ở 2 mẫu nghiên cứu có khác nhau nhƣng exon1, exon2, đoạn mã hóa của cả 2 mẫu đều nhƣ nhau. Sự sai khác về kích thƣớc gen chỉ nằm ở vùng intron. Đoạn mã hóa amino acid của cả 2 mẫu nghiên cứu và mẫu trên Ngân hàng gen đều dài 939 bp. Đoạn mã hóa của 2 mẫu nghiên cứu sai khác 4 nucleotide ở các vị trí: 420 (T→C), 435(T→C), 504 (T→C), 541 (G→A) với hệ số tƣơng đồng là 99,5%. Kết quả thể hiện ở hình 3.8.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8. Kết quả so sánh đoạn mã hóa của gen NAC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trình tự amino acid suy diễn của protein NAC ở 2 mẫu ngô QB, VX và EU810024 đều dài 312 amino acid (trừ mã kết thúc). Kết quả so sánh trình tự amino acid trong protein NAC ở 3 mẫu QB, VX và EU810024 đƣợc thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của protein NAC
ở 2 mẫu nghiên cứu QB, VX và EU810024
Kết quả cho thấy, trình tự amino acid của protein NAC của 2 mẫu so sánh khác nhau ở 1 vị trí là 181 với hệ số tƣơng đồng 99,6%. Trình tự amino acid của protein NAC ở mẫu QB và mẫu EU810024 tƣơng đồng 100%.
Từ kết quả thu nhận sau khi xác định trình tự gen, chúng tôi nhận thấy trình tự gen và trình tự amino acid của mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng cao với trình tự gen NAC có mã số EU810024 trên ngân hàng gen quốc tế NCBI.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.Kết luận
1.1. Khối lƣợng 100 hạt của 5 mẫu ngô địa phƣơng dao động trong khoảng (27,9g ± 0,18) đến (29,6g ± 0,30). Chiều dài rễ ở giai đoạn cây non dao động từ 18,33 - 31,70 cm.
1.2. Các mẫu ngô nghiên cứu có hàm lƣợng protein trong hạt dao động từ: (9,16% ± 0,006) đến (10,05% ± 0,045). Hàm lƣợng lipid dao động trong khoảng (3,18 ± 0,060%) đến (3,42% ± 0,091). Mẫu ngô VX có hoạt tính - amylase mạnh nhất (0,008 đvhđ/mg) và mẫu ngô QB có hoạt tính - amylase yếu nhất (0,004 đvhđ/mg). Mẫu ngô có hoạt tính protease cao nhất là mẫu VX (0,013 đvhđ/mg) và mẫu ngô có hoạt tính protease thấp nhất là mẫu QB (0,007 đvhđ/mg).
1.3. Khả năng chịu hạn của các mẫu ngô có sự khác nhau, mẫu ngô VX là mẫu chịu hạn tốt nhất, mẫu ngô QB là mẫu chịu hạn kém nhất.
1.4. Chiều dài gen NAC của mẫu ngô QB là 1041 bp, còn của mẫu ngô VX là 1035 bp. Hệ số tƣơng đồng di truyền về trình tự nucleotide của gen NAC ở 2 mẫu nghiên cứu với EU810024 trong khoảng 98,4 - 99,5%.
1.5. Trình tự amino acid của protein NAC của 2 mẫu nghiên cứu và EU810024 đều dài 312 amino acid và hệ số tƣơng đồng amino acid của 2 mẫu nghiên cứu là 99,6%. Trình tự amino acid của protein NAC ở mẫu QB và mẫu EU810024 tƣơng đồng 100%.
2. Đề nghị
Tiếp tục xác định thêm trình tự gen NAC của các giống ngô khác để có cơ sở so sánh, xác định chỉ thị phân tử và phục vụ cho việc chuyển gen để có thể tạo ra đƣợc những giống ngô có khả năng chịu hạn tốt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Ngô Việt Anh (2005), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, hoá sinh hạt, khả năng chịu hạn và tính đa dạng di truyền của một số giống ngô nếp địa phương, Luận văn thạc sĩ sinh học.
2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi của cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
3. Bùi Mạnh Cƣờng, Trần Hồng Uy, Ngô Hữu Tình, Lê Quý Kha, Nguyễn Thị Thanh (2002), “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số dòng ngô đƣờng bằng phản ứng RAPD - markers”, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, tr.16 - 22. 4. Bùi Mạnh Cƣờng (2003), “Sử dụng chỉ thị RAPD trong nghiên cứu đa dạng di
truyền tập đoàn giống và ứng dụng để chọn lọc tổ hợp ngô lai năng suất cao phục vụ sản xuất”, Công nghệ sinh học, tr.745-749.
5. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo Dục.
6. Trần Thị Phƣơng Liên (1999), “Phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà nội, tr. 1348 - 1349.
7. Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein và tính chống chịu ở thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
8. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2002), Giáo trình cây lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp.
9. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình cây ngô, Nxb Nông nghiệp.
10. Chu Hoàng Mậu, Ngô Việt Anh (2005), “Đánh giá chất lƣợng hạt và khả năng phản ứng đối với hạn của một số giống ngô địa phƣơng miền núi”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn số 66, tr. 20 - 22.
11. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12. Chu Văn Mẫn, Ứng dụng tin trong sinh học (2003), NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr: 53 - 163.
13. Trần Văn Minh (2004), Cây ngô nghiên cứu và sản xuất, Nhà xuất bản nông nghiệp.
14. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
15. Phạm Thị Thanh Nhàn (2007), Nghiên cứu đặc tính chịu hạn và môi trường nuôi cấy in vitro của một số giống ngô địa phương miền núi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.
16. Dƣơng Văn Sơn (1996), Nghiên cứu một số vật liệu ngô chịu hạn nhập nội sử dụng trong công tác chọn tạo giống, Luận án PTS khoa học nông nghiệp.
17. Ngô Hữu Tình (1997), Cây ngô, NXB Nông nghịêp Hà Nội.
18. Ngô Hữu Tình, Bùi Mạnh Cƣờng, Ngô Minh Tâm (2002), “Xác định khoảng cách di truyền - nhóm ƣu thế lai - cặp lai năng suất cao bằng chỉ thị RAPD”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 4, tr. 289 - 291.
19. Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn và phân lập gen Cystatin ở một số giống đậu xanh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái nguyên.
20. Phan Thị Vân, Ngô Hữu Tình, Luân Thị Đẹp (2005), “Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các dòng và các tổ hợp ngô lai luân giao ở giai đoạn cây con bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn 2/2005.
21. Võ Quốc Việt (1996), Nghiên cứu một số vật liệu ngô chịu hạn nhập nội trong điều kiện Bắc Thái, Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
22. Alexandrov,N.N., Brover,V.V., Freidin,S.,Troukhan,M.E.,Tatarinova,T.V., Zhang,H., Swaller,T.J., Lu,Y.P., Bouck,J. lavell,R.B.and Feldmann,K.A(2013), “Insights into corn genes derived from large-scale cDNA sequencing”, Plant Mol. Biol. 69 (1-2), pp. 179 - 194.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
23. Dekova I, Christor, Angelova M (1987), “Effect of Abscisis acid DNA water stress on stomata biliuos DNA some indices of water status in maize plant”,
Plant growth. pp. 655 - 668.
24. Delessert C, Kazan K, Wilson IW, Van Der Straeten D, Manners J, Dennis ES, Dolferus R, (2005), “The transcription factor ATAF2 represses the expression of pathogenesis-related genes in Arabidopsis”, Plant J, 43(5), pp. 745 - 757. 25. Dongxia Yao, Qiang Wei, Wenying Xu, Ryan D Syrenne, Joshua S Yuan, Zhen
Su, (2012), “Comparative genomic analysis of NAC transcriptional factors to dissect the regulatory mechanisms for cell wall biosynthesis”, BMC Bioinformatics.pp. 567 - 575.
26. Gawel N.J., Jarret R.L., 1991, Genmic DNA isolation, Http:// www.igd.carnell.edu/pretoria % 20 lad % 20 mannual.doc.
27. Gaiyun Zhang, Ming Chen, Liancheng Li, Zhaoshi Xu, Xueping Chen,
JiamingGuo and Youzhi Ma (2009), “Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco”, Journal of Experimental Botany, 60(13), pp. 3781 - 3796.
28. Larque- Saavedra a, Rodriquez M (1989), ”Evidences for material in heritance of abscisis acid in relation to drought tolerance in zea mays L”, Phyion- Bouenos- Aires, pp. 145 - 150.
29. Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005), “Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses”,
Theor Appl Genet, 110(8), pp. 1355 - 1362.
30. Lin R., Zhao W., Meng X., Wang M., Peng Y., (2007), “Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea”, Plant Sci, 172 (1), pp. 120 - 130. 31. Liao Y., Zou H.F., Wang H.W., Zhang W.K., Ma B., Zhang J.S., Chen S.Y.,
(2008), “Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants”, Cell Res, 18(10), pp. 1047 - 1060.