5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
1.2.2. Expansin và cơ chế kéo dài rễ
1.2.2.1.Đặc điểm của gen expansin ở thực vật
Expansin là một họprotein tác động chủ chốt trong việc mở rộng của thành tế
bào thực vật. Protein expansin được mã hoá bởi họ đa gen (multi-gene family), xác
định các liên họ protein có tác động nới lỏng thành tế bào thực vật bằng hiệu quả
thay đổi pH màng tế bào. Gen expansin được phân lập đầu tiên từ trụdưới lá mầm
dưa chuột trong nghiên cứu về cơ chế tăng trưởng tế bào thực vật [89]. Gen
expansin sau đó được phát hiện, phân lập và thử nghiệm chức năng sinh học trong những nghiên cứu về cơ chếvươn dài lóng của giống lúa ngoi ở Đông Nam Á [74],
[73], [86]. Gần đây, sốlượng các loại gen expansin được phát hiện ngày càng tăng ở
các loài thực vật như Arabidopsis, lúa, yến mạch, đậu tương, khoai tây, ngô,... [147]. Vai trò của expansin liên quan đến tính chống chịu với các yếu tố bất lợi phi sinh học ở thực vật, trong đó nhiều tác giả đề cập đến là khả năng chịu hạn, điển hình
như Wu và cs (1996, 2001) phân tích biểu hiện khả năng chịu hạn ở ngô [135], [136], Jones và cs (2004) đề cập đến vai trò chống mất nước và bù nước ở cây
Craterostigmaplantagineum [66].
Theo đề xuất danh pháp của Kende và cs (2004), siêu họ gen expansin ở thực vật nói chung có thể chia thành bốn phân họcơ bản dựa trên phân tích đặc điểm cấu trúc và hệ thống phát sinh trình tự nucleotide là: α-expansin (EXPA), β-expansin (EXPB), expansin-like A (EXLA) và expansin-like B (EXLB) [68]. Các protein xác
định bởi gen thuộc nhóm α-expansin và β-expansin có tác động nới lỏng thành tế
bào thực vật trong khi đó, gen thuộc các nhóm expansin-like A và expansin-like B mới chỉ được tìm hiểu về trình tự, chưa có công bố về bằng chứng thực nghiệm vai trò của chúng đối với thành tế bào [108].
Việc giải trình tự hệgen đậu tương hoàn thiện đã làm sáng tỏ hơn về tiến hoá và những đặc điểm khác nhau của siêu họ gen expansin ở loài thực vật này. Phân tích bản đồ phiên mã gen expansin đậu tương ở các mô khác nhau trong điều kiện bình thường cho thấy có nhiều sai khác về sự biểu hiện giữa các phân họ gen [79]. Dựa trên cơ sở nghiên cứu gen expansin ở Arabidopsis, Kende và cs (2004) đã đưa
ra danh pháp hệ thống phân loại expansin của đậu tương gồm 75 gen expansin được phân biệt, định danh và định vị trên nhiễm sắc thể. Ngoại trừ NST số 8 và 16, gen expansin có mặt ở tất cả các NST từ1 đến 20. NST số 17 mang nhiều gen expansin
hơn cả(9 gen); ngược lại NST 7, 9, 13, 15 và 20 mang không quá hai gen [68].
Năm 2014, Zhu sử dụng phần mềm MEGA v5.0 xây dựng cây phân loại với thuật toán NJ phân tích tất cả trình tự gen expansin của đậu tương, Arabidopsis và lúa. Từđó phân chia các gen expansin của đậu tương thành 4 phân họ tương tựnhư
nghiên cứu của Kende. Ngoài ra, ông còn căn cứvào đặc điểm cấu trúc gen (đầu 5’- UTR, các exon - intron, đầu 3’-UTR) để xác lập mối quan hệ tiến hoá. Kết quả là 75 gen expansin từđậu tương được xếp vào 4 phân họ: EXPA gồm 49 gen, EXPB gồm 9 gen; EXLA gồm 2 gen và EXLB có 15 gen. Các gen thuộc cùng phân họ có cấu
trúc exon - intron tương tự nhau. Các gen EXPB và EXLA chứa 4 exon; các gen
EXPA chứa 3 exon và các gen EXLB gồm 5 exon. Phân tích trình tự các gen trong mỗi phân họ cho thấy, các gen ở mỗi phân họtương đối bảo thủ và giữa các phân họ đều biểu hiện đa hình. Mức độ sai khác khá cao của cấu trúc exon - intron trong mỗi phân họgen expansin đậu tương cho thấy, siêu họ gen expansin này chịu áp lực cao của quá trình tiến hoá [108], [147].
Libault và cs (2010) đã định lượng mRNA của đậu tương bằng kỹ thuật Real- time RT-PCR cho thấy các gen expansin hoạt động phiên mã ở mức độ thấp; lượng tích luỹ sản phẩm phiên mã của các gen expansin có sự khác biệt giữa các mô [79].
Ở cây đậu tương có tới 23/75 gen expansin hoạt động thường xuyên trong tất cả các
mô phân tích. Điều đó cho thấy expansin biểu hiện rất phức tạp trong nhiều quá trình phát triển của cây đậu tương. Bản đồ trình tự mRNA cũng thể hiện phần lớn các gen expansin đậu tương biểu hiện phiên mã ở mỗi mô đơn lẻ. Điều đó chỉ ra rằng, mỗi loại gen expansin hoạt động đặc hiệu ở từng loại mô hoặc tế bào riêng rẽ. Khoảng 25% (trong tổng số 75 gen), 20%, 13%, 11% và 7% gen expansin đậu
tương biểu hiện phiên mã mức độ cao lần lượt ở các mô rễ, hạt, vỏ quả, lá, nách lá và hoa [77], [147].
Sự biểu hiện rộng của những gen này cho thấy gen expansin ở đậu tương liên quan đến sự phát triển phức tạp của các mô và các tổ chức cơ thể trong điều kiện bình thường. Trong một sốtrường hợp, sự biểu hiện gen expansin có thể rất đặc biệt và giới hạn ở những mô đơn lẻ hoặc trong từng loại tế bào. Có bảy gen expansin chỉ
biểu hiện ở mô rễ (GmEXPA12, GmEXPA8, GmEXPA2, GmEXLB12, GmEXPA23, GmEXPA29, GmEXPA36 và GmEXPA37); ba gen chỉ biểu hiện ở hạt (GmEXPA7,
GmEXPA14 và GmEXPB5); hai gen chỉ biểu hiện ở hoa (GmEXLB5 và
GmEXPA46); một gen chỉ biểu hiện ở nách lá (GmEXPB6) và một gen chỉ biểu hiện
ở lá (GmEXLB15). Có thể thấy, các gen trong họ expansin tập trung biểu hiện nhiều
ở những mô dưới mặt đất: rễ chính, rễ tơ và chóp rễ [77]. Các gen expansin đậu
tương có độ tương đồng cao về trình tự và có thể giữ chức năng như nhau ở mô. Chẳng hạn GmEXPA2 và GmEXPA12 có trình tựtương đồng cao và chỉ biểu hiện ở
mô rễ nên rất có thể cặp gen này đảm nhiệm cùng chức năng đối với sự phát triển của bộ rễ [147].
Các nghiên cứu chỉ ra rằng cả bốn phân họ gen expansin đậu tương đều biểu hiện khác nhau là do vùng promoter. Các promoter ở vùng trước mã hoá của gen giữ vai trò cốt yếu trong điều hoà biểu hiện của gen ở từng mô, từng giai đoạn phát triển hay trong những môi trường nhất định. Theo đó, đoạn DNA tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gen có cấu trúc gồm hai phần đối xứng nhau được gọi là trình tựcis. Trình tự này nằm ở phần điều hoà của gen, là nơi tiếp nhận tín hiệu điều hoà [147]. Năm 2014, Zhu và cs đã sử dụng phần mềm PlantCARE của Lescot để
phân tích vùng promoter của gen expansin ở đậu tương và phát hiện nhân tố hoạt hoá cis trên DNA dài 1500 bp nằm trước codon khởi động. Có bốn dạng nhân tố
hoạt hoá cisđược phát hiện trên vùng điều hoà của siêu họgen expansin đậu tương.
Dạng cis thứ nhất của vùng điều hoà là nhân tố kích ứng ánh sáng. Dạng cis thứ hai của vùng điều hoà gen expansin là vùng tiếp nhận tín hiệu hormone thực vật. Dạng
cis này hoạt động phụ thuộc tín hiệu từ auxin, gibberellin và salicylic để điều hoà biểu hiện gen expansin ở đậu tương [147]. Sự biểu hiện các gen thuộc phân họ β- expansin ở đậu tương trong điều kiện thiếu hụt dinh dưỡng nhờ cơ chế
phytohormone khởi động được thực hiện theo dạng này [76]. Dạng cis hoạt hoá gen expansin thứ ba bao gồm những nhân tố tiếp nhận kích thích từ môi trường bên ngoài. Hầu hết các gen expansin đều chứa ARE - nhân tốđiều hoà cảm ứng với sự
kỵ khí hoặc hiếu khí. Dạng cis hoạt hoá thứ tư gồm những nhân tố điều hoà hoạt
động chu kỳ sinh học. Phân tích vùng điều hoà đã chỉ ra sựđa dạng của các nhân tố
hoạt hoá cis ở siêu họ gen expansin đậu tương; các gen expansin được hoạt hoá trong nhiều điều kiện khác nhau, trong đó bao gồm những phản ứng đối phó với
điều kiện khô hạn [147]. Qua đó cho thấy các vai trò chức năng khác nhau của expansin trong một loạt các quá trình phát triển liên quan đến sửa đổi thành tế bào.
Nghiên cứu của Cosgrove (2000) chỉ ra rằng hàm lượng protein expansin tỷ lệ
thuận với sự tăng trưởng của các tế bào, các mô và các cơ quan của thực vật. Đặc biệt trong điều kiện khô hạn, sự biểu hiện của gen expansin tăng lên dẫn đến tăng hàm lượng protein trong mô bào [32]. Nghiên cứu của Cho và cs (2000) cho thấy, lá cây Arabidopsis chuyển gen ức chếAtEXP10 (cơ chế antisense) có phiến, cuống và diện tích lá nhỏ hơn so với cây đối chứng [27]. Ở cây thông bị cắt rễ, cùng với sự tăng lên của auxin, mRNA expansin cũng tăng lên khoảng 100 lần [60]. Nghiên cứu
của Link và cs (1998) cho thấy có sựsinh trưởng của tếbào nhanh hơn khi xử lý với protein expansin ngoại sinh [82]. Ngoài ra, khi xử lý bằng protein expansin phân lập từ phôi hạt vào mô phân sinh chồi đỉnh nơi hình thành lá mới thì sự hình thành lá diễn ra nhanh hơn [47].
Lee và cs (2003) phân lập được các gen GmEXP1 dài 1089 bp từ mRNA xác
định protein expansin1 ở rễ cây đậu tương (mã số: AF516879). Đoạn mã hoá của
GmEXP1 dài 768 bp xác định chuỗi polypeptide dài 255 amino acid. GmEXP1 phân lập từ DNA tổng số có cấu trúc gồm 3 exon và 2 intron xen kẽ nhau [72]. Đối chiếu với hệ thống phân loại và đề xuất danh pháp của Kende và cs (2004) cho thấy, gen
GmEXP1 mà Lee phân lập được ở rễđậu tương thuộc nhóm α-expansin, dòng gen số 37 (GmEXPA37), nằm ở đầu mút nhiễm sắc thể số 17 [147]. Kiểm tra biểu hiện nhanh bằng 35S_GmEXPB2-GFP trong các tế bào biểu bì hành, Guo và cs (2011)
đã xác định GmEXPB2 làm một protein ngoại bào hoạt động trên vách cellulose của tế bào. Sự biểu hiện của GmEXPB2 tập trung ở rễ bên của đậu tương giữ vai trò chủ
yếu là phát triển kéo dài rễ, đồng thời tăng cường một số quá trình sinh lý trao đổi ion
trong điều kiện hạn [48].
Như vậy, có thể thấy siêu họ gen expansin bao gồm rất nhiều gen, hoạt động chức năng chủ yếu ở các vùng mô đang tăng trưởng mạnh trong các giai đoạn phát triển khác nhau. Trong số các mô tăng trưởng mạnh liên quan đến hoạt động của
gen expansin, chúng tôi quan tâm đến sự tăng trưởng kéo dài bộ rễ của đậu tương trong điều kiện bất lợi phi sinh học là khô hạn.
1.2.2.2.Đặc điểm của protein expansin
Protein expansin có mặt ở các mô đang phát triển của nhiều loại thực vật như
miền sinh trưởng sau mô phân sinh ngọn, mô phân sinh bên, ở miền sinh trưởng của rễ, quảđang chín... Một số thực vật đã được nghiên cứu chức năng và hoạt động của protein expansin như: cà chua, anh đào, táo tây, đậu răng ngựa, nhãn, thầu dầu, đậu
tương và một số loài cây khác. Những nghiên cứu về chức năng cho thấy, protein expansin tham gia vào nhiều quá trình phát triển phức tạp như làm mềm quả chín, sự rụng lá, nảy mầm của hạt, sự phát triển kéo dài của rễ, sự đâm xuyên của ống phấn qua vòi nhuỵ... [147].
Căn cứ vào đặc điểm cấu trúc protein, đặc điểm vị trí các amino acid then chốt, căn cứ vào sự phân vùng chức năng và đặc điểm tiến hoá để phân chia protein expansin thành các nhóm khác nhau. Năm 1997, Cosgrove dựa trên cơ sở phân tích trình tựtương đồng và thành phần hoá học để chia protein expansin thành hai phân họ là α và β [30]. Những nghiên cứu ngày nay thường phân tích tất cả các trình tự tương đồng gen expansin trên toàn hệ gen của mỗi loài thực vật, từ đó cho thấy sự
tồn tại của một đa họ gen expansin. Li (2002) phân tích trên đối tượng Arabidopsis
cho thấy có tới 38 trình tựtương đồng expansin. Dựa trên đặc điểm trình tự và đặc
điểm cấu trúc mà xếp các protein suy diễn của expansin thành ba phân họ là α, β và
γ. Dạng α có vùng chèn alpha, dạng β có vùng chèn beta và dạng γ thì ngắn hơn và
không có mặt cả hai vùng chèn trên trong cấu trúc phân tử protein suy diễn [77]. Các gen expansin đậu tương mã hoá polypeptide dài từ 218 - 309 amino acid, trọng lượng phân tử từ 23,5 - 33,8kDa. Theo Zhu và cs (2014), có tới 65/75 loại
protein expansin đều mang chuỗi peptide tín hiệu dài 16 - 31 amino acid. Giá trị điểm đẳng điện (pI) dao động từ 4,5 đến 9,8 ở các liên họ protein expansin đậu
tương. Hầu hết các protein expansin thuộc phân họ EXPA, EXPB và EXLA có giá trịpI cao hơn 7,0; trong khi đó pI của EXLB đều thấp hơn 7,0 [147].
Protein expansin đặc trưng dài 250 - 275 amino acid được phân thành vùng tín hiệu dẫn đầu (dài 20 - 30 amino acid) và hai vùng chức năng I, II (Hình 1.1) còn gọi là vùng DPBB và Pollen allerg. Vùng tín hiệu dẫn đầu của α-expansin1 ở thực vật gồm 20 amino acid [136] giữ vai trò quan trọng trong việc hướng đích cho protein
này ra ngoài thành tế bào bằng cách xuất bào [86], [110].
Vùng I tương đồng 30% với vùng xúc tác của họ protein glycoside hydrolase 45 (GH45). Vùng này chứa 9 vị trí cystein bảo thủ và dãy His-Phe-Asp (HFD) hình thành trung tâm phản ứng xúc tác điển hình cho phân họ enzyme endoglucanase thuộc họ GH45 [31], [32]. DPBB của protein GmEXP1 có 91 amino acid (từ vị trí
64 đến 152) là một vùng bảo thủ của Rare Lipoprotein A (RlpA) có hai chuỗi dạng cuộn gấp kiểu beta trong cấu trúc [150].
Vùng II tương đồng 50% với nhóm Pollen allergen 2 (Phlp2) - là vùng gắn kết, bám dính vào cơ chất là các polysaccharide [31]. Vùng Pollen allerg của gen
GmEXP1 có 77 amino acid từ vị trí amino acid số 163 đến vị trí amino acid 240 [150]. Trên cơ sở phân tích sự có mặt của các amino acid chứa vòng thơm và các
thành phần khác trên bề mặt protein đã xác định vai trò phân vùng II của expansin là bám dính polysaccharide [31], [108].
Hình 1.1. Cấu trúc protein expansin suy diễn [32]
A:Sơ đồ các thành phần chính của expansin với đầu C tương ứng với Phlp2 và đầu N tương ứng với vùng xúc tác của phân họ 45 - endoglucanase; B: Cấu trúc đầu C với các amino acid vòng
thơm (tryptophan, tyrosine) trên bề mặt giữ vai trò gắn kết vào cơ chất (polysaccharide)
Cấu trúc không gian đặc thù của GmEXPA1 (Hình 1.2A) có bảy vị trí amino acid then chốt là 56G, 133L, 172L, 184G, 190S, 192T và 196P tương tác với nhau.
Trong đó, bốn vị trí amino acid then chốt (133L, 184G, 190S và 192T) phân bố trên bề mặt của protein; 190S và 192T giữ vai trò bám dính polysaccharide (Hình 1.2B). Vị trí 172L và 196P nằm ở khu vực tiếp giáp giữa hai phân vùng I và II của protein (Hình 1.2C) [147].
Hình 1.2. Mô hình cấu trúc 3D protein α-expansin1 của đậu tương [147]
A: Bảy amino acid then chốt hình thành cấu hình không gian cho hoạt động chức năng; B: Bốn vị
trí amino acid then chốt trên bề mặt GmEXPA1, trong đó 190S và 192T giữ vai trò bám dính các polysaccharide của vùng II; C: Vị trí hai amino acid quan trọng nằm giữa vùng I và II
Nhiều nghiên cứu cho thấy, các amino acid ở phân vùng II kém bảo thủ, chứa nhiều sai khác giữa các phân họexpansin hơn vùng I. Sự khác nhau này có thể liên
quan đến khả năng thích ứng về mặt chức năng [34], [75]. Nghiên cứu của Yennawar và cs (2006) chỉ ra rằng, không có sự biến đổi amino acid nào liên quan
đến sự phân hoá chức năng được phát hiện ởđầu C - chứng tỏ trình tựđầu C rất bảo thủ. Ngược lại, có tới chín amino acid đảm nhiệm vai trò phân hoá chức năng được tìm thấy ở đầu N chứng tỏ vai trò quan trọng của đầu mút này đối với protein expansin. Ngoài vai trò là trung tâm xúc tác, đầu N còn đảm nhiệm một số chức
năng khác trong tế bào chất được biết đến như giữ tín hiệu đóng gói và vận chuyển
hướng đích cho protein [110], [141].
1.2.2.3.Cơ chếtác động kéo dài rễ của expansin
Cấu trúc phân tử thành tế bào thực vật
Ở thực vật, thành tế bào có vai trò quan trọng, nó xác định hình dạng tế bào gắn kết với các tế bào khác tạo cho tếbào có độ bền, cứng rắn. Thành tế bào còn hoạt động
như một rào cản chống lại các tác nhân gây bệnh. Có khoảng 35 loại tế bào thực vật phân biệt nhau ở kích thước, hình dạng, vị trí và đặc điểm thành tế bào [33]. Thành tế
bào là một lớp mỏng và linh hoạt (0,1 - 1µm); cấu tạo sơ cấp là một mạng lưới bao gồm các vi sợi cellulose được gắn kết bởi hemicellulose và pectin [33], [128].