3. Nội dung của đề tài
3.3.5.Kết quả xác định trình tự gen NAC
Để xác định trình tƣ̣ nucleotide của ge n NAC đã tách dòng, chúng tôi gửi đọc trình tự nucleotide của gen NAC trên thiết bị giải trình tƣ̣ tƣ̣ động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer tại viện Công nghệ Sinh học. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm BioEdit.
Kết quả xác định trình tự gen đƣợc so sánh trên phần mềm BLAST của Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen NAC mà chúng tôi phân lập có độ tƣơng đồng cao so với trình tự gen NAC trên NCBI. Nhƣ vậy, trình tự gen NAC của 2 mẫu ngô nghiên cứu đã đƣợc xác định chính xác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chúng tôi sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh trình tự gen NAC của 2 mẫu ngô nghiên cứu với 1 mẫu có mã số EU810024 trên ngân hàng gen NCBI, kết quả so sánh trình bày ở hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả so sánh gen NAC của 3 mẫu QB, VX và EU810024
Chiều dài gen NAC phân lập từ mẫu QB dài 1041 bp tính từ mã mở đầu đến mã kết thúc, với 2 exon và 1 intron. Exon 1 dài 471 bp, exon 2 dài 468 bp; intron dài 102 bp (từ vị trí 472 đến 573); kích thƣớc của gen NAC ở mẫu QB bằng với mẫu đã đăng kí trên Ngân hàng gen với mã số EU810024.
Chiều dài gen NAC phân lập từ mẫu VX là 1035 bp (ngắn hơn mẫu QB 6 nucleotide); Exon 1 dài 471 bp, exon 2 dài 468 bp; intron dài 96 bp (từ vị trí 472 đến 567).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả so sánh 3 mẫu QB, VX, EU810024 cho thấy, hệ số tƣơng đồng di truyền dao động trong khoảng 98,4-99,5%. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Hệ số tƣơng đồng di truyền gen NAC ở 3 mẫu QB, VX, EU810024
EU810024 QB VX EU810024 100 99,5 98,4
QB 100 98,5
VX 100
Tuy chiều dài gen NAC ở 2 mẫu nghiên cứu có khác nhau nhƣng exon1, exon2, đoạn mã hóa của cả 2 mẫu đều nhƣ nhau. Sự sai khác về kích thƣớc gen chỉ nằm ở vùng intron. Đoạn mã hóa amino acid của cả 2 mẫu nghiên cứu và mẫu trên Ngân hàng gen đều dài 939 bp. Đoạn mã hóa của 2 mẫu nghiên cứu sai khác 4 nucleotide ở các vị trí: 420 (T→C), 435(T→C), 504 (T→C), 541 (G→A) với hệ số tƣơng đồng là 99,5%. Kết quả thể hiện ở hình 3.8.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8. Kết quả so sánh đoạn mã hóa của gen NAC
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trình tự amino acid suy diễn của protein NAC ở 2 mẫu ngô QB, VX và EU810024 đều dài 312 amino acid (trừ mã kết thúc). Kết quả so sánh trình tự amino acid trong protein NAC ở 3 mẫu QB, VX và EU810024 đƣợc thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của protein NAC
ở 2 mẫu nghiên cứu QB, VX và EU810024
Kết quả cho thấy, trình tự amino acid của protein NAC của 2 mẫu so sánh khác nhau ở 1 vị trí là 181 với hệ số tƣơng đồng 99,6%. Trình tự amino acid của protein NAC ở mẫu QB và mẫu EU810024 tƣơng đồng 100%.
Từ kết quả thu nhận sau khi xác định trình tự gen, chúng tôi nhận thấy trình tự gen và trình tự amino acid của mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng cao với trình tự gen NAC có mã số EU810024 trên ngân hàng gen quốc tế NCBI.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.Kết luận
1.1. Khối lƣợng 100 hạt của 5 mẫu ngô địa phƣơng dao động trong khoảng (27,9g ± 0,18) đến (29,6g ± 0,30). Chiều dài rễ ở giai đoạn cây non dao động từ 18,33 - 31,70 cm.
1.2. Các mẫu ngô nghiên cứu có hàm lƣợng protein trong hạt dao động từ: (9,16% ± 0,006) đến (10,05% ± 0,045). Hàm lƣợng lipid dao động trong khoảng (3,18 ± 0,060%) đến (3,42% ± 0,091). Mẫu ngô VX có hoạt tính - amylase mạnh nhất (0,008 đvhđ/mg) và mẫu ngô QB có hoạt tính - amylase yếu nhất (0,004 đvhđ/mg). Mẫu ngô có hoạt tính protease cao nhất là mẫu VX (0,013 đvhđ/mg) và mẫu ngô có hoạt tính protease thấp nhất là mẫu QB (0,007 đvhđ/mg).
1.3. Khả năng chịu hạn của các mẫu ngô có sự khác nhau, mẫu ngô VX là mẫu chịu hạn tốt nhất, mẫu ngô QB là mẫu chịu hạn kém nhất.
1.4. Chiều dài gen NAC của mẫu ngô QB là 1041 bp, còn của mẫu ngô VX là 1035 bp. Hệ số tƣơng đồng di truyền về trình tự nucleotide của gen NAC ở 2 mẫu nghiên cứu với EU810024 trong khoảng 98,4 - 99,5%.
1.5. Trình tự amino acid của protein NAC của 2 mẫu nghiên cứu và EU810024 đều dài 312 amino acid và hệ số tƣơng đồng amino acid của 2 mẫu nghiên cứu là 99,6%. Trình tự amino acid của protein NAC ở mẫu QB và mẫu EU810024 tƣơng đồng 100%.
2. Đề nghị
Tiếp tục xác định thêm trình tự gen NAC của các giống ngô khác để có cơ sở so sánh, xác định chỉ thị phân tử và phục vụ cho việc chuyển gen để có thể tạo ra đƣợc những giống ngô có khả năng chịu hạn tốt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Ngô Việt Anh (2005), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, hoá sinh hạt, khả năng chịu hạn và tính đa dạng di truyền của một số giống ngô nếp địa phương, Luận văn thạc sĩ sinh học.
2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi của cây lúa, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
3. Bùi Mạnh Cƣờng, Trần Hồng Uy, Ngô Hữu Tình, Lê Quý Kha, Nguyễn Thị Thanh (2002), “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số dòng ngô đƣờng bằng phản ứng RAPD - markers”, Tạp chí Di truyền và ứng dụng, tr.16 - 22. 4. Bùi Mạnh Cƣờng (2003), “Sử dụng chỉ thị RAPD trong nghiên cứu đa dạng di
truyền tập đoàn giống và ứng dụng để chọn lọc tổ hợp ngô lai năng suất cao phục vụ sản xuất”, Công nghệ sinh học, tr.745-749.
5. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành hoá sinh học, NXB Giáo Dục.
6. Trần Thị Phƣơng Liên (1999), “Phân lập gen dehydrin liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà nội, tr. 1348 - 1349.
7. Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein và tính chống chịu ở thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội.
8. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2002), Giáo trình cây lương thực (dành cho sinh viên cao học), NXB Nông nghiệp.
9. Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình cây ngô, Nxb Nông nghiệp.
10. Chu Hoàng Mậu, Ngô Việt Anh (2005), “Đánh giá chất lƣợng hạt và khả năng phản ứng đối với hạn của một số giống ngô địa phƣơng miền núi”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn số 66, tr. 20 - 22.
11. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen và đặc tính chịu hạn của cây đậu tương, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12. Chu Văn Mẫn, Ứng dụng tin trong sinh học (2003), NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr: 53 - 163.
13. Trần Văn Minh (2004), Cây ngô nghiên cứu và sản xuất, Nhà xuất bản nông nghiệp.
14. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
15. Phạm Thị Thanh Nhàn (2007), Nghiên cứu đặc tính chịu hạn và môi trường nuôi cấy in vitro của một số giống ngô địa phương miền núi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.
16. Dƣơng Văn Sơn (1996), Nghiên cứu một số vật liệu ngô chịu hạn nhập nội sử dụng trong công tác chọn tạo giống, Luận án PTS khoa học nông nghiệp.
17. Ngô Hữu Tình (1997), Cây ngô, NXB Nông nghịêp Hà Nội.
18. Ngô Hữu Tình, Bùi Mạnh Cƣờng, Ngô Minh Tâm (2002), “Xác định khoảng cách di truyền - nhóm ƣu thế lai - cặp lai năng suất cao bằng chỉ thị RAPD”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 4, tr. 289 - 291.
19. Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn và phân lập gen Cystatin ở một số giống đậu xanh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái nguyên.
20. Phan Thị Vân, Ngô Hữu Tình, Luân Thị Đẹp (2005), “Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các dòng và các tổ hợp ngô lai luân giao ở giai đoạn cây con bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn 2/2005.
21. Võ Quốc Việt (1996), Nghiên cứu một số vật liệu ngô chịu hạn nhập nội trong điều kiện Bắc Thái, Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
22. Alexandrov,N.N., Brover,V.V., Freidin,S.,Troukhan,M.E.,Tatarinova,T.V., Zhang,H., Swaller,T.J., Lu,Y.P., Bouck,J. lavell,R.B.and Feldmann,K.A(2013), “Insights into corn genes derived from large-scale cDNA sequencing”, Plant Mol. Biol. 69 (1-2), pp. 179 - 194.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
23. Dekova I, Christor, Angelova M (1987), “Effect of Abscisis acid DNA water stress on stomata biliuos DNA some indices of water status in maize plant”,
Plant growth. pp. 655 - 668.
24. Delessert C, Kazan K, Wilson IW, Van Der Straeten D, Manners J, Dennis ES, Dolferus R, (2005), “The transcription factor ATAF2 represses the expression of pathogenesis-related genes in Arabidopsis”, Plant J, 43(5), pp. 745 - 757. 25. Dongxia Yao, Qiang Wei, Wenying Xu, Ryan D Syrenne, Joshua S Yuan, Zhen
Su, (2012), “Comparative genomic analysis of NAC transcriptional factors to dissect the regulatory mechanisms for cell wall biosynthesis”, BMC Bioinformatics.pp. 567 - 575.
26. Gawel N.J., Jarret R.L., 1991, Genmic DNA isolation, Http:// www.igd.carnell.edu/pretoria % 20 lad % 20 mannual.doc.
27. Gaiyun Zhang, Ming Chen, Liancheng Li, Zhaoshi Xu, Xueping Chen,
JiamingGuo and Youzhi Ma (2009), “Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco”, Journal of Experimental Botany, 60(13), pp. 3781 - 3796.
28. Larque- Saavedra a, Rodriquez M (1989), ”Evidences for material in heritance of abscisis acid in relation to drought tolerance in zea mays L”, Phyion- Bouenos- Aires, pp. 145 - 150.
29. Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005), “Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses”,
Theor Appl Genet, 110(8), pp. 1355 - 1362.
30. Lin R., Zhao W., Meng X., Wang M., Peng Y., (2007), “Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea”, Plant Sci, 172 (1), pp. 120 - 130. 31. Liao Y., Zou H.F., Wang H.W., Zhang W.K., Ma B., Zhang J.S., Chen S.Y.,
(2008), “Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants”, Cell Res, 18(10), pp. 1047 - 1060.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
32. Lu PL, Chen NZ, An R, Su Z, Qi BS, Ren F, Chen J, Wang XC, (2007), “ A novel drought-inducible gene, ATAF1, encodes a NAC family protein that negatively regulates the expression of stress-responsive genes in Arabidopsis”. Plant mol boil, 63(2), pp. 289 - 305.
33. Michael W Christiansen, Preben B Holm, Per L Gregersen, (2011), “Characterization of barley (Hordeum vulgare L.) NAC transcription factors suggests conserved functions compared to both monocots and dicots”, BMC Res Notes, pp. 302.
34. Nakashima K, Tran LS, Van Nguyen D, Fujita M, Maruyama K, Todaka D, Ito Y, Hayashi N, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, (2007), “ Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice”, Plant J, 51 (4), pp. 617 - 630.
35. Ooka H, Satoh K, Doi K, Nagata T, Otomo Y, Murakami K, Matsubara K, Osato N, Kawai J, Carninci P, Hayashizaki Y, Suzuki K, Kojima K, Takahara Y, Yamamoto K, Kikuchi S,(2003) “Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana”, DNA Res,10 (6), pp. 239 - 247. 36. Pekic S, Zaric L (1985), “The role of hormone in the reaction of plants to water
deficit DNA drought”, Agrohemja, pp. 49 - 65.
37. Pekic S, Quarrie S.A (1987), “Abscisis acid accumulation in lines of maize deffering in drough resistances: acomparison of intact DNA detached leaves ”, J. Plant physiol, (127),pp. 203 - 217.
38. Rawlings N.D, Barrett A.J., (1994), "Families of cysteine peptidases", Methods enzymol, 244, pp. 461 - 486.
39. Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang CZ, Keddie J, Adam L, Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha RR, Creelman R, Pilgrim M, Broun P, Zhang JZ, Ghandehari D, Sherman BK, Yu GL, (2000), “Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes”, Plant Science, pp. 2105 - 2110.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
40. Souer E, van Houwelingen A, Kloos D, Mol J, Koes R, (1996), “ The No Apical Meristem gene of Petunia is required for pattern formation in embryos and flowers and is expressed at meristem and primordia boundaries” , Plant J,
(2), pp. 159 - 170.
41. Soderlund,C., Descour,A., Kudrna,D., Bomhoff,M., Boyd,L.,Currie,J., Angelova,A., Collura,K., Wissotski,M.,Ashley,E.,Morrow,D.,Fernandes,J., Walbot,V. and Yu,Y(2013), “Sequencing, mapping, and analysis of 27,455 maize full-length cDNAs” PLoS Genet. 5 (11),pp. 1123 -1124
42. Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simopson S. D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi - Shinozaki K., (2007), “Co expression of the stress-inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis.”
Plant J, (1), pp. 46 - 63.
43. Trysellius Y., Huttmark D., (1997), "Cysteine proteinase 1, a chatepsin L-like enzyme expressed in the Drosophila melanogaster haemocyte cell line mbn-2",
Insect molecular Biol, 6(2), pp. 173 - 181.
44. Xiao Wang, James N Culer, (2012) , “DNA binding specificity of ATAF2, a NAC domain transcription factor targeted for degradation by Tobacco mosaic virus”, BMC Plant Biol, pp. 157.
45. Fang Y, You J, Xie K, Xie W, Xiong L, (2008) “Systematic sequence analysis and identification of tissue-specific or stress-responsive genes of NAC transcription factor family in rice”, Mol Genet Genomics, pp. 535 - 546.
46. Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M. M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2005), “AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis”, Plant Cel, 17(12), pp. 3470 - 3488.
47. Waldron C., Wegrich L.M., Merlo P.A.O, Walsh J.A.,(1993), "Characterization of a genemic sequence coding for potato multicystatin, An eight-domain cystein proteinase inhibitor", plant molecular biology 23(4), pp. 801 - 812.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
48. White,C.N. and Rivin,C.J.(2013), “Sequence and regulation of a late embryogenesis abundant group 3 protein of maize” Plant Physiol. 108 (3),pp. 1337 - 1338.
49. Zhang,Y. and Li,C,(2006), “Sequence analysis of genes related to drought stress tolerance and study on their applications in maize”, Unpublished, pp. 515 - 516.
MỘT SỐ TRANG WEB
50. http: //www.faostat.fao.org