3. Nội dung của đề tài
3.1.3. Hoạt tính α-amylase
Hoạt tính của enzyme - amylase chịu ảnh hƣởng lớn của điều kiện ngoại cảnh. Khi cây ngô gặp hạn sẽ làm hàm lƣợng - amylase tăng, từ đó làm tăng hàm
lƣợng đƣờng và tăng áp suất thẩm thấu. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đánh giá hoạt tính enzyme - amylase trong hạt của 5 mẫu ngô địa phƣơng. Kết quả đánh giá hoạt tính - amylase của các mẫu ngô nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 3.3.
Qua kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, các mẫu ngô nghiên cứu có hoạt tính enzyme - amylase khác nhau. Hoạt tính - amylase biểu hiện mạnh nhất ở mẫu
ngô VX (0,008 đvhđ/mg) và hoạt tính - amylase biểu hiện yếu nhất ở mẫu ngô QB (0,004 đvhđ/mg).
Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme α – amylase của 5 mẫu ngô địa phƣơng
STT Tên mẫu Hoạt tính enzyme α – amylase
(đvhđ/mg) 1 VX 0,008 ± 0,0010 2 MV 0,007 ± 0,0009 3 ĐV 0,006 ± 0,0005 4 QB 0,004 ± 0,0006 5 BM 0,005 ± 0,0007 3.1.4. Hoạt tính protease
Protease là enzyme tham gia vào phân giải các protein lạ hoặc protein bị biến tính khi cây trồng gặp điều kiện cực đoan (hạn, lạnh, nóng…) [7]. Dựa vào sự đánh giá này, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính protease trong hạt của 5 mẫu ngô nghiên cứu. Kết quả xác định hoạt tính protease đƣợc thể hiện trong bảng 3.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.4. Hoạt tính protease của 5 mẫu ngô địa phƣơng STT Tên mẫu Hoạt tính protease (đvhđ/mg)
1 VX 0,013 ± 0,002
2 MV 0,009 ± 0,001
3 ĐV 0,010 ± 0,002
4 QB 0,007 ± 0,001
5 BM 0,008 ± 0,001
Qua kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, hoạt tính protease ở các mẫu ngô khác nhau là khác nhau: Mẫu ngô nghiên cứu có hoạt tính protease cao nhất là mẫu VX (0,013 đvhđ/mg) và mẫu ngô nghiên cứu có hoạt tính protease thấp nhất là mẫu QB (0,007 đvhđ/mg).
3.1.5. Chiều dài rễ của 5 mẫu ngô địa phƣơng nghiên cứu ở giai đoạn cây non
Hiện nay, có nhiều quan điểm khác nhau giải thích cơ chế chịu hạn, trong đó có hai quan điểm đƣợc chấp nhận hơn cả là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Bộ rễ có hình thái khoẻ, dài, mập, có sức xuyên sâu cho cây hút đƣợc nƣớc ở những vùng sâu, vùng xa. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nƣớc của tế bào rễ cây đối với đất. Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu đƣợc các phân tử nƣớc hiếm hoi có trong đất nhờ vậy thực vật có thể vƣợt qua tình trạng hạn cục bộ.
Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nƣớc cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật. Nhờ khả năng hƣớng nƣớc, rễ ngô có thể tìm nguồn nƣớc và nguồn thức ăn một cách chủ động. Khi cây ngô gặp hạn, bộ rễ phát triển mạnh và ăn sâu để có thể tìm kiếm các nguồn nƣớc từ các lớp đất sâu. Vì vậy, sự phát triển và khả năng đâm xuyên của bộ rễ cũng là những chỉ tiêu để đánh giá và nhận dạng các giống ngô có khả năng chịu hạn. Cũng có thể nghiên cứu kích thƣớc rễ ở giai đoạn cây non để đánh giá khả năng chống chịu của cây ngô.
Kết quả nghiên cứu kích thƣớc rễ của các mẫu ngô nghiên cứu ở giai đoạn cây non 3 lá sau khi gây hạn đƣợc trình bày trong bảng 3.5.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.5. Chiều dài rễ của 5 mẫu ngô địa phƣơng
Từ bảng 3.5 cho thấy, chiều dài rễ ở giai đoạn cây non của 5 mẫu ngô địa phƣơng dao động từ 18,33 – 31,70 cm. Mẫu ngô có chiều dài rễ ngắn nhất là QB (18,33 cm), mẫu ngô có chiều dài rễ dài nhất là VX (31,70 cm).
Chiều dài rễ của các mẫu ngô nghiên cứu đƣợc xếp theo thứ tự giảm dần nhƣ sau:
VX>MV>ĐV>BM>QB
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA 5 MẪU NGÔ ĐỊA PHƢƠNG Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON PHƢƠNG Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON
Khả năng chịu hạn của cây ngô đƣợc biểu hiện rõ ở từng thời điểm. Nhƣng có hai thời kỳ cây ngô mẫn cảm nhất với điều kiện hạn đó là thời kỳ cây non và thời kỳ ra hoa. Do đó, chúng tôi đã đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các mẫu ngô nghiên cứu ở giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo theo tỉ lệ: tỉ lệ cây không héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7 ngày thí nghiệm. Từ đây tính đƣợc chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các mẫu ngô.
Khi bị hạn, lƣợng nƣớc trong tế bào giảm gây tổn thƣơng cho cây. Các giống khác nhau sẽ có những đáp ứng khác nhau để làm giảm hoặc tránh bị tổn thƣơng.
Tỷ lệ thiệt hại của mỗi mẫu ngô đƣợc xác định trên cơ sở theo dõi số cây héo, cây chết sau 3, 5, 7 ngày hạn, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.1.
STT Tên mẫu Kích thƣớc rễ (cm) 1 VX 31,70 ± 0,17 2 MV 28,33 ± 0,35 3 ĐV 22,83 1,12 4 QB 18,33 0,75 5 BM 19,83 ± 0,25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.6. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của 5 mẫu ngô địa phƣơng
Bảng 3.6 cho thấy, sau 3, 5, 7 ngày gây hạn, cả 5 mẫu nghiên cứu đều chịu ảnh hƣởng của hạn và tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra tăng theo thời gian gây hạn. Sau 3 ngày gây hạn, các mẫu ngô bắt đầu bị ảnh hƣởng nhƣng mức độ thấp, sau 5 ngày hạn, mức độ ảnh hƣởng đã tăng lên rõ rệt. Dựa trên số cây không héo và cây phục hồi ở trên chúng tôi tính chỉ số chịu hạn. Chỉ số chịu hạn giảm dần theo thứ tự sau:
VX>ĐV>MV>BM>QB
Nhƣ vậy, mẫu VX có chỉ số chịu hạn cao nhất (13662), mẫu có chỉ số chịu hạn thấp nhất là mẫu QB (4539).
Tên mẫu
3 ngày 5 ngày 7 ngày Chỉ số
chịu hạn %CKH %CPH %CKH %CPH %CKH %CPH VX 100 100 80 66,67 63,33 45,45 13662 MV 86,67 75 66,67 40 46,67 18,75 7591 ĐV 100 100 70 44,44 53,33 28,57 10776 QB 76,67 71,14 50 13,33 20 8,33 4539 BM 86,67 50 63,33 18,18 43,33 23,5 4694
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 %CKH3 %CPH3 %CKH5 %CPH5 %CKH7 %CPH7 VX MV ĐV QB BM
Hình 3.1. Đồ thị rada biểu diễn khả năng chịu hạn của 5 mẫu ngô nghiên cứu
Hình 3.2. Hình ảnh của 5 mẫu ngô nghiên cứu sau 7 ngày gây hạn
Nhƣ vậy, chúng tôi nhận thấy có sự liên quan giữa khả năng chịu hạn với hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, hoạt tính - amylase, protease, chiều dài rễ. Những giống có khả năng chịu hạn tốt thì hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, hoạt tính - amylase, protease, chiều dài rễ cũng cao. Ngƣợc lại, những giống chịu hạn kém thì hoạt độ - amylase, protease, chiều dài rễ thấp hơn so với giống chịu hạn
VX ĐV
MV
BM
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tốt. Từ kết quả ở trên, chúng tôi lựa chọn mẫu VX (chịu hạn tốt) và mẫu QB (chịu hạn kém) để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm của gen NAC.
3.3. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN NAC 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Lấy lá non của 5 mẫu ngô địa phƣơng sử dụng để tách chiết DNA tổng số. Sau khi tách chiết và tinh sạch, hàm lƣợng và độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Đồng thời, DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X và chụp ảnh trên máy soi gel để đánh giá chất lƣợng DNA. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.3
Hình 3.3. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 5 mẫu ngô địa phƣơng
(1: VX, 2: ĐV, 3: QB, 4: MV, 5: BM)
Tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lƣợng của DNA tổng số bằng phƣơng pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Phổ hấp phụ DNA ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm
của 5 mẫu ngô nghiên cứu
Tên giống A260 A280 A260/280 Hàm lƣợng
DNA (ng/μl) VX 0,326 0,167 1,952 815,00 MV 0,250 0,134 1,865 625,00 ĐV 0,263 0,139 1,892 657,50 QB 0,317 0,164 1,933 792,50 BM 0,255 0,136 1,875 637,50
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ bảng 3.7 cho thấy: tỷ số A269/A280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0 chứng tỏ các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, có thể sử dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Kết quả nhân gen NAC
Sau khi tiến hành kiểm tra và đảm bảo độ tinh sạch của DNA tổng số thu đƣợc, chúng tôi đã tiến hành nhân gen NAC của 2 mẫu ngô, một mẫu ngô có khả năng chịu hạn tốt, một mẫu ngô có khả năng chịu hạn kém bằng phƣơng pháp PCR. Thành phần phản ứng PCR đƣợc thể hiện ở bảng 2.4. Nhiệt độ gắn mồi đƣợc chúng tôi tính toán dựa trên đặc điểm trình tự mồi đã thiết kế. Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 54oC. Sau 30 chu kì phản ứng, kết quả nhân gen đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với marker 1kb và đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen NAC ở 2 mẫu ngô VX, QB
Ghi chú: M. marker 1kb (Guangzhou Geneshun Biotech Ltd)
Qua hình 3.4 cho thấy băng DNA sáng rõ gọn và đẹp. So sánh với marker chúng tôi nhận thấy, đã khuếch đại đƣợc gen NAC ở cả 2 mẫu ngô địa phƣơng VX và QB với kích thƣớc khoảng 1100 bp, kích thƣớc này đúng với kích thƣớc dự kiến khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu.
1100bp 500bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.3. Kết quả tách dòng gen NAC
Sản phẩm PCR nhân gen NAC có các sản phẩm phụ không mong muốn, các nucleotid dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme…Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiện quả cao nhất, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch (thôi gel) sản phẩm PCR bằng bộ kít: GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo.
Sản phẩm PCR nhân gen NAC đƣợc làm sạch bằng bộ kít thôi gel, sau đó đƣợc gắn vào vector pBT để tạo vector tái tổ hợp. Vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ở 42oC. Sau đó, nuôi vi khuẩn E.coli DH5 đã biến nạp trên môi trƣờng LB đặc nhƣ mô tả ở mục 2.3.2. 5.
Sau 16 giờ nuôi ổn định ở 37o C, trên đĩa petri xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và màu trắng.
Chọn 4 khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn đều trên đĩa thạch chuyển sang nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng (có bổ sung ampicilin). Lấy dịch nuôi khuẩn thực hiện phản ứng colony - PCR với chính cặp mồi M13 để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm colony - PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di sản phẩm colony - PCR đƣợc thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen NAC
ở 2 mẫu ngô VX và QB
Ghi chú: Marker 1kb (hãng Guangzhou Geneshun Biotech Ltd)
1.3 1.4 M 1.5 1.6 2.1 2.2 2.3 2.4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.4. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp
Chọn khuẩn lạc trắng tƣơng ứng với 2 mẫu nghiên cứu có sản phẩm colony - PCR ở trên tách plasmid tái tổ hợp. Sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X. Kết quả điện di tách plasmid đƣợc thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen NAC
M: marker 1kb (Guangzhou Geneshun Biotech Ltd) VX: Plasmid mang gen NAC của mẫu ngô VX QB: Plasmid mang gen NAC của mẫu ngô QB
Kết quả điện di trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen NAC.
3.3.5. Kết quả xác định trình tự gen NAC
Để xác định trình tƣ̣ nucleotide của ge n NAC đã tách dòng, chúng tôi gửi đọc trình tự nucleotide của gen NAC trên thiết bị giải trình tƣ̣ tƣ̣ động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Kết quả xác định trình tự gen đƣợc so sánh trên phần mềm BLAST của Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen NAC mà chúng tôi phân lập có độ tƣơng đồng cao so với trình tự gen NAC trên NCBI. Nhƣ vậy, trình tự gen NAC của 2 mẫu ngô nghiên cứu đã đƣợc xác định chính xác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh trình tự gen NAC của 2 mẫu ngô nghiên cứu với 1 mẫu có mã số EU810024 trên ngân hàng gen NCBI, kết quả so sánh trình bày ở hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả so sánh gen NAC của 3 mẫu QB, VX và EU810024
Chiều dài gen NAC phân lập từ mẫu QB dài 1041 bp tính từ mã mở đầu đến mã kết thúc, với 2 exon và 1 intron. Exon 1 dài 471 bp, exon 2 dài 468 bp; intron dài 102 bp (từ vị trí 472 đến 573); kích thƣớc của gen NAC ở mẫu QB bằng với mẫu đã đăng kí trên Ngân hàng gen với mã số EU810024.
Chiều dài gen NAC phân lập từ mẫu VX là 1035 bp (ngắn hơn mẫu QB 6 nucleotide); Exon 1 dài 471 bp, exon 2 dài 468 bp; intron dài 96 bp (từ vị trí 472 đến 567).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả so sánh 3 mẫu QB, VX, EU810024 cho thấy, hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng 98,4-99,5%. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Hệ số tƣơng đồng di truyền gen NAC ở 3 mẫu QB, VX, EU810024
EU810024 QB VX EU810024 100 99,5 98,4
QB 100 98,5
VX 100
Tuy chiều dài gen NAC ở 2 mẫu nghiên cứu có khác nhau nhƣng exon1, exon2, đoạn mã hóa của cả 2 mẫu đều nhƣ nhau. Sự sai khác về kích thƣớc gen chỉ nằm ở vùng intron. Đoạn mã hóa amino acid của cả 2 mẫu nghiên cứu và mẫu trên Ngân hàng gen đều dài 939 bp. Đoạn mã hóa của 2 mẫu nghiên cứu sai khác 4 nucleotide ở các vị trí: 420 (T→C), 435(T→C), 504 (T→C), 541 (G→A) với hệ số tƣơng đồng là 99,5%. Kết quả thể hiện ở hình 3.8.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8. Kết quả so sánh đoạn mã hóa của gen NAC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trình tự amino acid suy diễn của protein NAC ở 2 mẫu ngô QB, VX và EU810024 đều dài 312 amino acid (trừ mã kết thúc). Kết quả so sánh trình tự amino acid trong protein NAC ở 3 mẫu QB, VX và EU810024 đƣợc thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của protein NAC
ở 2 mẫu nghiên cứu QB, VX và EU810024
Kết quả cho thấy, trình tự amino acid của protein NAC của 2 mẫu so sánh khác nhau ở 1 vị trí là 181 với hệ số tƣơng đồng 99,6%. Trình tự amino acid của protein NAC ở mẫu QB và mẫu EU810024 tƣơng đồng 100%.
Từ kết quả thu nhận sau khi xác định trình tự gen, chúng tôi nhận thấy trình tự gen và trình tự amino acid của mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng cao với trình tự gen NAC có mã số EU810024 trên ngân hàng gen quốc tế NCBI.