5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
2.3.3. Phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1
Vector chuyển gen GmEXP1 được phát triển theo hai bước cơ bản, được mô tả qua sơ đồ hình 2.2 gồm: (1) Phát triển cấu trúc độc lập mang gen chuyển GmEXP1; (2) Gắn cấu trúc gen GmEXP1 vào vector chuyển gen thực vật pCB301. Gen
GmEXP1 đã phân lập từ giống SL1 được đưa vào thiết kế vector gồm các trình tự xác định chuỗi peptide tín hiệu (SP) và hai vùng chức năng I và II (Hình 2.2).
Hình 2.2. Sơ đồ phát triển vector chuyển gen mang gen GmEXP1
2.3.3.1.Phát triển cấu trúc độc lập mang gen chuyển GmEXP1
Xử lý song song vector tái tổ hợp pBT_GmEXP1 và vector pRTRA7/3 bằng cặp enzyme hạn chế NcoI/NotI tạo các đầu dính tương ứng với thành phần và điều kiện phản ứng mô tảở bảng 2.7. Dựa vào kích thước các phân đoạn DNA, lựa chọn và tinh sạch các băng điện di theo chỉ dẫn của kít GeneJET PCR Purification để thu nhận các thành phần cần cho phát triển vector gồm: gen đích GmEXP1 và vector mở vòng pRTRA7/3.
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI, NcoI
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl) 1 Orange Buffer 10X 2,0 2 NotI 5 u/μl 1,5 3 NcoI 5 u/μl 2,0 4 Plasmid 200 ng/μl 8,0 5 Nước khử ion - 6,5 Tổng 20 Điều kiện phản ứng: 37oC, 4 giờ
Trộn gen GmEXP1 với vector mở vòng pRTRA7/3 sau khi tinh sạch, bổ sung T4 DNA ligase xúc tác cho quá trình gắn nối nhằm tạo được vector trung gian tái tổ hợp pRTRA7/3 mang cấu trúc gen chuyển gồm: CaMV35S_GmEXP1_c-myc_polyA.
Vector tái tổ hợp pRTRA7/3 mang gen chuyển GmEXP1 được nhân dòng trong
E.coliDH5α bằng biến nạp nhờ sốc nhiệt và chọn dòng tái tổ hợp bằng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI (như phần tách dòng gen 2.3.2.3).
2.3.3.2.Gắn cấu trúc gen chuyển GmEXP1 lên vector chuyển gen pCB301
Xử lý đồng thời pRTRA_GmEXP1 và pCB301 với enzyme hạn chế HindIII (bảng 2.8). Dựa vào kích thước các phân đoạn DNA, lựa chọn và tinh sạch các băng điện di theo chỉ dẫn của kít GeneJET PCR Purification để thu nhận các thành phần cần cho phát triển vector gồm: cấu trúc mang gen GmEXP1 khoảng 1,6kb; vector mở vòng pCB301 khoảng 5,5kb. Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl) 1 Red Buffer 10X 2,0 2 HindIII 5 u/μl 2,0 3 Plasmid 200 ng/μl 10,0 4 Nước khử ion - 6,0 Tổng 20 Điều kiện phản ứng: 37oC trong 4 giờ
Trộn cấu trúc gen GmEXP1 tinh sạch với vector pCB301 đã mở vòng, bổ sung T4 DNA ligase xúc tác cho quá trình gắn nối nhằm tạo được vector chuyển gen thực vật pCB301 mang cấu trúc gen GmEXP1.
Vector tái tổ hợp pCB301 mang cấu trúc gen GmEXP1 được nhân dòng trong
E.coliDH5α bằng biến nạp nhờ sốc nhiệt và chọn dòng tái tổ hợp bằng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI (như phần tách dòng gen).