5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
3.5.1.Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào cây đậu tương nhờ
tumefaciens
Hạt đậu tương được khử trùng khô bằng khí Clo trong nồi khử trùng (Hình 3.21A) trong 16 giờ, sau đó cho nảy mầm trong tối trên môi trường GM đến khi nhú chồi mầm thì cắt bỏ rễ mầm, chồi mầm, bỏ vỏ, tách đôi lá mầm để làm vật liệu nhận gen (Hình 3.21B-C). Các mảnh lá mầm được ngâm và gây tổn thương trong dịch huyền phù vi khuẩn 30 - 40 phút để lây nhiễm (Hình 3.21D). Các mẫu sau đó được đưa sang môi trường đồng nuôi cấy 5 ngày trong tối (Hình 3.21E). Sau 5 ngày, mẫu được rửa khuẩn trong SIM lỏng + cefotaxime 500 mg/l và đặt lên môi trường cảm ứng tạo chồi SIM từ 3 - 4 tuần (Hình 3.21F). Khi các mẫu phát sinh cụm chồi gồm các chồi nhỏ, tiến hành cắt bỏ lá mầm và chuyển sang môi trường chọn lọc kéo dài chồi SEM
(Hình 3.21G-H). Các chồi nhỏ sống sót kéo dài trên môi trường SEM có kháng sinh chọn lọc kanamycin (Hình 3.21I) được chuyển sang môi trường ra rễ RM (Hình 3.21J-
K) và sau đó là đem trồng trên giá thể (Hình 3.21L). Cây tái sinh được đưara nhà lưới ngày 12/9/2014 - tương ứng với vụđông trong gieo trồng giống đậu tương DT84.
Tiến hành biến nạp cấu trúc gen GmEXP1 nhờ vi khuẩn A.tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín, sau các giai đoạn nuôi cấy và chọn lọc, kết quảthu được trình bày ở bảng 3.13.
Hình 3.21. Hình ảnh minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây đậu tương chuyển gen A: Khử trùng hạt bằng khí Clo; B: Nảy mầm hạt trên GM tạo nguyên liệu biến nạp; C: Mảnh lá mầm làm nguyên liệu biến nạp; D: Ngâm lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn; E: Mảnh lá mầm
trên môi trường đồng nuôi cấy CCM; F: Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 1; G: Cảm ứng tạo chồi trên SIM lần 2; H - I: Chọn lọc kéo dài chồi trên SEM; J - K: ra rễ; L: ra giá thể
Thí nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào giống đậu tương DT84
34 mẫu có chồi kéo dài trên môi trường kháng sinh chọn lọc SEM, 21 chồi ra rễ
khoẻ mạnh và thu được 9 cây T0 phát triển trên giá thể.
Bảng 3.13. Thống kê sốlượng các mẫu chuyển gen vào cây đậu tương DT84 Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây sống trên giá thể Lần 1 180 50 16 9 4 Lần 2 200 53 18 12 5 ĐC0* 30 0 0 0 0 ĐC1* 30 11 8 6 3
Ghi chú: * ĐC0 lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng
sinh; * ĐC1 lá mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh
Song song với thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn chuyển gen GmEXP1, chúng tôi có bố trí hai lô đối chứng là ĐC0 và ĐC1 (mỗi lô 30 mẫu). Kết quả là lô ĐC0 (lá
mầm đậu tương không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh bổ sung kháng sinh chọn lọc), các lá mầm đều bị đào thải bởi kháng sinh; lô ĐC1 (lá mầm đậu
tương không chuyển gen cấy trên tái sinh không bổ sung kháng sinh chọn lọc) thu
được 3 cây tái sinh không chuyển gen sử dụng làm đối chứng.
Các cây đậu tương T0 tái sinh sau lây nhiễm được trồng, chăm sóc trong nhà lưới khoảng 6 tuần thì tiến hành thu mẫu lá để kiểm tra sự có mặt và hoạt động của gen chuyển GmEXP1.