3. Nội dung của đề tài
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp sinh lí, hóa sinh
2.3.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn
Để đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của 5 mẫu ngô địa phƣơng ở Hà Giang - Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện ở giai đoạn cây non theo phƣơng pháp của Lê Trần Bình và đtg [2].
Tiến hành gieo hạt ngô vào các chậu trồng bằng nhựa chứa cát vàng đã rửa sạch, mỗi chậu trồng 30 cây, mỗi giống gieo vào một chậu, thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần với điều kiện và chế độ chăm sóc nhƣ nhau. Tƣới nƣớc cho đến khi cây có 3 lá. Sau khi cây có 3 lá tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách không tƣới nƣớc đến khi cây héo, trong quá trình gây hạn che không cho nƣớc mƣa vào chậu. Thời điểm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tiến hành thí nghiệm đƣợc thực hiện vào mùa khô từ tháng 9 - 11 âm lịch. Khi cây non có 3 lá thật bắt đầu héo, tiến hành theo dõi mức độ héo của cây trong vòng 3, 5, 7 ngày kể từ khi thí nghiệm bắt đầu có cây héo. Sau đó tƣới nƣớc trở lại và theo dõi khả năng phục hồi của cây sau 3, 5, 7 ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: a: % cây không héo sau 3 ngày hạn; b: % cây phục hồi sau 3 ngày hạn; c: % cây không héo sau 5 ngày hạn; d: % cây phục hồi sau 5 ngày hạn; e: % cây không héo sau 7 ngày hạn; f: % cây phục hồi sau 7 ngày hạn;.
Khả năng chịu hạn của các giống ngô đƣợc đánh giá bằng chỉ số chịu hạn tƣơng đối (S). Chỉ số chịu hạn tƣơng đối đƣợc xác định bằng đồ thị rada, gồm các trục a, b, c, d, e, f, và mang các trị số tƣơng ứng mang các trị số tƣơng ứng an, bn, cn, dn, en, fn, và chỉ số chịu hạn tƣơng đối đƣợc tính bằng đồ thị rada theo công thức:
Sn =
2 1
sin α (an bn + bn cn + cn dn + dnen + en fn )
Góc α đƣợc tạo bởi 2 trục mang trị số gần nhau; Sn: chỉ số chịu hạn tƣơng đối; n: ký hiệu các giống nghiên cứu.
2.3.1.2. Định lượng lipid tổng số
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng lipid của hạt 5 mẫu ngô địa phƣơng theo nguyên tắc hòa tan của lipid trong dung môi hữu cơ là ete dầu hỏa (Petroleum ether). Tách chiết lipid ở 40C, li tâm 12000 vòng/phút để thu dịch. Hàm lƣợng lipid đƣợc tính bằng hiệu số của khối lƣợng mẫu trƣớc và khối lƣợng mẫu sau khi chiết. Hàm lƣợng lipid đƣợc tính bằng % khối lƣợng khô [5]
% L =a b
a
x 100%
Trong đó: a: Khối lƣợng mẫu trƣớc khi chiết b: Khối lƣợng mẫu sau khi chiết
2.3.1.3 Định lượng protein tan tổng số
Để định lƣợng protein tan tổng số trong hạt 5 mẫu ngô nghiên cứu, chúng tôi tiến hành theo phƣơng pháp Lowry dùng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn [5].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp phosphomolipdate – phosphovonphramate (Foling – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 750 nm. Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định đƣợc hàm lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu. Đơn vị tính hàm lƣợng protein là phần trăm khối lƣợng khô.
Cách tính hàm lƣợng protein:
% Pr =a H.
g x 100% Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ
H: hệ số pha loãng g: số gam mẫu phân tích
2.3.1.4. Xác định hoạt tính protease
Chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính enzyme protease theo phƣơng pháp Anson [14].
* Nguyên tắc:
Cho protease tác dụng với cơ chất là casein (hoặc hemoglobin), sản phẩm tạo thành là các peptide ngắn hay amino acid, trong các loại amino acid, tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Foling, từ đó xác định hoạt tính enzyme protease theo định nghĩa:
Hoạt tính của protease đƣợc biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1 ml dung dịch hay 1 mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,50
C, pH 7,6).
* Hóa chất:
- Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7,6 - Dung dịch đệm Phosphate pH 7.0
- Dung dịch casein 1%: sử dụng xác định hoạt độ enzyme papain và pancreatin - Dung dịch hemoglobin 2% trong dung dịch HCl 0.06 N để xác định hoạt độ pepsin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Dung dịch TCA (trichloro acid) 10% - Dung dịch NaOH 0,5N
- Dung dịch HCl 0,2N Dung dịch tyrosine 20mM/l: khuấy nghiền 0,118g tyrosine trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50 ml
- Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/l: pha loãng 5 ml tyrosine 20mM/l trong HCl 0,2N thành 100 ml
* Tiến hành thí nghiệm:
- Chuẩn bị dung dịch tyrosin chuẩn
Từ dung dịch tyrosin chuẩn 1 µM/l , xây dựng đƣờng chuẩn với dung dịch tyrosin có nồng độ từ 0,2 - 1,0 µM/l .
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2 3 4 5 6
Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0
Lượng tyrosine tương ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 5,0
Dung dịch HCl 0,2N (ml) 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 5,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10
Thuốc thử Foling (ml) 3 3 3 3 3 3
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bƣớc sóng 660nm
Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đƣờng chuẩn tyrosine tƣơng quan tƣơng quan giữa lƣợng tyrosine (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN - ODKC ).
- Phương pháp tiến hành
+ Chiết mẫu
Mẫu cân chính xác 10g (đối với mẫu rắn), định mức vừa đủ 100 ml bằng nƣớc cất đem lắc trên máy lắc trong vòng 15 phút. Đem ly tâm lạnh với 4000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch, bỏ bã.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không.
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Dung dịch casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 10% (ml) 0 5
Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 30 phút
Dung dịch TCA 10% (ml) 5 0
Dịch enzyme mẫu (ml) 1 0
Lọc, lấy 1 ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc (ml) 1 1
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2
Thuốc thử Foling (ml) 0,6 0,6
Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bƣớc sóng 660 nm
* Cách tính hoạt độ protease:
Hoạt độ Protease (UI/ml) = . .
.
X V K t v
Trong đó:
X: số µ mol tyrosine suy ra từ đƣờng chuẩn
V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)
K: độ pha loãng mẫu
t: thời gian phản ứng (30 phút)
1 UI (Anson) = 1micromol tyrosine/ml/phút hoặc = 1 micromol/mg/phút
2.3.1.5. Xác định hoạt tính enzyme α - amylase
Chúng tối tiến hành xác định hoạt độ enzyme α-amylase theo phƣơng pháp Heinkel [14].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Amylase xúc tác phản ứng thủy giải tinh bột thành đƣờng (đƣờng đơn, đƣờng đôi hay dextrin phân tử lớn). Lƣợng tinh bột còn lại phản ứng màu với iode. Từ đó xác định đƣợc lƣợng tinh bột bị thủy giải và tính đƣợc hoạt tính amylase theo định nghĩa:
Hoạt tính amylase đƣợc biểu thị là số mg tinh bột bị thủy giải bởi 1ml dịch enzyme (hay 1mg nguyên liệu chứa enzyme) trong 1 phút ở điều kiện chuẩn 500C, pH 6.
* Hóa chất:
- Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6
- Dung dịch tinh bột 1% pha trong đệm phosphate pH 6
- Dung dịch iode: 1g I2 và 2 g KI thêm nƣớc thành 100 ml, bảo quản lạnh. Khi dùng pha loãng 500 lần.
- Dung dịch HCl 1N: 8,4 ml HCl đậm đặc pha thành 100 ml. - Dung dịch HCl 0,1N: pha loãng từ dung dịch HCl 1N. - NaCl 0,1%.
* Tiến hành thí nghiệm:
Dựng đường chuẩn tinh bột:
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Tinh bột 10 mg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5
Dung dịch đệm (ml) 5 4 3 2 1 0
Nồng độ tinh bột (mg/ml) 0 2 4 6 8 10
Hút 0,1 ml dung dịch từ các ống nghiệm thêm 0,9 ml đệm, thêm vào 9 ml dung dịch I2/KI đã pha loãng 500 lần.
Đem so màu ở bƣớc sóng 560 nm.
Vẽ đồ thị biểu thị mối tƣơng quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị ΔOD.
Phản ứng enzyme:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Thử thật
(3 ống) Thử không (3 ống)
Tinh bột 1% (ml) 1 1
NaCl 0,1% (ml) 1 1
Đệm Phosphate pH 6 (ml) 2 2
Lắc đều, để ổn nhiệt ở 500C trong 5 phút
Dung dich enzyme mẫu (ml) 1 0
Để ổn nhiệt ở 500
C trong 10 phút
Dung dịch HCl 0,1N (ml) 5 5
Dung dịch enzyme (ml) 1 0
Hút 1 ml dung dịch từ các ống nghiệm trên. Thêm vào mỗi ống nghiệm 9 ml dung dịch I2/KI đã pha loãng 500 lần.
Lắc đều, đem đo OD ở bƣớc sóng 560 nm.
• Cách tính hoạt độ α-amylase:
Hoạt độ α-amylase trong 1 ml dịch enzyme = XxK
txv
Trong đó:
X: số mg tinh bột suy ra từ đƣờng chuẩn
v: thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme (ml) t: thời gian phản ứng (phút)
K: hệ số pha loãng
2.3.1.6. Xác định chiều dài rễ ở giai đoạn cây non
Xác định chiều dài rễ của 5 giống ngô ở giai đoạn cây non 5 ngày tuổi bằng thƣớc đo cm thông dụng.
Hạt ngô đƣợc gieo vào các chậu trồng chứa cát vàng đã rửa sạch, mỗi chậu trồng 40 cây. Tƣới nƣớc cho đến khi cây có 3 lá thật và đƣợc 5 ngày tuổi thì tiến hành nhổ rễ cây, rửa sạch cát cho cây nằm thẳng trên tờ giấy sạch rồi dùng thƣớc kẻ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cm đo từ đầu rễ đến chóp rễ. Mỗi mẫu đƣợc đo lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình xử lý bằng Excel.
2.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Gawel và đtg [26] nhƣ sau:
- Hóa chất: Nitơ lỏng, đệm rửa (Tris HCl 1 M; EDTA 0,5 M, pH = 8; Sorbitol 2 M; NaH2PO4 0,4%; H2O), đệm tách (Tris HCl 1 M; NaCl 5 M; EDTA; CTAB 4%; H2O), cồn 70%, Chloroform : Isoamyl (24:1), Isopropannol 100%.
- Quy trình tách DNA:
+ Thu 0,2 – 0,3g mẫu lá ngô, dùng cối, chày sứ nghiền mẫu cùng với Nitơ lỏng thành dạng bột min.
+ Bổ sung 0,8 ml đệm rửa, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi. Bƣớc này làm hai lần.
+ Thêm 700 µl đệm tách, trộn nhẹ. Ủ 65oC ít nhất 1giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Thêm 600 µl Chloroform : Isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút (dùng máy trộn càng tốt).
+ Ly tâm khoảng 13000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Hút 500 µl dịch trong ở pha trên sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
+ Thêm 500 µl Isopropannol, trộn nhẹ, đặt lên đá (để tủ lạnh qua đêm) chờ có tủa trắng.
+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. + Bổ sung 300 µl cồn 70% búng nhẹ.
+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần). + Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt.
+ Hòa tan DNA trong 50 µl nƣớc khử ion. + Điện di kiểm tra
+ Mẫu đƣợc giữ ở - 200C
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phƣơng pháp:
- Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm. Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:
Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng.
Độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 đƣợc coi là đảm bảo chất lƣợng.
- Phƣơng pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.3.2.3. Kỹ thuật PCR
Thực hiện phản ứng PCR nhân gen NAC với chu trình nhiệt: 94o
C - 4 phút, 94o C - 30 giây, 54o C - 30 giây, 72o C - 1 phút (30 chu kỳ); 72o C -7 phút, 4o C-.
Để khuếch đại đƣợc gen NAC từ 5 giống ngô địa phƣơng, chúng tôi dựa vào trình tự gen NAC có mã số EU810024 đƣợc công bố trên ngân hàng gen NCBI để phục vụ việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu. Gen NAC đƣợc khuếch đại có kích thƣớc khoảng 1040 bp. Cặp mồi đặc hiệu đƣợc chúng tôi đặt tổng hợp tại hãng Bioneer (Hàn Quốc).
Để có thể tiếp tục sử dụng cặp mồi, nhân gen NAC phục vụ việc chuyển gen sau này nên trong khi thiết kế mồi ngoài phần đặc hiệu của mồi chúng tôi đã bổ sung thêm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn (6 nucleotide) vào 2 đầu của mồi xuôi và mồi ngƣợc. Mồi xuôi đƣợc thiết kế bổ sung thêm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn BamHI, mồi ngƣợc đƣợc thiết kế bổ sung thêm trình tự nhận biết của enzyme giới hạn SacI.
Trình tự cặp mồi thể hiện trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Cặp mồi nhân gen NAC
Mồi Trình tự mồi Nhiệt độ
gắn mồi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MN GGAGCTCTCAGAACTGTCCCAACCCG 54o C
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen NAC
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Buffer PCR10X 2,5 2 MgCl2 (25mM) 2,5 3 dNTP (2,5 mM) 2,0 4 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2,0 5 Mồi ngƣợc (10 pM/µl) 2,0 6 Taq-polymerase (5U/1µl) 1,0 7 DNA tổng số 2,0 8 H2O 11,0 Tổng 25,0
Sau khi thu đƣợc sản phẩm nhân gen chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm nhân gen: điện di sản phẩm nhân gen trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethidium bromide. Sau đó soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.3.2.4. Làm sạch sản phẩm PCR (thôi gel)
Sau khi nhân đƣợc gen, bƣớc tiếp theo là cần thu nhận gen ở dạng sạch và không lẫn gel agarose để sử dụng cho công việc tạo dòng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thôi gel để làm sạch sản phẩm PCR theo bộ kít GeneJET Gel Extraction Kit của hãng Thermo.
Điện di sản phẩm PCR, nhuộm EtBr, soi trên đèn UV, cắt lấy phần gel có chứa đoạn gen có kích thƣớc yêu cầu, cho vào Epp 2ml.
- Bổ sung Binding Buffer vào Epp có chứa gel với tỉ lệ 1 : 1 (v/w). vd: bổ sung 100 µL của Binding Buffer cho mỗi 100mg gel
- Giữ Epp ở 55-600C trong 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn - Hút chuyển phần dịch lên cột tinh sạch
- Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC. Bỏ phần dịch - Thêm 700µl Wash Buffer vào cột tinh sạch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Ly tâm thêm 1 lần 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC để loại bỏ hoàn toàn Wash Buffer trên cột tinh sạch. Bỏ phần dịch
- Tùy lƣợng DNA sử dụng bổ sung 20-50µl H2O - Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút ở 4oC
- Điện di kiểm tra
- Sản phẩm đƣợc giữ ở -20oC
2.3.2.5. Tách dòng gen
Tạo plasmid tái tổ hợp
Sản phẩm PCR đã làm sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector pBT với thành phần phản ứng trong bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen NAC vào vector
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Buffer T4 ligase 1,0