Nghiên cứu trình tự gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài rễ của cây đậu tương

Hai cơ chế chính liên quan đến khả năng chiụ hạn của cây đậu tương, đó là sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu và sự phát triển bộ rễ.. Vì vậy hướng nghiên cứu về khả năng đâm xuyên, lan toả

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN GmEXP1 LIÊN QUAN

ĐẾN KHẢ NĂNG KÉO DÀI RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

Glycine max (L.) Merrill

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN GmEXP1 LIÊN QUAN

ĐẾN KHẢ NĂNG KÉO DÀI RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

Glycine max (L.) Merrill

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thanh Phương

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này

thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và NCS.Lò Thanh Sơn, giảng viên Trường Đại học Tây Bắc đã nhiệt tình giúp

đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện thí nghiệm của đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể thầy cô thuộc Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi trong học tập, nghiên cứu và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn

Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè cùng toàn thể gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Thái Nguyên, ngày 12 tháng 4 năm 2013

Tác giả

Nguyễn Thanh Phương

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) 3

1.1.1 Vị trí, nguồn gốc, phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây đậu tương 4

1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam 7

1.2 ẢNH HƯỞNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG 11

1.3 GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀ GEN GmEXP1 CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 14

1.3.1 Gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương 14

1.3.2 Gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của cây đậu tương 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 24

2.1.1 Vật liệu 24

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử 26

2.2.2 Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotid của gen 33

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 KẾT QUẢ NHÂN BẢN ĐOẠN MÃ HÓA CỦA GEN GmEXP1 TỪ HỆ GEN CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG SL3 VÀ DT84 34

3.2 TÁCH DÒNG VÀ SO SÁNH XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN MÃ HÓA

CỦA GEN GmEXP1 CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG SL3 và DT84 36

3.2.1 Kết quả tách dòng cDNA 36

3.2.2 Kết quả xác định trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1 39

3.3 SỰ ĐA DẠNG CỦA GEN EXP1 Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG KHÁC 47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Tài liệu tiếng Việt 51

Tài liệu tiếng Anh 52

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

mARN nhờ Enzym phiên mã ngược

RT-PCR Reverse trancriptase- Polymerase chain reaction(PCR

ngược)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2 Tình hình nhập khẩu đậu tương của Việt Nam giai đoạn

2009-2011

10

Bảng 3.1 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen

GmEXP1 ở 3 giống đậu tương

42

Bảng 3.2 Vị trí sai khác trong trình tự aminoacid của protein do gen

GmEXP1 mã hóa ở 3 giống đậu tương

44

Bảng 3.3 Hệ số tương đồng và hệ số sai khác của trình tự đoạn mã

hóa của gen EXP1 của 8 giống phân tích

47

Bảng 3.4 Hệ số tương đồng và hệ số sai khác của trình tự amino acid

mã hóa bởi gen EXP của 8 giống cây trồng

49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.4 Trình tự amino acid của vùng Pollen allerg của protein EXP1 23

Hình 3.3 Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh 36

Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotid đoạn mã hóa của gen GmEXP1 giữa

giống đậu tương SL3 và DT84 với đoạn mã hoá của gen

GmEXP1 giống có mã số AF516879 trong Ngân hàng gen quốc

tế

41

Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid mã hoá bởi gen GmEXP1 của

giống đậu tương SL3, DT84 với giống AF516879 công bố trong Ngân hàng gen

Hình 3.11 So sánh trình tự amino acid của vùng Pollen allerg trong

trình tự amino acid của protein EXP 5 giống đậu tương

46

Hình 3.12 Sơ đồ hình cây biểu hiện mối quan hệ di truyền của 8 giống

cây trồng được thiết lập trên cơ sở dữ liệu trình tự đoạn mã hóa gen EXP1

48

Hình 3.13 Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tương đồng protein EXP của

8 giống cây trồng phân tích

49

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây loại trồng ngắn ngày có vị

trí quan trọng trong cơ cấu cây nông nghiệp ở nước ta Đậu tương được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế Trong hạt đậu tương rất giàu hàm lượng protein (từ 32% - 52% ) và chứa nhiều amino acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin ), 12% -25% lipit và các vitamin (B1, B2,

C, D, E, K ) Hạt đậu tương cung cấp nguồn dinh dưỡng phong phú, cần thiết cho người và động vật Một đặc tính quan trọng nữa của đậu tương đó là khả năng cải tạo đất do hệ rễ của chúng có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm Chính vì vậy trồng đậu tương ngoài việc đem lại hiệu quả kinh tế còn góp phần vào công cuộc cải tạo đất trồng trọt

Sản lượng đậu tương trên thế giới đạt hàng trăm triệu tấn /năm Trong khi đó ở Việt Nam chỉ đạt vài trăm nghìn tấn /năm Để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và chế biến ngành công nghiệp chế biến của nước ta vẫn phải nhập khẩu đậu tương từ các nước trên thể giới đặc biệt là Mỹ Thực trạng này cũng chứng

tỏ một điều là diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng đậu tương của nước

ta còn thấp so với các nước trong khu vực và trên thế giới Một trong những nguyên nhân làm sụt giảm năng suất cây trồng nói chung và đậu tương nói riêng chính là hạn hán Việt Nam nằm trong khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề của biến đổi khí hậu, hơn nữa nhiều tỉnh miền núi của nước ta có địa hình dốc cho nên tình trạng hạn hán cục bộ xảy ra rất phổ biến Đậu tương là cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém, vì thế hạn hán xảy ra sẽ làm giảm năng suất của đậu tương Chính vì vậy công tác tuyển chọn giống đậu tương có kiểu gen chịu hạn ngày càng được quan tâm nghiên cứu

Hai cơ chế chính liên quan đến khả năng chiụ hạn của cây đậu tương, đó

là sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu và sự phát triển bộ rễ Khả năng thu nhận

nước của cây phụ thuộc chủ yếu vào bộ rễ Vì vậy hướng nghiên cứu về khả năng đâm xuyên, lan toả của hệ rễ và tìm hiểu về cơ sở di truyền phân tử của sự phát triển hệ rễ liên quan đến khả năng chịu hạn của cây đậu tương là vấn đề đang được quan tâm và mang tính thời sự Xuất phát từ lí do trên chúng tôi lựa

chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu trình tự gen GmEXP1 liên quan đến

sự kéo dài rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được điểm sai khác về trình tự nucleotide của gen GmEXP1 và trình tự amino acid của protein do gen GmEXP1 mã hóa phân lập từ một số

giống đậu tương có khả năng chịu hạn khác nhau

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Khuếch đại đoạn mã hóa của gen GmEXP1 liên quan đến khả năng kéo dài

rễ của một số giống đậu tương bằng kỹ thuật RT-PCR;

3.2 Tách dòng và xác định trình tự đoạn mã hóa của gen GmEXP1 liên quan

đến khả năng kéo dài của rễ ở cây đậu tương;

3.3 So sánh trình tự đoạn mã hóa của gen GmEXP1, trình tự amino acid trong protein do gen GmEXP1 mã hóa của một số giống đậu tương nghiên cứu với

trình tự gen đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế;

3.4 Phân tích tính đa dạng về trình tự nucleotide đoạn mã hóa của gen EXP1

và trình tự amino acid của protein EXP1 ở cây đậu tương và một số loài thực vật khác

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

1.1.1 Vị trí, nguồn gốc, phân loại

Đậu tương (Glycine max L Merill) là loại cây trồng cạn ngắn ngày đã và

đang trở thành một trong những cây trồng quan trọng của nhiều quốc gia trên thế giới và ở Việt Nam Khó có thể tìm thấy loại cây trồng nào lại có tác dụng nhiều mặt và hiệu quả kinh tế cao như cây đậu tương Sản phẩm của nó làm thức ăn cho người và vật nuôi, nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, dược liệu, công nghiệp ép dầu, công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi Từ hạt đậu tương người ta có thể chế biến thành hơn 600 sản phẩm

có giá trị dinh dưỡng khác nhau Trong các protein thực vật thì protein của đậu tương là có phẩm chất tốt nhất bởi có đầy đủ và cân đối các loại axit amin cần thiết, dễ tiêu hóa lại không có các thành phần tạo thành cholesterol Lipit của đậu tương chứa tỷ lệ lớn các axit béo chưa no, có hệ số đồng hóa lớn (98%), chỉ

số iot tương đối cao (120-137) Với tính vượt trội về phẩm chất của protein và lipit có trong hạt đậu tương cho nên qua thực tiễn đã chứng minh đối với đời sống con người sử dụng đậu tương thường xuyên, một cách hợp lý sẽ rất tốt cho sức khỏe, có tác dụng phòng chống bướu cổ, bệnh đái tháo đường, béo phì, cao huyết áp, [9]

Trong các cây họ Ðậu (Fabaceae) thì đậu tương cũng có vị trí quan trọng bậc nhất, chúng còn được gọi là “Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu” [2] Ngoài ra, cùng với các loài cây họ đậu khác trồng đậu tương còn nhằm mục đích cải tạo đất

Về nguồn gốc, đậu tương là một trong những loài cây trồng được biết đến từ lâu đời Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc, chúng được thuần hóa và trồng làm cây

thực phẩm ở Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trước Công nguyên Từ Trung Quốc đậu tương được đưa sang Triều Tiên, Nhật Bản, Nga, Nam Á và Đông Nam Á qua con đường tơ lụa

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh trung

du, miền núi phía Bắc và miền Đông Nam Bộ Hiện nay, các giống đậu tương đang được gieo trồng trong nước có hai nguồn gốc, đó là tập đoàn các giống địa phương và các giống nhập nội [2], [ 7 ], [9]

Về phân loại thực vật học: Cây đậu tương có tên khoa học Glycine max (L.) Merill (2n= 40) thuộc họ đậu (Lengunoceace), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae) Các dạng đậu tương trồng có nhiều tên thực vật khác nhau, nhưng tên đúng của đậu tương phải là Glycine max (L.) Merill ( Hymowitz và Newell, 1981) Các giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc loài Glycine max

(L.) Merill (2n=40) trong giống phụ G.Soya, giống Glycine thuộc họ đậu

(Lengunoceace), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae) Đối với đậu tương trồng

có thể phân loại theo đặc điểm thực vật học, dựa theo thời gian sinh trưởng, theo thời vụ [9,]

1.1.2 Đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây đậu tương

1.1.2.1 Đặc điểm sinh học của cây đậu tương

Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây hàng năm Cây gồm các bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt

Rễ của cây đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên Rễ tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20– 40 cm Trên rễ có nhiều nốt

sần Trên mỗi nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định

đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu, mỗi nốt sần này được ví như nhà máy sản xuất đạm Khi mới hình thành thì nốt sần có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nó có màu hồng, số lượng và chất lượng nốt sần có ảnh hưởng đến sinh trưởng và năng suất của đậu tương

Đậu tương là cây thảo, ít phân cành, dạng bụi Thân có hình tròn, nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò, thân thường có từ 14 – 15 lóng, chiều cao trung bình từ 0,5 – 1,2m thay đổi tuỳ theo giống Cây khi còn non thân có màu xanh hoặc tím, khi già chuyển màu nâu nhạt Màu sắc thân cho ta biết màu của hoa sau này, nếu thân có màu xanh thì hoa sẽ có màu trắng, nếu thân có màu tím thì hoa sau này có màu tím đỏ Cành đậu tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang một lá kép

Lá đậu tương có nhiều hình dạng khác nhau: Tròn, hẹp, bầu dục, lưỡi mác hoặc hình thoi…nhưng thường quy thành hai loại là lá rộng và lá hẹp Hình dạng lá thay đổi tùy theo giống, các giống đậu tương có dạng lá dài và nhỏ thường có khả năng chịu hạn tốt nhưng cho năng suất thấp còn các giống lá

to thường có năng suất cao hơn nhưng khả năng chịu hạn lại kém hơn

Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm, mỗi chùm thường có 3-5 hoa, có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ Do hoa đậu tương thuộc loại hoa lưỡng tính nên nó là cây tự thụ phấn,

tỷ lệ giao phấn thấp chỉ chiếm 0,5-1%

Quả của cây đậu tương là loại quả ráp, bên ngoài vỏ quả thường có lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín nó có màu vàng hoặc xám đen Quả thẳng hoặc hơi cong Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng phổ biến là 2 hạt Hạt đậu tương có nhiều hình dạng; bầu dục, tròn dài, tròn dẹt Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen…nhưng đa số là hạt màu vàng Những giống có hạt màu vàng có giá trị thương phẩm cao Khối lượng hạt dao động từ 200 –

400 mg/hạt và khối lượng 1000 hạt dao động trung bình 100-200g Hình dạng

và màu sắc rốn hạt là dấu hiệu đặc trưng cho mỗi giống đậu tương

Cây đậu tương có 2 đặc tính sinh trưởng: sinh trưởng hữu hạn và sinh trưởng vô hạn; căn cứ vào thời gian sinh trưởng có 3 loại: chín sớm (75- 85 ngày), trung bình (80- 100 ngày), chín muộn (110- 120 ngày) Đậu tương là cây trồng tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh Trong tập đoàn giống đậu tương, có những giống chỉ trồng vào vụ hè, ngược lại có những giống chỉ trồng vào vụ đông [1], [2], [9]

1.1.2.2 Giá trị kinh tế của cây đậu tương

Đậu tương thuộc loại cây trồng có giá trị thương phẩm và kinh tế rất cao Sản phẩm của nó có tác dụng toàn diện như làm thức ăn cho người, gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp chế biến, là hàng xuất khẩu và trồng đậu tương có tác dụng cải tạo đất rất tốt

Về mặt thực phẩm, so với nhiều nguồn cung cấp protein thì hạt đậu tương có hàm lượng protein cao nhất, chiếm khoảng từ 30%- 46%, trong khi đó hàm lượng protein trong gạo chỉ chứa 6,2- 12%, ngô 9,8- 13,2%, thịt bò 21%, thịt gà 20%, cá 17- 20% và , chứa hầu hết các loại axit amin không thay thế cần thiết cho cơ thể (triptophan, lizin, metionin, valine…), ở dạng dễ tan, dễ tiêu hóa và không có các thành phần tạo cholesteron Lipit chiếm khoảng 18-25% và khoảng 20% gluxit, ngoài ra trong hạt đậu tương chứa nhiều các các enzyme; các chất ức chế protease và lectin; muối khoáng; các vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) Do có thành phần dinh dưỡng cao (lipit, protein) nên hạt đậu tương có khả năng cung cấp năng lượng khá cao, khoảng 4700 cal/kg Hiện nay, từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại làm thực phẩm như: đậu phụ, tương, xì dầu, sữa, bánh kẹo, lương khô…[1], [7], [9]

Về mặt công nghiệp, đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công

nghiệp khác nhau như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, dầu bôi trơn trong ngành hàng không nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép dầu Hiện nay, trên thế giới có 8 loại cây lấy dầu quan trọng đó là: đậu tương, bông, lạc, hướng dương, cải dầu, dừa và cọ Trong đó, đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu Từ dầu đậu

tương người ta chế biến ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như làm nến,

xà phòng, ni lông Về xuất khẩu, đậu tương là mặt hàng nông sản có giá trị ổn định trên thị trường thế giới

Về mặt nông nghiệp, đậu tương là loại cây trồng mà tất cả các bộ phận

đều có giá trị với chăn nuôi Từ thân lá quả đều là nguồn thức ăn cho gia súc 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Đậu tương còn là cây luân canh cải tạo đất tốt Một ha diện tích trồng đậu tương nếu sinh trưởng và phát triển tốt sẽ để lại trong đất từ 30 – 60kg nitơ Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng làm đất tơi xốp, màu mỡ, từ đó góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón đạm Thân và lá đậu tương là nguồn phân xanh hữu

cơ rất tốt bởi hàm lượng nitơ trong thân chiếm 0,05%, trong lá chiếm 0,19%

Với những giá trị kinh tế đem lại từ việc trồng đậu tương thì cần có một

cơ cấu cây trồng hợp lí, để thúc đẩy được hoạt động sản xuất đậu tương đáp ứng nhu cầu về thực phẩm cho nhân loại là vấn đề đáng quan tâm không chỉ mỗi quốc gia, khu vực mà trên toàn thế giới [2], [9]

1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam

Với những giá trị kinh tế và và giá trị sử dụng cây đậu tương được xem

là một loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tư chỉ sau lúa, ngô và lúa mỳ Khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu và sinh thái của đậu tương là khá rộng nên chúng được trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, đặc biệt nhiều nhất là ở châu Mỹ, tiếp đến là châu Á

Thống kê của FAO (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc) cho thấy từ năm 1980 trở lại đây sản lượng đậu tương trên thế giới tăng gấp 2 lần chủ yếu nhờ vào tăng năng suất và diện tích gieo trồng

Hiện nay, đậu tương được trồng ở gần 80 quốc gia khác nhau trên thế giới Trong đó, những nước có sản lượng đậu tương đứng đầu là Mỹ, Brazil, Argentina

và Trung Quốc, chiếm khoảng 90- 95% tổng sản lượng đậu tương trên thế giới

Cũng theo FAO, trong vòng 4 năm (2006-2009) thì diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng 3,6 triệu ha, trong đó Mỹ vẫn là quốc gia đứng đầu về diện tích gieo trồng 30,91 triệu ha trong khi đó Việt Nam chỉ chiếm một con số khiêm tốn là 0,15 triệu ha Cùng thời điểm thống kê nhận thấy, mặc dù diện tích gieo trồng tăng đáng kể nhưng sản lượng đậu tương của toàn thế giới lại có nhiều biến động cụ thể, năm 2006 tổng sản lượng trên thế giới đạt 222,19 triệu tấn, năm 2007 giảm xuống chỉ còn 219,5 triệu tấn, năm 2008 sản lượng tăng đáng kể đạt 230,5 triệu tấn, nhưng đến năm 2009 thì chỉ còn là 222,2 triệu tấn

Sở dĩ sản lượng đậu tương thế giới có sự giao động và sụt giảm là do có nhiều nguyên nhân nhưng một trong những nguyên nhân đáng kể đến ở đây đó là do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu [4], [9]

Nhu cầu nguồn đậu tương của thế giới là rất cao vì đó là nguồn cung cấp protein và dầu rất quan trọng cho nên lỗ lực thúc đấy năng suất và sản lượng đậu tương đang là vấn đề được chú trọng ở nhiều quốc gia

Ở Việt Nam, đậu tương được trồng từ rất lâu, trước cây đậu xanh và các cây họ đậu khác và nhu cầu tiêu thụ đậu tương trong nước là rất lớn nên sản xuất đậu tương trong nước cũng đang được chú trọng, diện tích gieo trồng tăng lên đáng kể Thống kê những năm gần đây cho thấy đậu tương được trồng ở cả

7 vùng nông nghiệp và là thế mạnh của một số vùng kinh tế, đơn cử vào năm

1997 thì diện tích gieo trồng đậu tương lớn nhất là miền núi phía bắc (46,6%), tiếp đến là đồng bằng sông Hồng (19,3%), vùng Tây Nguyên (11%), miền Đông Nam Bộ (10,2%), đồng bằng sông Cửu Long (8,9%), khu Bốn (2,3%), vùng Duyên hải miền Trung (1,6%)

Theo số liệu thống kê chính thức của chính phủ, đậu tương được trồng ở

28 tỉnh trên khắp cả nước, trong đó 70% ở miền bắc và 30% ở miền nam Khoảng 65% đậu tương nước ta được trồng ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ; và 35% được trồng ở những vùng đất thấp ở khu vực đồng bằng sông Hồng Đậu tương được trồng ở nhiều địa phương trên khắp cả nước vào từng thời điểm khác nhau nên có cả vụ xuân, vụ hè và vụ đông

Như vậy, có thể nói cây đậu tương chiếm một vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp của nước ta, đặc biệt là ở những vùng nông thôn nghèo kinh tế chưa phát triển [9]

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam giai đoạn 2005- 2011

(Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, * số liệu ước tính của FSA)

Theo thống kê của Tổng cục thống kê Việt Nam thì tổng sản lượng đậu tương nước ta năm 2010 đạt sấp xỉ 297 nghìn tấn, tăng 39% so với năm 2009 Đạt được kết quả trên là do sự mở rộng đáng kể về diện tích gieo trồng đậu tương (khoảng 35%) và những nỗ lực nhằm cải thiện năng suất của ngành Tuy nhiên, sản lượng trên vẫn còn thấp so với mục tiêu đề ra cho năm 2010 là 325nghìn tấn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Nguyên nhân không đạt chỉ tiêu đề ra có thể là do chi phí sản xuất tăng người dân chưa mặn mà với việc trồng đậu tương, năng suất các giống đậu tương của nước ta chưa cao và nhiều nguyên nhân khác Nếu xét về diện tích gieo trồng vẫn tăng qua các năm nhưng tỉ lệ diện tích gieo trồng đậu tương thì vẫn còn khá thấp chỉ chiếm khoảng 1, 5- 1,6% [9] Mặt khác, do chưa được đầu tư đúng mức nên năng suất đậu tương trong nước còn nhiều hạn chế, chỉ bằng 50- 70% năng suất đậu tương của toàn thế giới Sản lượng đậu tương sản xuất ra không đủ đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước, nên hàng năm nước ta vẫn phải nhập khẩu một số lượng đáng kể từ nước ngoài

Năm 2011, Việt Nam nhập khẩu hơn 1 triệu tấn đậu tương, tăng 350% so với năm 2010 do áp lực tiêu thụ mạnh về thực phẩm và thức ăn chăn nuôi trong nước Kim ngạch nhập khẩu đậu tương năm 2011 đạt mức kỷ lục là 550 triệu USD, tăng 416% so với cùng kỳ năm trước, trong đó khoảng 49% nhập khẩu từ Brazil, 22% nhập khẩu từ Hoa Kỳ, 16% từ Argentina, số còn lại là nhập từ một một số quốc gia khác (Bảng 1.2)

Hiện nay nhu cầu về nguyên liệu cho công nghiệp ép dầu và chế biến thức ăn chăn nuôi của nước ta là rất mạnh, nên nhu cầu cung cấp về nguồn hạt đậu tương của nước ta là rất lớn Nguồn đậu tương trong nước không thể đáp ứng đủ vì vậy công nghiệp chế biến từ nguyên liệu đậu tương phụ thuộc rất nhiều vào nhập khẩu từ nước ngoài, làm ảnh hưởng giá thành sản phẩm trong nước, gây thất thoát kinh tế

Bảng 1.2 Tình hình nhập khẩu đậu tương của Việt Nam giai đoạn 2009-2011

Lượng (nghìn tấn)

Giá trị

(triệu USD)

1.2 ẢNH HƯỞNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƯƠNG

Trong những năm gần đây, nhiều khu vực trên thế giới đang phải chịu ảnh hưởng rất nặng nề do biến đổi khí hậu đặc biệt là hiện tượng nhiệt độ trái đất ngày càng nóng nên, sản xuất nông nghiệp là một trong những lĩnh vực chịu ảnh hưởng rõ nét nhất của biến đổi khí hậu Việt Nam nằm trong khu vực Đông Nam Á được đánh giá là một trong những nước chịu thiệt hại nặng nề do biến đổi khí hậu toàn cầu gây ra như bão, lũ lụt, hạn hán, xâm nhập mặn, triều cường và nhiều yếu tố bất thường khác của môi trường, làm ảnh hưởng lớn đến hoạt động sản xuất nông nghiệp trong đó có sản xuất đậu tương

Hệ quả của biến đổi khí hậu là sự thay đổi bất thường của các yếu tố sinh thái nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa gây biến động mạnh đến môi trường đất, nước, không khí, và có thể gây ra những đợt khô, nóng, hạn, lạnh hoặc mưa kéo dài cục bộ ở từng vùng hoặc trên diện rộng

Hạn là một trong những yếu tố cực đoan phi sinh học được quan tâm nhiều nhất trên thế giới, là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong thiên nhiên liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong thực vật [6] Khô hạn là yếu tố cơ bản làm hạn chế sự tăng trưởng và năng suất cây trồng Hạn hán là tình trạng xảy ra tương đối thường xuyên ở nhiều vùng miền của nước ta nhất là vài năm trở lại đây, làm sụt giảm đáng kể năng suất và sản lượng đậu tương của cả nước Do vậy hướng nghiên cứu tăng cường khả năng chịu hạn là mục tiêu đáng được quan tâm, chú trọng đối với lĩnh vực tạo giống đậu tương

Khi gặp hạn thì cây trồng cạn sẽ có khả năng chống chịu hạn ở các mức

độ đề kháng khác nhau, tùy vào từng giống, loài Khả năng thực vật có thể giảm thiểu mức tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn Ở thực vật có 4 biểu hiện về khả năng chịu hạn: (1) Giảm diện tích lá và rút ngắn thời gian sinh trưởng để sử dụng nước một cách hợp lý trong điều kiện thiếu nước; (2) Tăng khả năng đâm sâu của bộ rễ để tận dụng nguồn nước ở tầng sâu

đảm bảo tương ứng cho nhu cầu thoát hơi nước của lá; (3) Duy trì sức trương của tế bào thông qua khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu để bảo vệ các chồi non khỏi bị khô hạn trong điều kiện mất nước cực đoan; (4) Kiểm soát mức độ thoát hơi nước trên bề mặt lá thông qua điều tiết độ mở của khí khổng

Trong trường hợp gặp điều kiện bất lợi về nước cây trồng cạn sẽ sử dụng các cơ chế khác nhau để có thể thích ứng, sinh trưởng Các cơ chế này khá đa dạng nhưng có thể chia thành ba cơ chế chủ đạo bao gồm: Cơ chế trốn thoát điều kiện hạn (drought escape), cơ chế tránh hạn (drought avoidance) và cơ chế chống chịu hạn (drought tolerance)

Về cơ chế chống chịu hạn đối với các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn đó là cây có thể duy trì sức căng của các mô và tế bào, nhờ vậy

mà trong điều kiện lượng nước môi trường xuống thấp các quá trình trao đổi chất trong cây vẫn có thể diễn ra bình thường, sức căng của các mô, tế bào được được duy trì thông qua việc tổng hợp mạnh các chất chống áp suất thẩm thấu, các chất trao đổi Như vậy, trong điều kiện thiếu nước cực đoan

có hai cơ chế chủ yếu của những giống đậu tương chống chịu hạn, đó là sự thích nghi và phát triển bộ rễ của chúng, đồng thời duy trì áp suất thẩm thấu để hút được nhiều các phân tử nước từ môi trường [3], [9]

Tác động cực đoan của hạn đến bất cứ giai đoạn sinh trưởng nào cũng ảnh hưởng xấu đến các yếu tố cấu thành năng suất, làm giảm năng suất cây trồng Hướng nghiên cứu về khả năng đâm xuyên, lan tỏa của bộ rễ ở mức độ phân tử của các giống đậu tương đang là một trong những định hướng của việc tuyển chọn giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn [10]

Đối với thực vật ở cạn thì rễ là bộ phận quan trọng làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng, cung cấp chất dinh dưỡng cho mọi hoạt động sống, với đậu tương sự thích nghi với các điều kiện hạn chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ để có thể tìm kiếm nguồn nước từ các tầng đất sâu Bên cạnh đó thì hệ

thống rễ bên phát triển tỏa ra theo chiều ngang, vươn tới chỗ đất có độ ẩm cao

và tìm kiếm các chất dinh dưỡng

Khi đánh giá 105 giống đậu tương trong điều kiện khô hạn Kasper và đtg (1984) nhận thấy, cây đậu tương không được tưới nước thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn cây đậu tương được tưới nước, ngoài ra các nhà nghiên cứu cũng nhận thấy mối tương quan chặt chẽ đối với nhiều tính trạng của rễ như trọng lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ con ở các giống chịu hạn [24] Trong một nghiên cứu khác cho thấy cây đậu tương khi được xử lý hạn ở giai đoạn trước khi ra hoa sẽ cho năng suất cao hơn những cây đậu tương được xử

lý hạn ở giai đoạn sau khi hoa nở, điều này được giải thích là do chúng đã phát triển hệ rễ đầy đủ để thích ứng với điều kiện hạn trước khi nở hoa và sự phát triển bộ rễ lớn ở thời kỳ đầu của quá trình sinh trưởng sinh dưỡng sẽ giúp đậu

tương thích ứng tốt với các điều kiện hạn [9]

đậu tương bị ảnh hưởng nghiêm trọng, điều này gây ảnh hưởng đến sinh tổng hợp protein, vốn là thành phần quan trọng của hạt đậu tương Các nghiên cứu

cơ chế hóa sinh của mối liên hệ các nốt sần của rễ đậu tương với điều kiện hạn

đã được làm sáng tỏ [9]

Khả năng hấp thụ nước phụ thuộc chủ yếu vào bộ rễ, để tránh mất nước những cây chịu hạn thường có bộ rễ khoẻ, dài, mập có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu trong đất hoặc rễ lan rộng với số lượng lớn Đối với đậu tương các nốt sần của hệ rễ cũng liên quan đến khả năng kháng hạn của loài thực vật này Giai đoạn cây non thường chịu tác động mạnh của hạn vì bộ

rễ phát triển chưa đầy đủ, còn non yếu

1.3 GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀ GEN GmEXP1 CỦA

CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.3.1 Gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương

Trong nhiều năm trở lại đây, thì hạn hán và xâm nhập mặn đã tác động xấu đến năng suất cây trồng trên toàn thế giới trong đó có đậu tương Một số lượng lớn các gen liên quan đến khả năng chịu hạn và chịu mặn đã được xác định, nhưng vẫn còn đáng kể các gen liên quan đến tính chống chịu của thực vật chưa được xác định (Bray,1997) [11]

Khi nghiên cứu đặc tính chịu hạn về mặt sinh lý, hóa sinh và cấu trúc tế bào người ta nhận thấy hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở những mức độ khác nhau, trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây đậu tương Điều này chứng tỏ tính chịu hạn của thực vật do nhiều gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau Cho đến nay người ta vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ xác định được các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương [8] Như vậy, đặc tính chịu hạn của cây đậu tương có liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất và tính chịu hạn của cây mang tính đa gen được thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, cũng như bản chất di truyền của từng giống trong quá trình sinh trưởng và phát triển có khả năng sử dụng nước tiết kiệm

Nghiên cứu đặc tính chiụ hạn của thực vật có những bước tiếp cận khác nhau trên nhiều loài cây trồng trong các giai đoạn sinh trưởng và phát triển khác nhau, ngày càng đi sâu vào bản chất phân tử của đặc tính này Tại Việt Nam, nhiều gen liên quan đến tính chịu hạn đã được phân lập từ cây đậu tương, dehydrin, chaperonin, gen P5CS, Cystatin, DREB1, DREB5 đã được công bố trong 10 năm gần đây (2001-2010) bởi nhóm nghiên cứu của khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên

Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương được chia làm 2 nhóm: (i) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới đặc tính chịu hạn; (ii) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng kích hoạt quá trình phiên

mã của nhóm gen chịu hạn [9]

Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hưởng trực tiếp tới tính chịu hạn của cây đậu tương

Các gen chức năng mà sản phẩm liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây đậu tương bao gồm: HSP, chaperonin, LEA, P5CS, EXP, LTP…

Sự xuất hiện của protein sốc nhiệt (HSP) có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy do stress nóng và mở rộng giá trị ngưỡng nhiệt độ với sự chống chịu nhiệt độ cao Trong tế bào thực vật HSP tế bào chất tập trung thành các hạt sốc nhiệt (HSG- Heat Shock Granules) Người ta cho rằng HSG gắn kết trên các RNA polymerase để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mRNA trong quá trình stress nóng HSP chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá và có ở hầu hết các loài thực vật, xuất hiện trong các quá trình sinh trưởng bình thường, các giai đoạn biệt hóa mô và cả trong thời kỳ sinh trưởng của thực vật Dựa trên khối lượng phân tử, HSP có thể chia thành 6 nhóm: HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, HSP20, HSP8,5 (theo Trần phương Liên,1999) Trong 6 nhóm HSP có rất nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (MGPT) như HSP70, HSP60 nhưng cũng có HSP không phải là MGPT như HSP8,5 (Ubiquitin) [5], [9] MGPT là một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau có chức năng tham gia cấu trúc không gian đúng cho protein trong tế bào (Hartl F.U, năm 1996) [22] Phần lớn các MGPT có hoạt tính ATP- ase Chức năng chính của MGPT là: (1) Giữ ổn định chuỗi polypeptid khi đang tổng hợp và tạo cấu trúc không gian đúng cho chúng; (2) Tạo lại cấu trúc không gian của protein sau khi vận chuyển qua màng tế bào; (3) Lắp ráp các chuỗi polypeptid vào phức để tạo cấu trúc bậc 4; (4) MGPT được tăng cường nhờ quá trình tổng hợp trong điều kiện cực đoan

do nhu cầu cấp thiết của tế bào, nhất là sốc nhiệt P5CS là một trong những enzyme chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp protein có chứa proline, Proline là một axit amin ưa nước, có khả năng giữ và lấy nước cho tế bào, tham gia tích cực trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thẩu của tế bào thực vật P5CS biểu hiện mạnh mẽ làm tăng hàm lượng proline, qua đó tăng cường áp suất thẩm thấu của tế bào và cây trong điều kiện khô hạn Gen mã hóa cho enzyme P5CS đã được nghiên cứu và tách dòng ở nhiều loại cây khác nhau Nhiều cây trồng đã được chuyển gen P5CS nhằm tăng cường khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi do hạn gây ra [9], [31] LEA là protein được tổng hợp nhiều trong giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi, đặc điểm nổi bật của nhóm protein LEA là giàu acid amin ưa nước, không chứa cystein và tryptophan, có vùng xoắn α và có khả năng chịu nhiệt Chúng thay thế vị trí nước trong tế bào

và thực hiện các chức năng khác nhau như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính và điều chỉnh áp suất thẩm thấu, biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của chúng cho thấy chúng có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu sự mất nước Nhóm gen mã hóa loại protein LEA đóng vai trò quan trọng trong sự chịu khô hạn của hạt và liên quan đến khả năng chống hạn của cây Khi hiện tượng mất nước xảy ra nhóm gen LEA sẽ phiên mã tổng hợp một số lượng lớn mRNA trong hạt chín và bị phân giải hết trong quá trình nảy mầm Mức độ phiên mã của nhóm gen LEA được điều khiển bởi acid abcisic (ABA) và độ mất nước của tế bào, điều chỉnh áp

suất thẩm thấu trong tế bào [9] Expansin là một họ protein có chức năng tham

gia hoạt động mở rộng thành tế bào và liên quan đến kéo dài tế bào ở rễ của thực vật Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, expansin chủ yếu được xem xét như

là một tác nhân chính trong sự kéo dài thành tế bào, tăng kích thước tế bào, trong khi các enzym khác cũng có thể sửa đổi cấu trúc vách tế bào, hỗ trợ sự

expansin trong sự kéo dài tế bào đa số mới chỉ được nghiên cứu trong ống

nghiệm mà ít thấy công trình nghiên cứu ở cơ thể tự nhiên (Link ,1998); (Fleming, 1997) [18], [30] Mặc dù cơ sở phân tử của sự hoạt động thay đổi vách tế bào của expansin vẫn còn chưa được sáng tỏ, nhưng hầu hết các bằng chứng đều cho thấy expansin là nguyên nhân gây ra sự dãn dài tế bào bằng cách nới lỏng các liên kết hydro giữa các microfibrils cellulose và mạng lưới polymer [16] Kể từ lần đầu tiên nhân bản thành công gen expansin được công bố cho đến nay các gen expansin đã được các tác giả phân lập từ một loạt

(Li , 2002) [29], trong 3 phân họ thì α-expansins chiếm phần lớn của expansin Phân họ expansin được tìm thấy ở nhiều cây trồng như cây cà chua, ở lúa gạo

(Cho,1998)[13], [24] và cây Arabidopsis [12] và nhiều loài thực vật khác Theo

chia thành các nhóm A, B, C, và D Mô hình biểu hiện của gen α-expansin đã được nghiên cứu rộng rãi ở cây lúa nước (Cho và Kende, 1998 ) [13] và ở cà chua ( Reinhardt,1998) [32]

Gen LTP có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid qua màng LTP liên quan đến sinh tổng hợp các biểu bì làm tăng độ dày của lớp màng tế bào, qua đó làm giảm sự mất nước ở tế bào

thực vật [9]

Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn

Tuy sản phẩm biểu hiện gen không tác động trực tiếp đến tính chịu hạn của thực vật nhưng các gen điều khiển phiên mã lại có vai trò đáng kể trong

việc kích thích sự biểu hiện của các gen chức năng

Các gen điều khiển sự phiên mã mà sản phẩm của chúng có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trình tự DNA điều khiển (nhân tố tác động cis) trên vùng khởi động (promoter) của gen và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã của các gen chức năng

Theo nghiên cứu của một số tác giả đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế, có nhiều yếu tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn như:

DREB, ABRE, NAC, MYB, ZFHD Nhóm DREB là một nhân tố có chức năng

kích hoạt quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cách kích hoạt nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh Theo Li và đtg (2005) [28] nhân tố phiên mã DREB hoạt động không cần thông qua sự tác động của ABA, DREB trên đối tượng cây đậu tương đã chia thành các phân họ gồm: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, ngoài ra còn có DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5, mỗi gen có trình tự, độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện nhiều khi đậu tương gặp các điều kiện hạn Nhóm ABRE/ABF có trật tự lõi cis acting element: ACGTGGC Nhóm nhân tố khởi đầu ABRE/ABF điều khiển tính chịu hạn và biểu hiện của nhóm gen này phụ thuộc ABA.Theo Fujita và đtg năm 2005 đã tìm ra ABRE1 là một nhân tố

phiên mã có khả năng tăng cường tính chịu hạn ở Arabidopsis [20] Các nhân

tố phiên mã họ NAC chứa trình tự đồng nhất gọi là vùng hoạt động NAC ở đầu

N NAC có vai trò quan trọng trong việc xác định mô phân sinh đỉnh chồi, biệt hoá các cơ quan rễ, hoa trong sinh trưởng và phát triển của thực vật, NAC tham gia vào phản ứng của thực vật trong điều kiện bị tổn thương và tác nhân gây hại tấn công Nhóm NAC gồm 2 loại: Nhóm nhân tố khởi đầu NAC biểu hiện không phụ thuộc ABA và nhóm nhân tố khởi đầu NAC biểu hiện phụ thuộc ABA Nhóm MYB là nhóm gen biểu hiện phụ thuộc ABA, tham gia điều khiển tính chịu hạn, mặn và lạnh ở thực vật MYB có trật tự lõi cis acting element: MYBRS, YAACR Liao và đtg (2008) khi nghiên cứu về MYB đã chứng minh

GmMYB76, GmMYB92 và GmMYB177 giữ vai trò đặc biệt trong điều kiện

stress hạn, mặn và lạnh [27]

Nhóm ZFHD có trình tự chứa nhân tố tác động cis: ZFHDRS,

CACTAAATTGTCAC Ở Arabidopsis,Tran và đtg (2007) đã tìm ra nhân tố

phiên mã ZFHD1 đóng vai trò trong sự biểu hiện mất nước của tế bào [34]

1.3.2 Gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của cây đậu tương

Những năm gần đây, trên thế giới có nhiều nghiên cứu đi sâu tìm

hiểu vai trò của gen expansin liên quan đến sự kéo dài bộ rễ tham gia vào khả năng chịu hạn của thực vật và đã có những đóng góp đáng kể Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng expansin là một họ protein có chức năng mở rộng thành

tế bào và được coi là loại protein chủ yếu có ảnh hưởng đến việc kéo dài tế bào

GmEXP1và mRNA của gen này có kích thước 1089bp,mã hóa cho 255 amino

acid Lee và các cộng sự năm 2011 đã tiếp tục nghiên cứu biểu hiện gen

expansin Mức độ biểu hiện của gen GmEXP1 rất mạnh trong khoảng thời gian

hạt nảy mầm từ 1 ngày đến 5 ngày tuổi và giai đoạn kéo dài rễ diễn ra rất

nhanh, khi nghiên cứu biểu hiện của gen GmEXP1ở cây thuốc lá cho thấy gen

GmEXP1đã làm tăng sự phát triển rễ của cây thuốc lá chuyển gen và ít chịu tác

động từ môi trường ngoài [26] Các kết quả nghiên cứu cho thấy gen GmEXP1

đóng một vai trò quan trọng trong việc phát triển rễ của cây đậu tương, đặc biệt

là trong quá trình kéo dài của rễ chính và rễ thứ cấp

Ở cây đậu tương thì gen GmEXP1, GmEXP2 và các expansin khác trong

họ có độ tương đồng cao, chỉ khác ở hàm lượng amino acid Nhiều gen đã được phân lập từ một loạt các loài thực vật khác nhau và kết quả chỉ ra rằng chúng

tạo thành một họ expansin (expansin multigene) Công trình nghiên cứu của Li

(2002) gần đây đã phân loại expansin thành ba phân họ α-, β-và γ-expansin, dựa trên mối quan hệ phát sinh loài của chúng [29] Link và Cosgrove (1998) [30] cũng đã phân loại trước đó các phân họ α-expansin thành bốn nhóm; A, B,

C và D ở cây thuốc lá Phân tích sự phát sinh loài Lee và đtg [26] chỉ ra rằng

GmEXP1 thuộc nhóm D, trong đó bao gồm NtEXP3, OsEXP1, trong khi

Kết quả phân tích RNA bằng Northern blot của Lee và đtg (2008) cho

thấy gen GmEXP1 được biểu hiện mạnh ở rễ, đặc biệt khi đang trong quá trình

hình thành các rễ chính và rễ phụ Nghiên cứu ở mầm 5 ngày tuổi còn cho thấy trong thời kì này thì sự tăng trưởng của rễ chính giảm còn các rễ phụ lại được

phát triển mạnh Những kết quả nghiên cứu cho thấy rằng gen GmEXP1 có liên quan đến sự kéo dài rễ của cây đậu tương Phân tử mRNA của gen GmEXP1

thường được các khu vực hóa với các lớp tế bào biểu bì và nằm ở dưới vùng

kéo dài của rễ sơ cấp ở đậu tương, mRNA của gen GmEXP1 tập trung nhiều

nhất trong phần đầu rễ, nơi xảy ra sự kéo giãn tế bào Nghiên cứu của Guo (2011) [23] tìm ra GmEXP1và GmEXPB2 ở đậu tương về bản chất có liên quan đến cấu trúc hệ thống tế bào ở rễ phù hợp với stress phi sinh học từ môi trường Kam (2005) khi nghiên cứu ở ngô cũng đưa ra kết luận tương tự về vai trò của EXP đối với stress phi sinh học từ môi trường [23] Kết quả của các thí

nghiệm của Lee chỉ ra rằng gen GmEXP1 chủ yếu biểu hiện ở các vùng phân chia tế bào và kéo dài của rễ sơ cấp và thứ cấp Gen GmEXP1 biểu hiện ở các

tế bào trong lớp biểu bì và các lớp tế bào cơ bản của khu vực kéo dài của rễ

chính Các kết quả nghiên cứu về gen GmEXP1 đã gợi ý rằng sự biểu hiện của gen GmEXP1 xảy ra trong thời gian và vị trí xác định của quá trình phát triển

của rễ cây đậu tương [21], [24]

Hiện nay, vai trò của expansin trong quá trình phát triển rễ của cây đậu tương vẫn chưa được làm sáng tỏ mặc dù đã có nhiều nỗ lực nghiên cứu Tuy nhiên, hướng tiếp cận nghiên cứu chức năng của họ gen expansin trong quá trình phát triển của rễ, sự tham gia của các protein trong quá trình cải thiện

thành tế bào trong các lớp tế bào biểu bì rễ, trong việc điều hành các hoạt động kéo dài và trưởng thành của cây cũng sẽ được quan tâm nghiên cứu [10] Hầu hết sự gia tăng chiều dài rễ bắt đầu từ sự kéo dài tế bào ở vùng sinh trưởng của

rễ và biểu hiện của GmEXP1 ban đầu thể hiện rõ ở các rễ sơ cấp, sau đó thì giảm dần và cây càng lớn sự biểu hiện của GmEXP1 càng thấy rõ rệt ở khu vực

rễ thứ cấp

Theo Lee (2003) phân tử mRNA của gen GmEXP1 giống đậu tương mang mã

số AF516879 có kích thước 1089 bp, vùng mã hóa của gen có 768 nucleotid từ

nucleotide 52 đến nucleotide 819, mã hóa cho 255 amino acid, từ vị trí số 1 đến

vị trí amino acid thứ 255(hình 1.1)

Hình 1.1 Trình tự của vùng mã hóa của gen GmEXP1 ở đậu tương

Hình 1.2 trình bày về gen GmEXP1 và protein với hai vùng chức năng

của protein EXP1 ở cây đậu tương là DPBB và Pollen allerg

Hình 1.2 Sơ đồ về gen và protein EXP1 ở cây đậu tương

Trình tự amino acid của protein EXP1 có chứa vùng bảo thủ DPBB và vùng Pollen allerg Vùng DPBB(Double-Psi Beta-Barrel) có 91 amino acid, từ vị trí amino acid 64 đến 152 (Hình 1.3) DPBB là một vùng bảo thủ của Rare Lipoprotein A (RlpA) có cấu trúc bởi hai chuỗi dạng cuộn gấp kiểu beta (DPBB) Chức năng của RlpA đến nay vẫn chưa được làm rõ, nhưng hoạt động của nó đã được chứng minh như một chất kìm hãm sự phát sinh đột biến ở

E.coli Khúc cuộn DPBB thường là một miền enzyme và các thành viên của họ

DPBB là khá đa dạng và có tính đặc trưng

Hình 1.3 Trình tự amino acid vùng bảo thủ DPBB của protein EXP1