nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen gmexp1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (glycine max (l.) merrill)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÒ THANH SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÒ THANH SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Chu Hoàng Mậu 2. PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh THÁI NGUYÊN - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu và PGS. TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí khoa học - công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 01 năm 2015 TÁC GIẢ Lò Thanh Sơn i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Chu Hoàng Mậu, PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Chu Hoàng Hà, TS. Lê Văn Sơn, TS. Phạm Bích Ngọc, TS. Lâm Đại Nhân, TS. Nguyễn Trung Nam, TS. Nguyễn Thị Thuý Hường - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu trong đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ Bộ môn Di truyền&Sinh học hiện đại trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án; cảm ơn sự đóng góp những ý kiến quý báu trong các buổi seminar khoa học, báo cáo chuyên đề và báo cáo tiểu luận tổng quan luận án. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ ADN và ứng dụng và Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, các thầy cô giáo và cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Tây Bắc, chân thành cảm ơn các đồng nghiệp là thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh Hoá - Trường Đại học Tây Bắc đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác. Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 01 năm 2015 TÁC GIẢ Lò Thanh Sơn ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục những chữ viết tắt trong luận án iv Danh mục bảng trong luận án v Danh mục hình trong luận án vi MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 3 4. Những đóng góp mới của luận án 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ THỰC VẬT VÀ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ĐỐI VỚI TÁC ĐỘNG CỦA HẠN 5 1.1.1. Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương 5 1.1.2. Vai trò của bộ rễ ở cây trồng và ở cây đậu tương 7 1.2. GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ Ở THỰC VẬT 12 1.2.1. Một số nghiên cứu về gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ 12 1.2.2. Expansin và cơ chế kéo dài rễ 14 1.3. CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG NHỜ A.TUMEFACIENS 25 1.3.1. Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen ở cây đậu tương thông qua A.tumefaciens 25 1.3.2. Cải thiện khả năng chịu hạn ở cây đậu tương bằng chuyển gen liên quan đến bộ rễ 33 iii Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 38 2.1.1. Vật liệu thực vật 38 2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector 39 2.1.3. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu 39 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 39 2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 39 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu 40 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 40 2.3.1. Phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển bộ rễ 40 2.3.2. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen 42 2.3.3. Phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1 . 44 2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 46 2.3.5. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen 51 2.3.6. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 53 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54 3.1. ĐÁNH GIÁ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NGHIÊN CỨU 54 3.1.1. Sự kéo dài rễ chính của đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo 54 3.1.2. Thể tích bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo 54 3.1.3. Khối lượng khô của bộ rễ đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo 57 3.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG 59 3.2.1. Đặc điểm của gen GmEXP1 (cDNA) phân lập từ một số giống đậu tương 59 3.2.2. Sự đa dạng của trình tự vùng mã hoá gen EXP1 ở một số loài thực vật 67 3.3. PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN GmEXP1 69 3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 70 3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào vector pCB301 tạo vector chuyển gen GmEXP1 72 3.4. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN GmEXP1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ 76 3.4.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây thuốc lá nhờ A.tumefaciens 76 3.4.2. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T 0 78 3.4.3. Phân tích và đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển GmEXP1 trên cây thuốc lá ở thế hệ T 1 . 85 3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG GEN CHUYỂN GmEXP1 95 3.5.1. Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây đậu tương nhờ A.tumefaciens 95 3.5.2. Phân tích các cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T 0 97 Chương 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 100 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 109 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 PHỤ LỤC 128 DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN ABA Abscisic Acid AS Acetylseringone bp base pairs Cặp bazơ nitơ cs Cộng sự CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy Ct Threshold of Cycle Chu kỳ ngưỡng DAB 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride DRE Dehydration Responsive Element Yếu tố điều hoà phản ứng với sự mất nước DREBs Dehydration Responsive Element Binding protein Protein gắn với DRE DREB factor Dehydration Responsive Element Binding - factor Yếu tố gắn với DRE DPBB Double Psi Beta-Barrel structure Vùng cấu trúc DPBB ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Xét nghiệm ELISA EST Expressed Sequence Tag Trình tự đánh dấu biểu hiện ETDA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EXP Expansin Protein expansin EXP1 Expansin 1 Gen expansin 1 FAO Food and Agriculture Organization Tổ chức Nông - Lương thế giới GFP Green Fluorescene Protein Protein phát xạ lưu huỳnh GM Germination Medium Môi trường tái sinh GmEXP1 Glycine max expansin1 gene Gen expansin 1 ở đậu tương GUS β-Glucuronidase iv HRP Horse Radish Peroxidase IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn MCS Multi Cloning Site Vùng cắt gắn đa vị MS Murashige và Skoog, 1962 Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy mô OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp P5CR l-Δ 1 -Pyrroline-5-Carboxylate Reductase P5CS l-Δ 1 -Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ rpm Revolution Per Minute Số vòng/phút RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên mã ngược SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển vào thực vật Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u TMB 3,3’,5,5’-TetraMethyl Benzidine UTR UnTranslated Region Vùng không dịch mã WT Wild Type Kiểu dại X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D- galacto-pyranoside DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN Trang Bảng 2.1. Thống kê một số giống đậu tương địa phương sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 38 Bảng 2.2. Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 39 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với Master Mix 42 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng 43 Bảng 2.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 43 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI 44 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI, NcoI 45 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII 46 Bảng 2.9. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá 48 Bảng 2.10. Một số loại môi trường tái sinh cây đối với giống đậu tương DT84 50 Bảng 2.11. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR 52 Bảng 2.12. Chu trình nhiệt độ của phản ứng Real-time RT-PCR 52 Bảng 3.1. Chiều dài rễ chính của các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn 55 Bảng 3.2. Thể tích bộ rễ các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7 và 9 ngày hạn 55 Bảng 3.3. Khối lượng khô của bộ rễ các giống đậu tương nghiên cứu sau 3, 5, 7, 9 ngày hạn 56 Bảng 3.4. Sự sai khác về trình tự nucleotide trên gen EXP1 của đậu tương SL1 và DT84 67 Bảng 3.5. Thống kê một số trình tự gen EXP1 để phân tích đa dạng di truyền 68 Bảng 3.6. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây thuốc lá mô hình N. tabacum 78 Bảng 3.7. Kết quả phân tích chu kỳ ngưỡng và tỷ lệ biểu hiện của gen GmEXP1 ở các cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T 0 83 v [...]... Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) 2 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ bằng kỹ thuật chuyển gen 2.2 Mục tiêu cụ thể (i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về trình tự nucleotide của. .. từ cây đậu tương (3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ (4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1 Phân tích, so sánh sự phát triển bộ rễ của các dòng cây chuyển gen và cây. .. của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số giống đậu tương địa phương 3 (ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ ở cây đậu tương (iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 biểu hiện sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen (iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên quan đến. .. chiều dài rễ chính, khối lượng khô và thể tích rễ (5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ vào cây đậu tương 4 Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen và biểu hiện gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở cây thuốc lá và cây đậu tương. .. trưởng của cả rễ cọc và rễ bên Kết quả chỉ ra rằng, gen GmEXP1 có vai trò quan trọng trong sự phát triển bộ rễ đậu tương, đặc biệt là trong sự hình thành và kéo dài của cả rễ chính và rễ bên [72] Nghiên cứu của Guo và cs (2011) đã phân lập từ đậu tương và chuyển thành công gen GmEXPB2 vào cây Arabidopsis Các dòng cây chuyển gen có khả năng tăng nhanh sự phân chia tế bào và phát triển kéo dài rễ so với... rễ và thay đổi kích thước bộ rễ [109] Hiểu biết về các cơ chế sinh lý và quá trình điều hoà di truyền của sự thích nghi của bộ rễ dưới điều kiện hạn, xác định các gen đặc hiệu liên quan đến sự phát triển bộ rễ mở ra triển vọng sử dụng cho việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng bằng kỹ thuật chuyển gen 1.2 GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ Ở THỰC VẬT 1.2.1 Một số nghiên cứu về gen liên quan. .. đến sự phát triển kéo dài rễ 3 Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông qua các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ và phân nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ (2) Nghiên cứu thông tin về gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ, thiết kế cặp mồi, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen này... lũy ure ở lá của cây đậu tương và hậu quả này chính là một nhân tố ức chế quá trình hình thành nốt sần [111] 1.1.2 Vai trò của bộ rễ ở cây trồng và ở cây đậu tương 1.1.2.1 Đặc điểm kiến trúc bộ rễ liên quan đến sự hấp thu nước Bộ rễ là một trong những bộ phận quan trọng của cây thực hiện nhiệm vụ lấy nước cung cấp cho các hoạt động sống và phát triển của cơ thể thực vật Ở cây đậu tương, sự thích nghi... quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen GmEXP1 phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84 Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc gen GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây. .. đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của thực vật và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam 5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VAI TRÒ CỦA BỘ RỄ THỰC VẬT VÀ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ĐỐI VỚI TÁC ĐỘNG CỦA HẠN 1.1.1 Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương 1.1.1.1 Cây đậu tương Đậu tương có tên khoa . Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L. ) Merrill) . 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu tổng quát Tạo được dòng cây. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÒ THANH SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L. ) Merrill). nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số giống đậu tương địa phương. 3 (ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ ở cây đậu