nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen gmexp1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (glycine max (l.) merrill)

Trong điều kiện khô hạn, sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào và sự phát triển mạnh của bộ rễ sẽ giúp cây thu được nhiều nước từ các lớp đất sâu, đảm bảo quá trình sinh trưởng và

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LÒ THANH SƠN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN

GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LÒ THANH SƠN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN

GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS.TS Chu Hoàng Mậu

2 PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

THÁI NGUYÊN - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu và PGS TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 01 năm 2015

TÁC GIẢ

Lò Thanh Sơn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng Hà, TS Lê Văn Sơn, TS Phạm Bích Ngọc, TS Lâm Đại Nhân, TS Nguyễn Trung Nam, TS Nguyễn Thị Thuý Hường - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu trong đề tài luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ Bộ môn

Di truyền&Sinh học hiện đại trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án; cảm ơn sự đóng góp những ý kiến quý báu trong các buổi seminar khoa học, báo cáo chuyên đề và báo cáo tiểu luận tổng quan luận án

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ ADN và ứng dụng và Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, các thầy cô giáo và cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, chân thành cảm ơn các đồng nghiệp là thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh Hoá - Trường Đại học Tây Bắc đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Thái Nguyên, tháng 01 năm 2015

TÁC GIẢ

Lò Thanh Sơn

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục những chữ viết tắt trong luận án iv

Danh mục bảng trong luận án v

Danh mục hình trong luận án vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Những đóng góp mới của luận án 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ THỰC VẬT VÀ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ĐỐI VỚI TÁC ĐỘNG CỦA HẠN 5

1.1.1 Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương 5

1.1.2 Vai trò của bộ rễ ở cây trồng và ở cây đậu tương 7

1.2 GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ Ở THỰC VẬT 12

1.2.1 Một số nghiên cứu về gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ 12

1.2.2 Expansin và cơ chế kéo dài rễ 14

1.3 CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG NHỜ A.TUMEFACIENS 25

1.3.1 Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen ở cây đậu tương thông qua A.tumefaciens 25

1.3.2 Cải thiện khả năng chịu hạn ở cây đậu tương bằng chuyển gen liên quan đến bộ rễ 33

2.1.1 Vật liệu thực vật 38

2.1.2 Các chủng vi khuẩn và các loại vector 39

2.1.3 Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu 39

2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 39

2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 39

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 40

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.3.1 Phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển bộ rễ 40

2.3.2 Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen 42

2.3.3 Phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1 44

2.3.4 Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 46

2.3.5 Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen 51

2.3.6 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 53

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54

3.1 ĐÁNH GIÁ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NGHIÊN CỨU 54

3.1.1 Sự kéo dài rễ chính của đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo 54

3.1.2 Thể tích bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo 54

3.1.3 Khối lượng khô của bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo 57

3.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG 59

3.2.1 Đặc điểm của gen GmEXP1 (cDNA) phân lập từ một số giống đậu tương 59

3.2.2 Sự đa dạng của trình tự vùng mã hoá gen EXP1 ở một số loài thực vật 67

3.3 PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN GmEXP1 69

3.3.1 Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 70

3.3.2 Gắn cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào vector pCB301 tạo vector chuyển gen GmEXP1 72

A.tumefaciens 76

3.4.2 Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T0 78

3.4.3 Phân tích và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T1 85

3.5 KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG GEN CHUYỂN GmEXP1 95

3.5.1 Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây đậu tương nhờ A.tumefaciens 95

3.5.2 Phân tích các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 97

Chương 4 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 100

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 109

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 112

PHỤ LỤC 128

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

tetrahydrochloride DRE Dehydration Responsive Element Yếu tố điều hoà phản ứng với

sự mất nước DREBs Dehydration Responsive Element

Yếu tố gắn với DRE

DPBB Double Psi Beta-Barrel structure Vùng cấu trúc DPBB

Assay

Xét nghiệm ELISA

ETDA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông - Lương thế giới

LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản

nuôi cấy vi khuẩn

dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô

P5CR l-Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate

Reductase P5CS l-Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate

Synthetase

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase

Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên mã ngược

thực vật Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u

TMB 3,3’,5,5’-TetraMethyl Benzidine

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside

DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN

Trang

Bảng 2.1 Thống kê một số giống đậu tương địa phương sử dụng làm vật liệu

nghiên cứu 38

Bảng 2.2 Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 39

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với Master Mix 42

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng 43

Bảng 2.5 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 43

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI 44

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI, NcoI 45

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII 46

Bảng 2.9 Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá 48

Bảng 2.10 Một số loại môi trường tái sinh cây đối với giống đậu tương DT84 50

Bảng 2.11 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR 52

Bảng 2.12 Chu trình nhiệt độ của phản ứng Real-time RT-PCR 52

Bảng 3.1 Chiều dài rễ chính của các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn 55

Bảng 3.2 Thể tích bộ rễ các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7 và 9 ngày hạn 55

Bảng 3.3 Khối lượng khô của bộ rễ các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn 56

Bảng 3.4 Sự sai khác về trình tự nucleotide trên gen EXP1 của đậu tương SL1 và DT84 67

Bảng 3.5 Thống kê một số trình tự gen EXP1 để phân tích đa dạng di truyền 68

Bảng 3.6 Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây thuốc lá mô hình N tabacum 78

Bảng 3.7 Kết quả phân tích chu kỳ ngưỡng và tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 83

Bảng 3.9 Kết quả xác định sự khác biệt về mức độ biểu hiện phiên mã ở hai dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 bằng t-Test 88 Bảng 3.10 Khối lượng chất khô của bộ rễ các dòng thuốc lá sau 3, 5, 7 và 9 ngày hạn 91 Bảng 3.11 Thể tích bộ rễ thuốc lá sau 3, 5, 7 và 9 ngày hạn 93 Bảng 3.12 Chiều dài rễ chính của các dòng thuốc lá sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn 94 Bảng 3.13 Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây đậu tương DT84 97

DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN ÁN

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc protein expansin suy diễn 20

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc 3D protein α-expansin1 của đậu tương 20

Hình 1.3 Cấu trúc thành tế bào thực vật 21

Hình 1.4 Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật của expansin 24

Hình 1.5 Sơ đồ các phương pháp phân tích cây chuyển gen 29

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 41

Hình 2.2 Sơ đồ phát triển vector chuyển gen mang gen GmEXP1 45

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm 49

Hình 3.1 Mối quan hệ giữa các giống đậu tương nghiên cứu dựa trên dữ liệu về sự phát triển bộ rễ trong điều kiện gây hạn nhân tạo 56

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen GmEXP1; colony-PCR chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp và sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng BamHI 60

Hình 3.3 So sánh trình tự gen GmEXP1_cDNA của Ngân hàng gen quốc tế (AF516879) và của bảy giống đậu tương nghiên cứu 63

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự DNA và cDNA của gen GmEXP1 phân lập từ giống SL1 65

Hình 3.5 Sơ đồ hình cây thể hiện sự khác biệt di truyền về trình tự nucleotide đoạn mã hoá của gen EXP1 ở một số loài thực vật 69

Hình 3.6 Kết quả điện đi sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng NcoI/NotI và sản phẩm colony - PCR chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pRTRA7/3_GmEXP1 70

Hình 3.7 Sơ đồ sản phẩm cắt plasmid bằng HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen GmEXP1 và hình ảnh điện di sản phẩm DNA đích đã tinh sạch từ vector pCB301 cắt bởi HindIII 72

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR bằng mồi SoyEXP1F_NcoI/SoyEXP1R_NotI chọn dòng vi khuẩn E.coli và A.tumefaciens mang vector chuyển gen 74

chuyển gen 77 Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen

GmEXP1 trong các cây thuốc lá chuyển gen 78

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen

GmEXP1 trong các cây thuốc lá chuyển gen 79

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của các cặp mồi chuẩn bị cho phản ứng Real-time RT-PCR trên các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 81 Hình 3.14 Đồ thị ngưỡng nhiệt, và đồ thị phân tích nhiệt độ nóng chảy của hai

gen GmEXP1 và actin ở các mẫu thuốc lá chuyển gen T0 trong phản ứng time RT-PCR 82 Hình 3.15 Kết quả lai Western các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 84 Hình 3.16 Hạt thuốc lá gieo trên môi trường MS không kháng sinh và có kháng sinh chọn lọc kanamycin 85

Real-Hình 3.17 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ gen GmEXP1 ở các dòng

thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 86

Hình 3.18 Biểu đồ so sánh tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các cây thuốc lá

chuyển gen thế hệ T1 so với mẫu cây chuyển gen T026 88 Hình 3.19 Kết quả lai Western các dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 89 Hình 3.20 Hình ảnh thí nghiệm gây hạn nhân tạo cây thuốc lá và so sánh hình thái rễ cây có tưới nước và cây không tưới nước ở giai đoạn 5 ngày gây hạn 90 Hình 3.21 Hình ảnh minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây đậu tương chuyển gen 96 Hình 3.22 Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen chuyển

GmEXP1 trong các cây đậu tương chuyển gen 98

Hình 3.23 Kết quả lai Western trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 99

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng chiến lược ở nhiều

quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mì Hạt đậu tương có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao Hạt có hàm lượng protein từ 32% - 52%, chứa nhiều amino acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin ) và các vitamin (B1, B2, C, D, E, K ) cần thiết cho cơ thể người và động vật Hạt đậu tương được sử dụng trực tiếp làm thực phẩm cho con người, làm thức ăn cho gia súc, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và là mặt hàng xuất khẩu có giá trị cao trên thế giới Đậu tương là cây trồng cải tạo đất Thân lá để lại trong đất

nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần do vi khuẩn Rhizobium cộng sinh có khả

năng cố định đạm giúp cải tạo độ phì và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên đất Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán kéo dài, lượng mưa không đều ở các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ Ngoài những tác động trực tiếp lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu còn làm thu hẹp diện tích sản suất nông nghiệp Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên thường xuyên khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với nhiều loại cây trồng, trong đó có đậu tương Theo thống kê của FAO, năng suất đậu tương trên thế giới giảm khoảng 11,13% trong ba năm trở lại đây Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu cây trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém Khô hạn có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển ở tất cả các giai đoạn của cây đậu tương Thiếu nước ở giai đoạn trước khi hoa nở làm giảm tới 40% năng suất hạt đậu tương

so với ảnh hưởng của hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa Chính vì vậy chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết và mang tính thời sự trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Trong điều kiện khô hạn, sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào và sự phát triển mạnh của bộ rễ sẽ giúp cây thu được nhiều nước từ các lớp đất sâu, đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của thực vật Thực vật có bộ rễ phát triển kéo dài, khả năng đâm xuyên tốt, có thể vươn tới những lớp đất sâu sẽ có

cơ hội thu nhận được nhiều nước hơn trong điều kiện khô hạn Đồng thời, sự điều chỉnh thẩm thấu trong tế bào chóp rễ bằng những cơ chế tích luỹ chất khô, tăng cường các kênh vận chuyển tích cực, tăng cường hô hấp và trao đổi ion cũng giúp thực vật dễ dàng lấy được lượng nước ít ỏi trong đất Mặt khác, trong điều kiện hạn, thực vật còn có một loạt các phản ứng kết hợp để tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện hạn như điều chỉnh đóng mở khí khổng, giảm thoát sự thoát hơi nước, tăng cường tích nước tế bào… Trong một loạt những phản ứng nói trên ở thực vật dưới điều kiện khô hạn của môi trường thì việc nghiên cứu tác động vào sự phát triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc và số lượng rễ bên được xem là biện pháp hữu hiệu trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương

Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn của cây trồng được xem là giải pháp quan trọng trong tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu hiện nay Hướng tiếp cận nghiên cứu cải thiện sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương đã được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại, trong đó công nghệ gen được coi là biện pháp

có hiệu quả trong nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn cao

Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc

điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 liên

quan đến sự kéo dài rễ bằng kỹ thuật chuyển gen

2.2 Mục tiêu cụ thể

(i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về trình tự

nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số giống đậu

tương địa phương

(ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên quan đến sự

kéo dài rễ ở cây đậu tương

(iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 biểu hiện

sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen

(iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên quan đến sự

phát triển kéo dài rễ

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông qua các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ và phân nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ

(2) Nghiên cứu thông tin về gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ, thiết kế cặp

mồi, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen này từ cây đậu tương

(3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen GmEXP1

liên quan đến sự kéo dài rễ

(4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài

rễ vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển

trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1. Phân tích, so sánh sự phát triển bộ rễ của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng ở thế hệ T1 trên phương diện chiều dài rễ chính, khối lượng khô và thể tích rễ

(5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan đến sự

kéo dài rễ vào cây đậu tương

4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập,

tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen và biểu hiện gen GmEXP1 liên

quan đến sự phát triển bộ rễ ở cây thuốc lá và cây đậu tương Việt Nam

Ứng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR và Western blot đã đánh giá được mức

độ biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được dòng đậu

tương chuyển gen mang gen GmEXP1

Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong tiếp cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu hạn theo hướng cải thiện sự phát triển bộ rễ bằng

kỹ thuật chuyển gen ở thực vật

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

Về mặt khoa học

Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen GmEXP1

phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84 Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc gen

GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với

cây đối chứng

Kết quả bước đầu tạo cây đậu tương chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở Việt Nam Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và trong nước cùng với 9 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế là những tư liệu

có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy

Về mặt thực tiễn

Các dòng cây thuốc lá chuyển gen tạo được có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen có thể cải thiện khả năng kéo dài rễ ở cây đậu tương và những cây trồng khác nhằm nâng cao khả năng chống chịu hạn

Kết quả thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ, tạo được cây chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương là kết quả bước đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ THỰC VẬT VÀ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ĐỐI VỚI TÁC ĐỘNG CỦA HẠN

1.1.1 Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương

1.1.1.1 Cây đậu tương

Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill (2n = 40) thuộc họ Đậu (Fabaceae) Các giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc giống phụ G.Soja, chi Glycine Hiện nay, đậu tương trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống

địa phương và các giống nhập nội [3], [8]

Đậu tương là loại cây trồng thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, cành, lá, hoa, quả và hạt Rễ đậu tương là loại rễ cọc gồm rễ cái và các rễ bên, trên có nhiều

nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm của không

khí Thân tròn, mang 8 - 14 đốt, các cành và lá mọc ra từ các đốt trên thân Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn có màu trắng hay tím Thời

kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào từng giống và thời vụ gieo trồng bởi nó chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ Quả đậu tương là loại quả ráp, ngoài vỏ quả thường có lông bao phủ, màu sắc vỏ quả khi chín có màu vàng hay xám đen Hạt đậu tương có hình dạng tròn bầu dục, tròn dài, tròn dẹt; vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen [2], [3] Cây đậu tương là cây trồng ngắn ngày, có thể trồng trên nhiều loại đất, nhiều

vụ trong năm; có thể xen canh, gối vụ rất thuận lợi cho phát triển sản xuất nông nghiệp để khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt đới Trong suốt thời gian sinh trưởng, nhu cầu nước của cây không đồng đều qua các giai đoạn Yêu cầu về độ ẩm đồng ruộng trung bình là 50 - 60%, giai đoạn ra hoa, hình thành quả phải đạt 70 - 80% nên đậu tương được xếp vào nhóm cây trồng có nhu cầu về nước cao [2], [14] Đối với ngành trồng trọt, đậu tương có khả năng tích luỹ đạm của không khí

để tự túc và làm giàu đạm cho đất nhờ vi khuẩn cộng sinh trên nốt sần ở bộ rễ và sinh khối thân, cành lá Các chất hữu cơ này góp phần làm thay đổi tính chất lý hoá

học và tăng độ phì nhiêu cho đất Trong hệ thống thâm canh, trồng đậu tương có tác dụng làm cho cây trồng vụ sau phát triển tốt hơn, góp phần phá vỡ chu kỳ sâu bệnh, chống nạn ô nhiễm do lạm dụng phân bón hoá học và thuốc trừ sâu [2], [5]

1.1.1.2 Tác động của hạn đối với cây đậu tương

Đậu tương tuy là cây trồng cạn nhưng cần nhiều nước cho quá trình sinh trưởng và phát triển để có thể cho năng suất cao Nhu cầu về nước tăng theo thời gian sinh trưởng của cây cùng với sự tăng trưởng mạnh của thân, lá Quá trình sinh trưởng của cây phụ thuộc vào cường độ quang hợp, hiệu suất quang hợp, tổng diện tích lá và thế năng quang hợp (thời gian lá xanh) Tổng sản phẩm quang hợp của cây nếu bị thiếu nước sẽ giảm do tỷ lệ CO2 hấp thụ trên một đơn vị diện tích lá giảm và diện tích quang hợp giảm do sự phát triển của lá kém và chóng tàn [84] Thiếu nước trầm trọng ảnh hưởng tới sự hình thành diệp lục dị hình, giảm sự vận chuyển điện tử trong quang phosphoryl hoá, ảnh hưởng hoạt tính các enzyme khác tham gia vào quá trình đồng hoá carbon Từ đó dẫn tới giảm hiệu quả quang hợp và sự tích luỹ chất khô của cây [57], [84] Nước rất cần cho sự phát triển bình thường của cây đậu tương cả giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng và giai đoạn sinh trưởng sinh thực

Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, tỷ lệ sử dụng nước ở pha nảy mầm và cây con thấp do tán còn nhỏ Nhu cầu nước tăng dần khi cây đạt 3 - 5 lá kép, tăng nhanh khi bắt đầu bước vào giai đoạn sinh trưởng sinh thực

Trong giai đoạn sinh trưởng sinh thực, cây rất nhạy cảm với tình trạng thiếu nước Phần lớn biến động về năng suất là do biến động về lượng nước cho cây trong thời kỳ ra hoa đậu quả Ở giai đoạn ra hoa, đậu quả nếu thiếu nước, hoa và quả non

bị rụng nhiều Giai đoạn quả phát triển và hạt vào mẩy cần nhiều nước nhất, thiếu nước ở giai đoạn này sẽ dẫn đến giảm kích thước hạt, năng suất giảm đáng kể Nếu thiếu nước xảy ra trước giai đoạn hạt phát triển, sau đó đủ nước thì quang hợp có thể phục hồi, sinh trưởng có thể trở lại bình thường và hạt có thể phát triển tới kích thước bình thường [5] Theo Manavalan và cs (2009), năng suất của đậu tương giảm

từ 32 đến 44% nếu gây hạn ở giai đoạn làm hạt [84]

Khả năng cố định đạm ở các loài cây họ Đậu thường rất nhạy cảm đối với tình trạng nước ở trong đất Mất quá nhiều nước, cây đậu tương không chỉ giảm khả năng cố định CO2, giảm sự phát triển lá mà khả năng cố định đạm cũng bị ảnh hưởng nghiêm trọng, làm giảm sinh tổng hợp protein [101] Quá trình cố định đạm giảm một phần do lượng sản phẩm quang hợp chuyển về rễ giảm, một phần do ảnh hưởng trực tiếp của thế nước ở trong nốt sần Theo Huang và cs (1975), hoạt động

cố định đạm giảm khi thế nước giảm và ngừng lại khi trọng lượng nốt sần giảm dưới 80% so với khi đủ nước [58]

Nhiều nhân tố hạn chế khả năng cố định đạm trong điều kiện hạn đã được xác định ở cây đậu tương bao gồm khả năng sử dụng O2 giảm, nguồn carbon tới các nốt sần giảm, hoạt tính của enzyme tổng hợp sucrose giảm, hàm lượng ure và amino acid

tự do tăng Đặc biệt, mối quan hệ về thế năng nước của lá và nốt sần đã được xác định ở cây đậu tương trong điều kiện hạn Hoạt tính của nitrogenase giảm 70% trong

4 ngày đầu tiên khi cây gặp hạn, trong khi đó quá trình quang hợp giảm khoảng 5% [69] Ngoài ra, sự thiếu hụt về nước cũng ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính của nốt sần thông qua sự tăng cường tính kháng đối với khả năng khuếch tán oxy Tình trạng thiếu nước ở trong đất cũng dẫn tới sự tích lũy ure ở lá của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt sần [111]

1.1.2 Vai trò của bộ rễ ở cây trồng và ở cây đậu tương

1.1.2.1 Đặc điểm kiến trúc bộ rễ liên quan đến sự hấp thu nước

Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật Ở cây đậu tương, sự thích nghi với các điều kiện khô hạn chủ yếu thông qua việc phát triển rễ trụ để có thể tìm kiếm các nguồn nước từ các lớp đất sâu Hệ thống rễ phát triển giúp cho cây có thể vươn tới các lớp đất có độ ẩm cao, giàu dinh dưỡng [59]

Đậu tương là thực vật hai lá mầm có hệ rễ cọc phát triển gồm một rễ cái và nhiều rễ bên Rễ cái phát triển dài ăn xuyên vào lòng đất từ 30 - 50 cm Rễ bên phát sinh quanh cổ rễ, lan toả theo bề ngang xung quanh gốc, hút nước và khoáng trên tầng đất mặt chừng 15 - 25 cm Bộ rễ của đậu tương phát triển rất khoẻ theo từng giai đoạn và cho thu hoạch thì rễ mới ngừng phát triển [5]

Sinh khối, mật độ, chiều dài và chiều sâu của rễ là các đặc điểm chính giúp cho việc chống chịu hạn và ảnh hưởng đến năng suất cây trồng dưới tác động thiếu nước của môi trường [46], [90], [111], [130] Khả năng thu nhận nước của cây phụ thuộc chủ yếu vào bộ rễ Trong điều kiện khô hạn, những cây chịu hạn tốt thường

có bộ rễ khoẻ, dài, mập, có sức đâm xuyên sâu sẽ hút được nước ở những lớp đất sâu hoặc rễ lan rộng với số lượng lớn Khi ở giai đoạn cây non, thực vật thường chịu tác hại mạnh của hạn vì bộ rễ chưa phát triển đầy đủ và còn yếu [13] Các chỉ tiêu về sự phát triển bộ rễ như chiều dài, thể tích rễ, khả năng đâm xuyên qua các lớp đất sâu được Songsri và cs (2008) sử dụng để đánh giá và chọn lọc dòng lạc

có khả năng chống chịu hạn trong điều kiện khô hạn tự nhiên [114]

Một trong những nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng đâm sâu của rễ đậu tương là tỷ số kéo dài rễ trụ Do rễ trụ được hình thành đầu tiên ở đậu tương nên việc xác định các giống đậu tương có đặc tính kéo dài rễ trụ nhanh sẽ cho phép xác định khả năng đâm sâu của rễ Nhiều nghiên cứu trên các giống đậu tương có tỷ số kéo dài rễ trụ cao cho thấy những giống này có thể lấy nước ở chiều sâu tốt hơn nhiều so với các giống còn lại [46], [67], [117] Một số nghiên cứu khác thực hiện đối với hệ thống rễ bên của cây đậu tương cho thấy trong điều kiện hạn, số lượng rễ bên trên đơn vị chiều dài rễ trụ tăng đáng kể, nhưng chiều dài và đường kính rễ trụ không thay đổi [21], [53], [117]

Hạn chế về nước trong quá trình sinh trưởng thường làm tăng sinh khối của rễ,

từ đó làm tăng tỷ lệ rễ/thân Nghiên cứu cho thấy ở cây đậu tương không được tưới nước thì bộ rễ có chiều dài hơn hẳn ở cây đậu tương được tưới nước Ngoài ra, các nhà khoa học cũng nhận thấy mối tương quan rất chặt chẽ giữa nhiều tính trạng rễ như trọng lượng khô, chiều dài tổng số, cấu trúc và số lượng rễ bên ở các giống chịu hạn Những tính trạng này thường được dùng như các chỉ tiêu quan trọng để đánh giá và nhận dạng các giống đậu tương có đặc tính chịu hạn [21], [46], [48], [119]

Ở cây đậu tương, khi khô hạn xảy ra trong pha sớm hay muộn của giai đoạn sinh trưởng sinh thực làm tăng mạnh sự phát triển bộ rễ, đặc biệt là hệ thống rễ ở các lớp đất sâu Khả năng phát triển bộ rễ không quá bị ảnh hưởng khi khô hạn xảy

ra ở cuối giai đoạn sinh thực [55] Một nghiên cứu khác cho thấy cây đậu tương khi

bị xử lý hạn ở giai đoạn trước khi ra hoa sẽ cho năng suất hạt cao hơn những cây đậu tương bị xử lý hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa Điều này được giải thích là do chúng

đã phát triển bộ rễ đầy đủ để thích ứng với điều kiện hạn trước khi nở hoa [53] Có thể thấy rằng, cây đậu tương phát triển tốt bộ rễ ở những giai đoạn sớm của quá trình sinh trưởng sinh dưỡng sẽ giúp cho cây có thể thích ứng tốt trong các điều kiện hạn

Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Uga thực hiện chuyển gen DRO1 (Deeper

rooting 1) xác định tính trạng đâm xuyên sâu vào đất theo phương thẳng đứng của bộ

rễ từ giống lúa Kinandang patong chịu được khô cằn vào lúa trồng IR64 Kết quả trồng

thực nghiệm trong điều kiện khô hạn nghiêm trọng cho thấy, giống IR64 bị thiệt hại hoàn toàn trong khi dòng IR64 chuyển gen chỉ giảm năng suất khoảng 30% [126] Vai trò bộ rễ của thực vật nói chung và của cây đậu tương nói riêng được đánh giá cao trong nhiều nghiên cứu cải thiện khả năng chịu hạn Khi tổng quan về cơ chế sinh lý và phân tử của đặc tính chịu hạn ở đậu tương, Manavalan và cs (2009) cho rằng, việc xác định đầy đủ cơ chế của những đặc tính và tính trạng liên quan đến khả năng chịu hạn, trong đó những đặc điểm liên quan đến bộ rễ là rất cần thiết trong xây dựng chiến lược cải thiện khả năng chịu hạn của loại cây trồng này [84] Năm 2013, Ha và cs dựa trên các chỉ tiêu về chiều dài rễ chính, thể tích bộ rễ và số lượng rễ bên để đánh giá đặc tính chịu hạn và tiềm năng di truyền của giống đậu tương mới DT2008 (giống lai chịu hạn tốt của Việt Nam) khi so sánh với giống đậu tương William 82 [50] Thu và cs (2014) cũng sử dụng tiêu chí phát triển kéo dài rễ làm một trong những căn cứ quan trọng trong nghiên cứu đánh giá khả năng chịu hạn của 13 giống đậu tương Việt Nam nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu về tiềm năng các giống cho sản xuất đậu tương và kỹ thuật di truyền [119]

1.1.2.2 Khả năng hút nước của bộ rễ và một số đặc tính sinh lý liên quan

Khả năng hút nước của rễ trước hết phụ thuộc vào áp suất thẩm thấu của tế bào lông hút Áp suất thẩm thấu của tế bào lệ thuộc vào đặc điểm keo hoá chất nguyên sinh thông qua một số quá trình sinh lý như: hô hấp rễ, tích luỹ chất khô, sự trao đổi ion của rễ, hoạt động của các kênh vận chuyển tích cực trên màng tế bào lông hút Khả năng hút nước của bộ rễ còn liên quan đến một số quá trình sinh lý

của cơ thể như cường độ thoát hơi nước qua lá, quá trình tổng hợp và tích luỹ chất khô của cây Ngoài ra, sự hút nước của rễ còn phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, thành phần và nồng độ muối khoáng, độ ẩm môi trường [116]

Nước có thể bay hơi vào khí quyển qua tất cả các bộ phận của cây, nhưng quan trọng và chủ yếu nhất là sự bay hơi nước qua bề mặt lá Cường độ thoát hơi nước chủ yếu phụ thuộc vào mức độ đóng mở lỗ khí Thoát hơi nước là động lực phía trên đảm bảo cho sự hút nước hút khoáng và dinh dưỡng, vận chuyển từ rễ lên các bộ phận phía trên của cây Sự thoát hơi nước qua khí khổng tạo ra sự chênh lệch áp suất nước giữa tán và rễ cây (sự chênh lệch thế nước) [123]

Sự tăng trưởng của tế bào phụ thuộc vào những yếu tố sinh hoá ảnh hưởng tới

sự co giãn của thành tế bào và những yếu tố lý học kiểm tra sự phân tán của nước đi vào tế bào Thân cây sinh trưởng ban đêm mạnh hơn ban ngày, nhưng rễ sinh trưởng ban ngày mạnh hơn, bởi vì rễ ít tiếp xúc với những bất lợi xảy ra ban ngày Ban ngày, rễ giữ sức căng cao hơn lá Như vậy, ban ngày sự phát triển của lá do thiếu nước giảm, những sản phẩm quang hợp được chuyển về rễ Ban đêm, khí khổng đóng dẫn đến sức căng tăng, tế bào phát triển mạnh hơn và trở thành cơ quan chứa nhiều carbonhydrate hơn rễ và như vậy rễ sinh trưởng kém hơn Song song với quá trình tăng trưởng của tế bào, hoạt động tích luỹ chất khô cho cơ thể thực vật tăng lên và áp lực hút nước mỗi tế bào và cả cơ thể nhờ đó cũng tăng lên [5]

Khả năng hấp thụ tích cực của nước từ đất vào lòng mạch lệ thuộc vào số lượng và hoạt động của các kênh vận chuyển tích cực trên biểu bì vùng lông hút Cây có bộ rễ phát triển tốt, diện tích vùng lông hút lớn với nhiều kênh trên màng thì khả năng hút nước càng cao [116], [123]

Guttikonda và cs (2014) nghiên cứu biểu hiện gen AtDREB1D phân lập từ Arabidopsis trên cây đậu tương chuyển gen cho thấy, trong điều kiện bình thường

cây chuyển gen và không chuyển gen không có sự khác biệt đáng kể Trong điều

kiện dần mất nước, cây đậu tương chuyển gen AtDREB1D duy trì được hàm lượng

nước cao hơn trong cây vì các dòng biến đổi gen có thể sử dụng nước chậm hơn, nhờ vậy cây chậm héo và có tỷ lệ sống sót cao hơn 17 - 24% so với cây không chuyển gen [49]

1.1.2.3 Đặc điểm nốt sần liên quan đến sự phát triển bộ rễ đậu tương trong điều kiện hạn

Đối với thực vật thuộc họ Đậu, ngay từ giai đoạn cây mọc được vài tuần đã bắt đầu từ rễ cái trước rồi đến rễ bên xuất hiện nốt sần, trong có chứa nhiều vi khuẩn

Rhizobium japonicum sống cộng sinh Vi khuẩn Rhizobium có trong đất, xâm nhập

vào rễ cây qua lông hút, có nhiệm vụ tổng hợp đạm hữu cơ từ nitơ không khí Thời gian đầu, số lượng các nốt sần xuất hiện rất ít, sau đó ngày càng gia tăng theo đà tăng trưởng của cây Đến khi cây bắt đầu ra hoa và hình thành quả thì nốt sần rễ ngừng phát triển [106], [139] Số lượng nốt sần hình thành trong rễ đậu tương được Lim và

cs (2011) xác định là do ảnh hưởng của hai gen GmRIC1 và GmRIC2 Sản phẩm

biểu hiện của các gen trên là rhizobia trong tế bào lông hút thúc đẩy quá trình khởi sinh hình thành và phát triển lan rộng của nốt sần [80]

Nghiên cứu của Xu và cs (2004) cho thấy, tình trạng thiếu nước nghiêm trọng gây hạn chế về tỷ lệ cố định đạm của nốt sần rễ đậu Sự cố định đạm của nốt sần có liên quan đến một số quá trình sinh lý trong đó có tỷ lệ đồng hoá carbon trong quá trình quang hợp Tuy nhiên, trong điều kiện khô hạn ở mức độ cho phép, thực vật thuộc họ Đậu vẫn duy trì được khả năng cố định đạm từ nitơ không khí Nhờ đó tăng cường quá trình tích luỹ chất khô cho bộ rễ, tăng áp suất thẩm thấu cho tế bào và cơ thể Đặc tính này là một ưu thế ở những thực vật thuộc họ Đậu góp phần tạo sinh khối cho cây giúp cây khoẻ mạnh vượt qua những điều kiện bất lợi phi sinh học của môi trường [57], [139]

Nghiên cứu của Ladrera và cs (2007) về khả năng cố định đạm ở nốt sần rễ đậu tương cho thấy, hầu hết các giống đậu tương đều tích luỹ đạm mạnh mẽ trong điều kiện được cung cấp nước đầy đủ Sự cố định đạm rất nhạy cảm với độ khô của đất và

tỷ lệ đồng hoá carbon Trong giai đoạn đầu gây hạn nhân tạo, quá trình cố định đạm ở giống đậu tương Biloxi chịu hạn kém sớm bị đình trệ trong khi ở giống đậu tương Jackson chịu hạn tốt, hoạt động cố định đạm vẫn diễn ra bình thường Quá trình tích luỹ đạm và carbon thực hiện trước khi hạn hán xảy ra quyết định lớn đến khả năng chống chịu hạn ở các giống đậu tương [70]

Khả năng tích luỹ đạm và carbon trước và trong khi xảy ra khô hạn được sử dụng làm căn cứ chọn tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn Hàm lượng

ure ở cuống lá được xem là một trong những chỉ tiêu để sàng lọc các dòng cây đậu tương có khả năng tích lũy nitơ tốt hơn trong điều kiện khô hạn Bằng cách sàng lọc

số lượng lớn các dòng đậu tương dựa vào hàm lượng ure cuống lá, Sinclair và cs (2007) đã chọn được 8 dòng đậu tương có khả năng cố định đạm tốt Trồng thử nghiệm để đánh giá khả năng chịu hạn trong điều kiện nhà kính và khô hạn tự nhiên cho thấy, các dòng cố định đạm tốt đều có khả năng chịu hạn và cho năng suất cao hơn các giống đối chứng Giống đậu tương Jackson chịu hạn và có khả năng cố định đạm cao, đã được dùng làm thể bố mẹ trong các cặp lai để tạo ra giống đậu tương có năng suất cao ở các điều kiện hạn [112]

Nghiên cứu của Serraj và cs (2003) cho thấy, trong giai đoạn đầu của khô hạn,

sự cố định đạm của nốt sần rễ đậu phụ thuộc vào khả năng đồng hoá carbon, làm tăng cường khả năng hình thành và tích luỹ chất khô cho các tế bào bộ rễ, trong đó

có một số loại amino acid ưa nước (như serine, tyrosine) dẫn đến hiệu quả tăng cường khả hấp thụ nước cho bộ rễ và thay đổi kích thước bộ rễ [109]

Hiểu biết về các cơ chế sinh lý và quá trình điều hoà di truyền của sự thích nghi của bộ rễ dưới điều kiện hạn, xác định các gen đặc hiệu liên quan đến sự phát triển bộ rễ mở ra triển vọng sử dụng cho việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen

1.2 GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ Ở THỰC VẬT

1.2.1 Một số nghiên cứu về gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ

Khi nghiên cứu đặc tính chịu hạn về mặt sinh lý, hoá sinh và cấu trúc tế bào đã phát hiện hàng loạt những biến đổi sâu sắc ở những mức độ khác nhau, trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây đậu tương Điều này chứng tỏ tính chịu hạn của thực vật do nhiều gen quy định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau Cho đến nay các nhà khoa học vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ xác định được các gen liên quan đến đặc tính chịu hạn của cây đậu tương [13] Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương có liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo của chất nguyên sinh, đặc điểm của quá trình trao đổi chất, sự biến đổi hình thái sinh lý của cơ thể để thích nghi với điều kiện sinh thái bất lợi [84] Khả năng chịu hạn của thực vật thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau như: sự phát triển của bộ rễ, tính chín sớm tương đối, bản chất di truyền của

từng giống có khả năng sử dụng nước tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây [10] Trong số những thay đổi toàn diện của cơ thể thực vật trong điều kiện hạn, nhiều nhà khoa học quan tâm đến cơ chế phân tử điều khiển sự biến đổi tính trạng hình thái bộ rễ

Năm 2009, Tucker và cs nghiên cứu hoạt động của 17 gen ACS xác định ACC

(1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid) là tiền chất hình thành ethylene Kết quả cho thấy, ACC được tổng hợp mạnh ở hệ thống rễ, đặc biệt là vùng chóp rễ của nhóm đậu tương có hệ thống rễ bên phát triển tốt và ít bị tuyến trùng xâm hại Ethylene giữ nhiều vai trò quan trọng trong sự phát triển bình thường của bộ rễ, trong đó gián tiếp liên quan đến sự khởi sinh hình thành rễ bên và ngăn ngừa sự xâm nhiễm của tuyến trùng gây hại [124]

Nghiên cứu của Delis và cs (2005) cho thấy, họ gen GmCuAO có liên quan tới

sự phát triển nhanh các tế bào mô rễ và trụ dưới lá mầm ở đậu tương Đặc biệt là sự

biểu hiện của gen GmCuAO1 (mã hoá 673 amino acid) trong việc kéo dài các tế bào

của phần lõm trụ dưới lá mầm khi tiếp xúc với ánh sáng Trong các tế bào trụ dưới

lá mầm không tiếp xúc với ánh sáng, sản phẩm hoạt động của gen GmCuAO1 cũng

cao hơn vài lần các tế bào bình thường khác [42]

Năm 1998, Hoon Ahn và cs phát hiện gen Sb-HRGP3 dài 1353 bp ở đậu tương

mã hoá hydroxyproline hoạt động mạnh trong mô của vùng chuyển đổi cấu tạo sơ cấp sang cấu tạo thứ cấp của rễ Ở rễ thứ cấp, gen này hoạt động mạnh hơn so với

các rễ chính Rất có thể, sự biểu hiện của gen Sb-HRGP3 (Soybean Hydroxyproline

Rich Glycoprotein 3) liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ [56]

Nhân tố phiên mã NAC giữ vai trò quan trọng trong phản ứng của thực vật, giúp

thực vật phát triển bình thường trong những điều kiện bất lợi Nghiên cứu trên đậu

tương của Hao và cs (2011) phát hiện sản phẩm phiên mã của hai gen là GmNAC11

và GmNAC20 tăng cao ở rễ và lá mầm trong điều kiện gây hạn, lạnh và mặn Dòng cây Arabidopsis chuyển gen GmNAC20 có khả năng chịu mặn, chịu lạnh và hình thành nhiều rễ bên Nhóm nghiên cứu cho rằng, GmNAC20 có thể điều chỉnh sự phát triển rễ bên thông qua con đường kích hoạt nhân tố DREB/CBF và có thể kiểm soát sự

phát triển rễ bên bằng cách thay đổi các gen liên quan đến tín hiệu auxin [51]

Những năm gần đây, trên thế giới có một số nghiên cứu đi sâu tìm hiểu vai trò

và đã chứng minh được cơ sở phân tử của protein expansin liên quan đến sự nới lỏng vách cellulose, kéo giãn thành của tế bào thực vật Các kết quả nghiên cứu chỉ

ra rằng expansin là một họ protein có chức năng mở rộng thành tế bào và được coi

là loại protein chủ yếu có ảnh hưởng đến việc phát triển kéo dài tế bào ở các mô sinh trưởng của thực vật [32], [48], [68], [72], [87], [108]

Năm 2003, Lee và cs phân lập được các gen GmEXP1 và GmEXP2 từ mRNA xác định các protein expansin ở cây đậu tương RNA thông tin của GmEXP1 tập

trung chủ yếu trong phần đầu rễ, nơi xảy ra sự kéo giãn tế bào và khan hiếm ở miền trưởng thành - nơi chấm dứt sự kéo giãn tế bào, đặc biệt nhiều ở giai đoạn mầm 5 ngày tuổi Bằng kỹ thuật lai trực tiếp trên tế bào và mô với probe phát xạ huỳnh

quang, tác giả còn nhận định, sản phẩm phiên mã của gen GmEXP1 có nhiều trong

các tế bào biểu bì và các lớp tế bào miền sinh trưởng của cả rễ cọc và rễ bên Kết

quả chỉ ra rằng, gen GmEXP1 có vai trò quan trọng trong sự phát triển bộ rễ đậu

tương, đặc biệt là trong sự hình thành và kéo dài của cả rễ chính và rễ bên [72] Nghiên cứu của Guo và cs (2011) đã phân lập từ đậu tương và chuyển thành công

gen GmEXPB2 vào cây Arabidopsis Các dòng cây chuyển gen có khả năng tăng

nhanh sự phân chia tế bào và phát triển kéo dài rễ so với đối chứng [48]

Hướng tiếp cận nghiên cứu chức năng của họ gen expansin trong quá trình phát triển kéo dài rễ, sự tham gia của các protein expansin trong quá trình cải thiện thành tế bào trong các lớp biểu bì rễ, trong việc điều chỉnh các hoạt động kéo dài và trưởng thành của cây sẽ được quan tâm nghiên cứu

1.2.2 Expansin và cơ chế kéo dài rễ

1.2.2.1 Đặc điểm của gen expansin ở thực vật

Expansin là một họ protein tác động chủ chốt trong việc mở rộng của thành tế bào thực vật Protein expansin được mã hoá bởi họ đa gen (multi-gene family), xác định các liên họ protein có tác động nới lỏng thành tế bào thực vật bằng hiệu quả thay đổi pH màng tế bào Gen expansin được phân lập đầu tiên từ trụ dưới lá mầm dưa chuột trong nghiên cứu về cơ chế tăng trưởng tế bào thực vật [89] Gen expansin sau đó được phát hiện, phân lập và thử nghiệm chức năng sinh học trong những nghiên cứu về cơ chế vươn dài lóng của giống lúa ngoi ở Đông Nam Á [74],

[73], [86] Gần đây, số lượng các loại gen expansin được phát hiện ngày càng tăng ở

các loài thực vật như Arabidopsis, lúa, yến mạch, đậu tương, khoai tây, ngô, [147]

Vai trò của expansin liên quan đến tính chống chịu với các yếu tố bất lợi phi sinh học ở thực vật, trong đó nhiều tác giả đề cập đến là khả năng chịu hạn, điển hình như Wu và cs (1996, 2001) phân tích biểu hiện khả năng chịu hạn ở ngô [135], [136], Jones và cs (2004) đề cập đến vai trò chống mất nước và bù nước ở cây

Việc giải trình tự hệ gen đậu tương hoàn thiện đã làm sáng tỏ hơn về tiến hoá

và những đặc điểm khác nhau của siêu họ gen expansin ở loài thực vật này Phân tích bản đồ phiên mã gen expansin đậu tương ở các mô khác nhau trong điều kiện bình thường cho thấy có nhiều sai khác về sự biểu hiện giữa các phân họ gen [79] Dựa trên cơ sở nghiên cứu gen expansin ở Arabidopsis, Kende và cs (2004) đã đưa

ra danh pháp hệ thống phân loại expansin của đậu tương gồm 75 gen expansin được phân biệt, định danh và định vị trên nhiễm sắc thể Ngoại trừ NST số 8 và 16, gen expansin có mặt ở tất cả các NST từ 1 đến 20 NST số 17 mang nhiều gen expansin hơn cả (9 gen); ngược lại NST 7, 9, 13, 15 và 20 mang không quá hai gen [68] Năm 2014, Zhu sử dụng phần mềm MEGA v5.0 xây dựng cây phân loại với

thuật toán NJ phân tích tất cả trình tự gen expansin của đậu tương, Arabidopsis và

lúa Từ đó phân chia các gen expansin của đậu tương thành 4 phân họ tương tự như nghiên cứu của Kende Ngoài ra, ông còn căn cứ vào đặc điểm cấu trúc gen (đầu 5’-UTR, các exon - intron, đầu 3’-UTR) để xác lập mối quan hệ tiến hoá Kết quả là 75

gen expansin từ đậu tương được xếp vào 4 phân họ: EXPA gồm 49 gen, EXPB gồm

9 gen; EXLA gồm 2 gen và EXLB có 15 gen Các gen thuộc cùng phân họ có cấu

trúc exon - intron tương tự nhau Các gen EXPB và EXLA chứa 4 exon; các gen EXPA chứa 3 exon và các gen EXLB gồm 5 exon Phân tích trình tự các gen trong

mỗi phân họ cho thấy, các gen ở mỗi phân họ tương đối bảo thủ và giữa các phân họ đều biểu hiện đa hình Mức độ sai khác khá cao của cấu trúc exon - intron trong mỗi phân họ gen expansin đậu tương cho thấy, siêu họ gen expansin này chịu áp lực cao của quá trình tiến hoá [108], [147]

Libault và cs (2010) đã định lượng mRNA của đậu tương bằng kỹ thuật time RT-PCR cho thấy các gen expansin hoạt động phiên mã ở mức độ thấp; lượng tích luỹ sản phẩm phiên mã của các gen expansin có sự khác biệt giữa các mô [79]

Real-Ở cây đậu tương có tới 23/75 gen expansin hoạt động thường xuyên trong tất cả các

mô phân tích Điều đó cho thấy expansin biểu hiện rất phức tạp trong nhiều quá trình phát triển của cây đậu tương Bản đồ trình tự mRNA cũng thể hiện phần lớn các gen expansin đậu tương biểu hiện phiên mã ở mỗi mô đơn lẻ Điều đó chỉ ra rằng, mỗi loại gen expansin hoạt động đặc hiệu ở từng loại mô hoặc tế bào riêng rẽ Khoảng 25% (trong tổng số 75 gen), 20%, 13%, 11% và 7% gen expansin đậu tương biểu hiện phiên mã mức độ cao lần lượt ở các mô rễ, hạt, vỏ quả, lá, nách lá

và hoa [77], [147]

Sự biểu hiện rộng của những gen này cho thấy gen expansin ở đậu tương liên quan đến sự phát triển phức tạp của các mô và các tổ chức cơ thể trong điều kiện bình thường Trong một số trường hợp, sự biểu hiện gen expansin có thể rất đặc biệt

và giới hạn ở những mô đơn lẻ hoặc trong từng loại tế bào Có bảy gen expansin chỉ

biểu hiện ở mô rễ (GmEXPA12, GmEXPA8, GmEXPA2, GmEXLB12, GmEXPA23, GmEXPA29, GmEXPA36 và GmEXPA37); ba gen chỉ biểu hiện ở hạt (GmEXPA7, GmEXPA14 và GmEXPB5); hai gen chỉ biểu hiện ở hoa (GmEXLB5 và GmEXPA46); một gen chỉ biểu hiện ở nách lá (GmEXPB6) và một gen chỉ biểu hiện

ở lá (GmEXLB15) Có thể thấy, các gen trong họ expansin tập trung biểu hiện nhiều

ở những mô dưới mặt đất: rễ chính, rễ tơ và chóp rễ [77] Các gen expansin đậu tương có độ tương đồng cao về trình tự và có thể giữ chức năng như nhau ở mô

Chẳng hạn GmEXPA2 và GmEXPA12 có trình tự tương đồng cao và chỉ biểu hiện ở

mô rễ nên rất có thể cặp gen này đảm nhiệm cùng chức năng đối với sự phát triển của bộ rễ [147]

Các nghiên cứu chỉ ra rằng cả bốn phân họ gen expansin đậu tương đều biểu hiện khác nhau là do vùng promoter Các promoter ở vùng trước mã hoá của gen giữ vai trò cốt yếu trong điều hoà biểu hiện của gen ở từng mô, từng giai đoạn phát triển hay trong những môi trường nhất định Theo đó, đoạn DNA tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gen có cấu trúc gồm hai phần đối xứng nhau được gọi là

trình tự cis Trình tự này nằm ở phần điều hoà của gen, là nơi tiếp nhận tín hiệu điều

hoà [147] Năm 2014, Zhu và cs đã sử dụng phần mềm PlantCARE của Lescot để phân tích vùng promoter của gen expansin ở đậu tương và phát hiện nhân tố hoạt

hoá cis trên DNA dài 1500 bp nằm trước codon khởi động Có bốn dạng nhân tố hoạt hoá cis được phát hiện trên vùng điều hoà của siêu họ gen expansin đậu tương Dạng cis thứ nhất của vùng điều hoà là nhân tố kích ứng ánh sáng Dạng cis thứ hai

của vùng điều hoà gen expansin là vùng tiếp nhận tín hiệu hormone thực vật Dạng

cis này hoạt động phụ thuộc tín hiệu từ auxin, gibberellin và salicylic để điều hoà

biểu hiện gen expansin ở đậu tương [147] Sự biểu hiện các gen thuộc phân họ expansin ở đậu tương trong điều kiện thiếu hụt dinh dưỡng nhờ cơ chế

β-phytohormone khởi động được thực hiện theo dạng này [76] Dạng cis hoạt hoá gen

expansin thứ ba bao gồm những nhân tố tiếp nhận kích thích từ môi trường bên ngoài Hầu hết các gen expansin đều chứa ARE - nhân tố điều hoà cảm ứng với sự

kỵ khí hoặc hiếu khí Dạng cis hoạt hoá thứ tư gồm những nhân tố điều hoà hoạt

động chu kỳ sinh học Phân tích vùng điều hoà đã chỉ ra sự đa dạng của các nhân tố

hoạt hoá cis ở siêu họ gen expansin đậu tương; các gen expansin được hoạt hoá

trong nhiều điều kiện khác nhau, trong đó bao gồm những phản ứng đối phó với điều kiện khô hạn [147] Qua đó cho thấy các vai trò chức năng khác nhau của expansin trong một loạt các quá trình phát triển liên quan đến sửa đổi thành tế bào Nghiên cứu của Cosgrove (2000) chỉ ra rằng hàm lượng protein expansin tỷ lệ thuận với sự tăng trưởng của các tế bào, các mô và các cơ quan của thực vật Đặc biệt trong điều kiện khô hạn, sự biểu hiện của gen expansin tăng lên dẫn đến tăng hàm lượng protein trong mô bào [32] Nghiên cứu của Cho và cs (2000) cho thấy, lá

cây Arabidopsis chuyển gen ức chế AtEXP10 (cơ chế antisense) có phiến, cuống và

diện tích lá nhỏ hơn so với cây đối chứng [27] Ở cây thông bị cắt rễ, cùng với sự tăng lên của auxin, mRNA expansin cũng tăng lên khoảng 100 lần [60] Nghiên cứu

của Link và cs (1998) cho thấy có sự sinh trưởng của tế bào nhanh hơn khi xử lý với protein expansin ngoại sinh [82] Ngoài ra, khi xử lý bằng protein expansin phân lập

từ phôi hạt vào mô phân sinh chồi đỉnh nơi hình thành lá mới thì sự hình thành lá diễn ra nhanh hơn [47]

Lee và cs (2003) phân lập được các gen GmEXP1 dài 1089 bp từ mRNA xác

định protein expansin1 ở rễ cây đậu tương (mã số: AF516879) Đoạn mã hoá của

GmEXP1 dài 768 bp xác định chuỗi polypeptide dài 255 amino acid GmEXP1 phân

lập từ DNA tổng số có cấu trúc gồm 3 exon và 2 intron xen kẽ nhau [72] Đối chiếu với hệ thống phân loại và đề xuất danh pháp của Kende và cs (2004) cho thấy, gen

GmEXP1 mà Lee phân lập được ở rễ đậu tương thuộc nhóm α-expansin, dòng gen

số 37 (GmEXPA37), nằm ở đầu mút nhiễm sắc thể số 17 [147] Kiểm tra biểu hiện nhanh bằng 35S_GmEXPB2-GFP trong các tế bào biểu bì hành, Guo và cs (2011)

đã xác định GmEXPB2 làm một protein ngoại bào hoạt động trên vách cellulose của

tế bào Sự biểu hiện của GmEXPB2 tập trung ở rễ bên của đậu tương giữ vai trò chủ

yếu là phát triển kéo dài rễ, đồng thời tăng cường một số quá trình sinh lý trao đổi ion trong điều kiện hạn [48]

Như vậy, có thể thấy siêu họ gen expansin bao gồm rất nhiều gen, hoạt động chức năng chủ yếu ở các vùng mô đang tăng trưởng mạnh trong các giai đoạn phát triển khác nhau Trong số các mô tăng trưởng mạnh liên quan đến hoạt động của gen expansin, chúng tôi quan tâm đến sự tăng trưởng kéo dài bộ rễ của đậu tương trong điều kiện bất lợi phi sinh học là khô hạn

1.2.2.2 Đặc điểm của protein expansin

Protein expansin có mặt ở các mô đang phát triển của nhiều loại thực vật như miền sinh trưởng sau mô phân sinh ngọn, mô phân sinh bên, ở miền sinh trưởng của

rễ, quả đang chín Một số thực vật đã được nghiên cứu chức năng và hoạt động của protein expansin như: cà chua, anh đào, táo tây, đậu răng ngựa, nhãn, thầu dầu, đậu tương và một số loài cây khác Những nghiên cứu về chức năng cho thấy, protein expansin tham gia vào nhiều quá trình phát triển phức tạp như làm mềm quả chín,

sự rụng lá, nảy mầm của hạt, sự phát triển kéo dài của rễ, sự đâm xuyên của ống phấn qua vòi nhuỵ [147]

Căn cứ vào đặc điểm cấu trúc protein, đặc điểm vị trí các amino acid then chốt, căn cứ vào sự phân vùng chức năng và đặc điểm tiến hoá để phân chia protein expansin thành các nhóm khác nhau Năm 1997, Cosgrove dựa trên cơ sở phân tích trình tự tương đồng và thành phần hoá học để chia protein expansin thành hai phân

họ là α và β [30] Những nghiên cứu ngày nay thường phân tích tất cả các trình tự tương đồng gen expansin trên toàn hệ gen của mỗi loài thực vật, từ đó cho thấy sự

tồn tại của một đa họ gen expansin Li (2002) phân tích trên đối tượng Arabidopsis

cho thấy có tới 38 trình tự tương đồng expansin Dựa trên đặc điểm trình tự và đặc điểm cấu trúc mà xếp các protein suy diễn của expansin thành ba phân họ là α, β và

γ Dạng α có vùng chèn alpha, dạng β có vùng chèn beta và dạng γ thì ngắn hơn và không có mặt cả hai vùng chèn trên trong cấu trúc phân tử protein suy diễn [77] Các gen expansin đậu tương mã hoá polypeptide dài từ 218 - 309 amino acid, trọng lượng phân tử từ 23,5 - 33,8kDa Theo Zhu và cs (2014), có tới 65/75 loại protein expansin đều mang chuỗi peptide tín hiệu dài 16 - 31 amino acid Giá trị điểm đẳng điện (pI) dao động từ 4,5 đến 9,8 ở các liên họ protein expansin đậu tương Hầu hết các protein expansin thuộc phân họ EXPA, EXPB và EXLA có giá trị pI cao hơn 7,0; trong khi đó pI của EXLB đều thấp hơn 7,0 [147]

Protein expansin đặc trưng dài 250 - 275 amino acid được phân thành vùng tín hiệu dẫn đầu (dài 20 - 30 amino acid) và hai vùng chức năng I, II (Hình 1.1) còn gọi

là vùng DPBB và Pollen allerg Vùng tín hiệu dẫn đầu của α-expansin1 ở thực vật gồm 20 amino acid [136] giữ vai trò quan trọng trong việc hướng đích cho protein này ra ngoài thành tế bào bằng cách xuất bào [86], [110]

Vùng I tương đồng 30% với vùng xúc tác của họ protein glycoside hydrolase

45 (GH45) Vùng này chứa 9 vị trí cystein bảo thủ và dãy His-Phe-Asp (HFD) hình thành trung tâm phản ứng xúc tác điển hình cho phân họ enzyme endoglucanase

thuộc họ GH45 [31], [32] DPBB của protein GmEXP1 có 91 amino acid (từ vị trí

64 đến 152) là một vùng bảo thủ của Rare Lipoprotein A (RlpA) có hai chuỗi dạng cuộn gấp kiểu beta trong cấu trúc [150]

Vùng II tương đồng 50% với nhóm Pollen allergen 2 (Phlp2) - là vùng gắn kết, bám dính vào cơ chất là các polysaccharide [31] Vùng Pollen allerg của gen

GmEXP1 có 77 amino acid từ vị trí amino acid số 163 đến vị trí amino acid 240

[150] Trên cơ sở phân tích sự có mặt của các amino acid chứa vòng thơm và các

thành phần khác trên bề mặt protein đã xác định vai trò phân vùng II của expansin

là bám dính polysaccharide [31], [108]

Hình 1.1 Cấu trúc protein expansin suy diễn [32]

A: Sơ đồ các thành phần chính của expansin với đầu C tương ứng với Phlp2 và đầu N tương ứng với vùng xúc tác của phân họ 45 - endoglucanase; B: Cấu trúc đầu C với các amino acid vòng

thơm (tryptophan, tyrosine) trên bề mặt giữ vai trò gắn kết vào cơ chất (polysaccharide)

Cấu trúc không gian đặc thù của GmEXPA1 (Hình 1.2A) có bảy vị trí amino

acid then chốt là 56G, 133L, 172L, 184G, 190S, 192T và 196P tương tác với nhau Trong đó, bốn vị trí amino acid then chốt (133L, 184G, 190S và 192T) phân bố trên

bề mặt của protein; 190S và 192T giữ vai trò bám dính polysaccharide (Hình 1.2B)

Vị trí 172L và 196P nằm ở khu vực tiếp giáp giữa hai phân vùng I và II của protein (Hình 1.2C) [147]

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc 3D protein α-expansin1 của đậu tương [147]

A: B ảy amino acid then chốt hình thành cấu hình không gian cho hoạt động chức năng; B: Bốn vị

trí amino acid then chốt trên bề mặt GmEXPA1, trong đó 190S và 192T giữ vai trò bám dính các polysaccharide của vùng II; C: Vị trí hai amino acid quan trọng nằm giữa vùng I và II

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các amino acid ở phân vùng II kém bảo thủ, chứa nhiều sai khác giữa các phân họ expansin hơn vùng I Sự khác nhau này có thể liên quan đến khả năng thích ứng về mặt chức năng [34], [75] Nghiên cứu của Yennawar và cs (2006) chỉ ra rằng, không có sự biến đổi amino acid nào liên quan đến sự phân hoá chức năng được phát hiện ở đầu C - chứng tỏ trình tự đầu C rất bảo thủ Ngược lại, có tới chín amino acid đảm nhiệm vai trò phân hoá chức năng được tìm thấy ở đầu N chứng tỏ vai trò quan trọng của đầu mút này đối với protein expansin Ngoài vai trò là trung tâm xúc tác, đầu N còn đảm nhiệm một số chức năng khác trong tế bào chất được biết đến như giữ tín hiệu đóng gói và vận chuyển hướng đích cho protein [110], [141]

1.2.2.3 Cơ chế tác động kéo dài rễ của expansin

Cấu trúc phân tử thành tế bào thực vật

Ở thực vật, thành tế bào có vai trò quan trọng, nó xác định hình dạng tế bào gắn kết với các tế bào khác tạo cho tế bào có độ bền, cứng rắn Thành tế bào còn hoạt động như một rào cản chống lại các tác nhân gây bệnh Có khoảng 35 loại tế bào thực vật phân biệt nhau ở kích thước, hình dạng, vị trí và đặc điểm thành tế bào [33] Thành tế bào là một lớp mỏng và linh hoạt (0,1 - 1µm); cấu tạo sơ cấp là một mạng lưới bao gồm các vi sợi cellulose được gắn kết bởi hemicellulose và pectin [33], [128]

Hình 1.3 Cấu trúc thành tế bào thực vật [33]

Vi sợi cellulose được tổng hợp bởi phức hệ "hexameric"gồm 6 tiểu phần protein CESA (2α, 2β và 2γ) khảm trên màng sinh chất của tế bào [43] Các chất hợp thành chất nền polysaccharide được tổng hợp từ phức hệ golgi, đóng gói và đưa ra ngoài màng sinh chất (Hình 1.3) Ở hầu hết các loài thực vật, thành phần chủ đạo của hemicellulose là xyloglucan, thành phần chủ đạo của pectin là rhamnogalacturonan I

và homogalacturonan Các thành phần pectin có khả năng thực hiện liên kết hoá trị với nhau và liên kết với xyloglucan bằng các liên kết hoá trị và phi hoá trị [37], [105], [129] Polysaccharide dạng pectin trung tính có khả năng thực hiện liên kết phi hoá trị trên bề mặt các vi sợi cellulose tạo nên mạng lưới vững chắc bao bọc tế bào [148]

Cơ chế kéo giãn thành tế bào thực vật của expansin

Các tế bào thực vật có nguồn gốc từ nhóm tế bào có khả năng phân chia được gọi là mô phân sinh; chúng nằm ở các đỉnh sinh trưởng của rễ, thân và một số cơ quan khác Mô phân sinh bao gồm các tế bào có kích thước nhỏ (khoảng 5 µm) chứa hàm lượng chất nguyên sinh lớn Khi các tế bào được sinh ra từ mô phân sinh, chúng thường phải trải qua các giai đoạn tăng trưởng về kích thước và biệt hoá [32]

Sự tăng trưởng kích thước đòi hỏi tế bào phải nới lỏng mạng lưới vi sợi thành tế bào, quá trình này được điều khiển bởi một loạt các cơ chế phân tử Trong đó sự mở rộng thành tế bào đạt được nhờ phá vỡ tạm thời các liên kết hoá trị và phi hoá trị giữa các thành phần vi sợi kết hợp với sự tăng thể tích không bào trung tâm nhờ tích luỹ các chất hoà tan và hấp thu nước [33] Song song với việc nới rộng thành tế bào

là sự tổng hợp bổ sung các thành phần kiến tạo gồm vi sợi cellulose và các polysaccharide (hemicellulose và pectin) [33], [128]

Những nghiên cứu gần đây đã đưa ra nhiều giả thuyết về cơ chế phân tử liên quan đến sự giãn thành tế bào thực vật như cơ chế tác động của expansin, cơ chế thuỷ phân các gốc hydroxyl, thuỷ phân các polysaccharide [33]

Sự sinh trưởng thành tế bào thực vật thường nhanh hơn khi ở pH thấp gọi là

“pH sinh trưởng” Độ pH sinh trưởng thành tế bào nằm trong khoảng 4,5 đến 6,0 cũng chính là pH kích hoạt protein expansin [103] Thực nghiệm của McQueen-Mason cho thấy, tế bào ngừng tăng trưởng khi bị tách ra khỏi môi trường pH sinh trưởng, xử lý bởi nhiệt độ hoặc protease để loại bỏ hầu hết expansin [89] Theo

nghiên cứu của Cosgrove và cs (2002), có thể bổ sung expansin ngoại sinh để kích thích tế bào và mô sống tăng trưởng [36] Thực hiện phân tích biểu hiện gen ngoại lai và ức chế biểu hiện gen nội sinh expansin bằng cơ chế antisense ở lúa, Choi và

cs (2003) đã chứng minh được chức năng chủ đạo của protein expansin trong việc nới lỏng thành tế bào [28] Theo đó, nếu ức chế sự biểu hiện của gen expansin nội sinh thì quá trình tăng trưởng của tế bào cũng bị ngừng trệ, từ đó khẳng định expansin giống như chất xúc tác sự tăng trưởng, là protein chìa khoá điều chỉnh sự tăng trưởng của tế bào thực vật

Sự sinh trưởng của thành tế bào thực vật bởi hai nguyên nhân cơ bản: thứ nhất,

do áp lực trương của chất nguyên sinh tạo ra, thứ hai là sự nới lỏng của các sợi polymer cấu tạo nên thành tế bào Với sức căng từ 1011 N/m2, sợi cellulose sẽ tự trượt và căng ra, tăng khoảng không gian giữa chúng Sự sinh trưởng thành tế bào xảy ra bởi sự trượt hoặc sắp xếp lại các polymer của chất nền giữ vai trò gắn kết các

vi sợi với nhau [32], [87]

Việc giãn thành tế bào thực vật bao gồm sự vận động và chia tách các vi sợi cenllulose bởi các cơ chế phân tử Nhóm α-expansin có thể nhờ hoạt tính endoglucanase của phân vùng I thúc đẩy sự vận động bằng cách chia tách và thúc đẩy trạng thái trượt lên nhau của các xyloglucan; trong khi nhóm β-expansin được giả thuyết rằng có thể tác động ở những loại polysacharide khác, có thể là xylan [35], [108] Tuy nhiên, chưa có thực nghiệm nào chứng minh được rằng expansin

có tác động thuỷ phân hay tác động theo cơ chế xúc tác kiểu enzyme [75]

Trái với giả thuyết enzyme hay tác động thuỷ phân của expansin làm nới lỏng thành tế bào, McQueen-Mason và cs (1994) đưa ra cơ chế tác động của expansin là bẻ gãy liên kết phi hoá trị của thành tế bào (gồm liên kết hydro và liên kết Van der Waals) kết hợp với áp lực sức trương làm cho polymer trượt trên nhau theo các hướng [88] Nhờ đó khoảng cách giữa các polymer được kéo giãn và thành tế bào được nới lỏng dẫn đến hiệu quả tăng trưởng tế bào Bình thường, expansin chiếm tỷ lệ về khối lượng rất nhỏ trong thành tế bào (thân mầm của dưa leo expansin chiếm tỉ lệ 1:5000) Epansin chỉ hoạt động khi đạt pH sinh trưởng và

có tỷ lệ tối thiểu là 1: 10000 [86]

Tại mô chứa tế bào đang sinh trưởng, expansins biến đổi tính chất vật lý của thành tế bào bằng cách bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa các polysaccharide với các vi sợi cellulose; bẻ gãy liên kết phi hoá trị giữa các thành phần polysaccharide với nhau (gồm pectin và hemicellulose) và làm lỏng lẻo mạng lưới polymer [24] Dưới áp lực cơ học phát sinh từ sức trương nước, khoảng cách giữa các vi sợi thành

tế bào dễ dàng được đẩy giãn theo cả chiều ngang và chiều dọc (Hình 1.4)

Hình 1.4 Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật của expansin [32]

A: Expansin b ẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa glycan với vi sợi cellulose; B: Expansin bẻ gãy các

liên kết hoá trị giữa các polysaccharide với nhau; C: Các vi sợi cellulose dễ dàng trượt và đẩy giãn

khoảng cách dưới áp lực sức trương của tế bào

Vùng chức năng II của expansin giữ vai trò bám polysaccharide giúp protein này có thể dễ dàng di chuyển giữa các vi sợi cellulose của thành tế bào và tiếp xúc

và làm suy yếu các điểm kết dính polymer Điều này tạo thuận lợi cho pha giãn (pha tăng trưởng) của tế bào thực vật dễ dàng thực hiện [32], [33]

Mô hình hoạt động này của expansin phù hợp với sự giãn có giới hạn của thành tế bào và cũng phù hợp với đặc điểm sinh lý sinh trưởng của thành tế bào Sức căng của thành tế bào phải vượt qua mức tối thiểu thì quá trình giãn mới xảy ra Mặc dù expansin không có hoạt tính thuỷ phân nhưng nó tăng cường hoạt tính cho enzyme cellulolase Hoạt động nới lỏng các thành phần của mạng lưới vi sợi giúp cho các hemicellulose trên bề mặt của vi sợi cellulose có thể dễ dàng tiếp xúc với trung tâm hoạt động của enzyme cellulolase [35], [87] Như vậy, expansin còn gián tiếp thúc đẩy sự thuỷ phân các thành phần thành tế bào để đưa đến hiệu quả tăng trưởng kích thước tế bào nhanh chóng

Tác động kéo dài rễ thực vật của expansin

Siêu họ gen expansin với nhiều gen hoạt động riêng trong mỗi mô bào của cơ

thể thực vật, trong đó có một số gen expansin đã được chứng minh về vai trò và sự biểu hiện trong các mô bào miền sinh trưởng của rễ Thực nghiệm của Lee và cs (2003) [72], Guo và cs (2011) [48] và một số nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng, sản phẩm hoạt động của gen expansin tập trung chủ yếu ở các tế bào miền sinh trưởng của rễ cây đậu tương, khan hiếm ở miền trưởng thành của rễ và các cơ quan khác Colmer và cs (2004) sử dụng phép lai tại chỗ với mRNA xác định vị trí hoạt động

của 13 gen expansin ở cây Rumex palustris (thuộc họ Rau răm) cho thấy, 5 gen mã

hoá alpha-expansin hoạt động mạnh ở các tế bào vùng đầu rễ chưa trưởng thành; ngoài ra, sản phẩm mRNA của những gen này có hàm lượng tăng ở miền trưởng thành của rễ chính, nơi khởi sinh hình thành rễ bên [29] Xu và cs (2014) cũng đã chứng minh vai trò quan trọng của expansin đối với sự tăng trưởng kích thước tế

bào dẫn đến sự phát triển kéo dài của bộ rễ ở thực vật trên cây Arabidopsis [138]

Những dẫn liệu từ các thực nghiệm nêu trên cho phép kết luận về vai trò quan trọng của expansin trong việc kéo dài rễ, tạo điều kiện cho thực vật hấp thu được nhiều nước và dinh dưỡng từ các lớp đất sâu

Xác định được bản chất cơ chế phân tử tác động của expansin đối với sự nới lỏng thành tế bào thực vật và biểu hiện đặc hiệu của một số gen thuộc nhóm expansin ở miền sinh trưởng rễ; dựa trên những hiểu biết và tiến bộ của các kỹ thuật chuyển gen mở ra triển vọng lớn trong việc điều khiển sự phát triển kéo dài bộ rễ cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng

1.3 CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG NHỜ A

TUMEFACIENS

1.3.1 Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen ở cây đậu tương thông qua

A tumefaciens

1.3.1.1 Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương thông qua A tumefaciens

Hai nhóm phương pháp được ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp Trong đó, phương pháp chuyển

gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens

đã được ứng dụng phổ biến và thành công đối với cây đậu tương [92], [133], [140]

Chuyển gen gián tiếp là kỹ thuật biến nạp DNA (gen) nhờ nhân tố trung gian

là vi sinh vật, thường dùng vi khuẩn Agrobacterium hoặc virus Trong các kỹ thuật chuyển gen gián tiếp, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

được sử dụng rộng rãi hơn cả bởi vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém và mang lại hiệu quả cao (số copy của gen biến nạp ít - tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn thương tế bào) [4]

Nhiều nghiên cứu cho thấy cây đậu tương dễ mắc bệnh khối u do vi khuẩn

A.tumefaciens gây ra Tác nhân gây bệnh khối u là do Ti-plasmid (Tumor inducing) trong vi khuẩn A.tumefaciens [85] Ti-plasmid được cấu tạo là một phân tử DNA

kép, mạch vòng có kích thước khoảng 200 kb Trên Ti-plasmid có hai phân đoạn DNA quan trọng liên quan trực tiếp đến sự hình thành và phát triển khối u thực vật

là vùng T-DNA và vùng vir Vùng T-DNA có kích thước khoảng 25 kb được giới

hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) là đoạn thâm nhập vào hệ gen tế bào thực vật T-DNA mang các gen tạo khối u như auxin, cytokinin, opine

Vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp T-DNA

vào bộ gen cây chủ và tiêu hoá opine [16] Sản phẩm hoạt động của các gen nằm

trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương

là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2, virC1 Các protein

này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây Hai lá mầm), tác động tạo ra các T-DNA sợi đơn, bao bọc che chở các đoạn T-DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn Dựa trên cơ chế chuyển gen tự nhiên này, T-DNA được cải biến thành phần di truyền, loại bỏ gen độc, bổ sung gen chỉ thị chọn lọc và một số thành phần khác để trở thành vector chuyển gen mong muốn vào thực vật [17]

Trong số các loài gây bệnh ở thực vật, A tumefaciens được coi là một vector

sinh học sử dụng để chuyển gen mong muốn vào cây đậu tương [62] Việc cải biến

di truyền thành phần Ti-plasmid và lựa chọn giống đậu tương phù hợp đã góp phần tăng hiệu suất chuyển gen đậu tương [113]

Hinchee (1988) là người đầu tiên công bố đầu tiên về tái sinh cây đậu tương

biến đổi gen sử dụng A tumefaciens làm sinh vật chuyển gen qua nách lá mầm [52]

Sau đó, những tiến bộ trong kỹ thuật chuyển gen và tái sinh cây đậu tương chuyển gen liên tiếp đạt được thành công Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các mô đích khác nhau để chuyển gen như: phôi mầm đang phát triển [98], lá mầm và hợp tử đang phát triển [140], qua thân mầm [20], qua mô sẹo callus [54] Nhiều tác giả đã thực

hiện phối hợp giữa chuyển gen Agrobacterium và súng bắn vi đạn để gây tổn

thương mô đích tạo điểm xâm nhập cho vi khuẩn [45], [122], [133]

Hiện nay, sự thành công và đưa vào sản xuất cây đậu tương chuyển gen chủ

yếu nhờ sự lây nhiễm bởi A tumefaciens tái tổ hợp thông qua việc gây tổn thương

nách lá mầm hạt chín [44], [97], [99], [140] Nách lá mầm là phần nối giữa lá mầm

và thân mầm Vị trí này chứa các tế bào mầm có khả năng phát sinh chồi và tăng sinh trong môi trường nuôi cấy có cytokinin Việc bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy các chất khử như L-systeine và thiolsex làm tăng hiệu quả chuyển gen từ nách lá mầm đậu tương Các thành phần bổ sung dường như làm ức chế các phản ứng giữa vết thương và vi khuẩn, vì thế làm tăng khả năng biến nạp gen của vi

khuẩn A tumefaciens [96]

Hệ thống chọn lọc sử dụng trong chuyển gen đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và lựa chọn các tế bào, mô biến đổi gen Hầu hết các vector chuyển gen đều được thiết kế hệ thống chọn lọc kèm theo gen đích cho phép sàng lọc các tế bào, mô, hay cây mang gen ở giai đoạn sớm bằng biểu hiện kháng của gen đánh dấu với các chất chọn lọc Các gen chọn lọc có thể là các gen kháng chất kháng sinh, kháng chất diệt cỏ, gen chỉ thị màu hoặc gen chuyển hóa các cơ chất chọn lọc Chất

chọn lọc có thể là kháng sinh như kanamycin (nếu gen chọn lọc sử dụng là gen nptII) hay hygromycin (khi dùng gen hpt) hoặc thuốc diệt cỏ basta (khi dùng gen bar)

Một số nghiên cứu công bố tạo cây đậu tương chuyển gen cho thấy, hiệu suất

chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens thấp hơn so với phương

pháp chuyển gen bằng súng bắn gen qua phôi soma [97], [143] Tuy nhiên, ưu thế của chuyển gen gián tiếp là có thể chuyển được những phân đoạn DNA kích thước lớn, số lượng bản sao (copy) ít, sự di truyền của gen đích ổn định và bền vững ở thế

hệ sau, hệ thống chuyển gen đơn giản dễ thực hiện Vì thế, chuyển gen vào đậu

tương nhờ A tumefaciens đang dần trở nên phổ biến và thu được những thành tựu

đáng kể [92], [140]