5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
2.3.2.Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen
2.3.2.1.Thiết kế cặp mồi PCR nhân gen
Căn cứ thông tin về trình tự nucleotide của gen GmEXP1 mang mã số
AF518679 trên Ngân hàng gen quốc tế, cặp mồi SoyExp1R_NcoI/SoyExp1F_NotI
đã được thiết kế với các thuộc tính đã được mặc định của chương trình DNAStar.
2.3.2.2.Phân lập gen
Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số từ các mẫu được tách bằng dung dịch đệm với CTAB, EDTA và
β-Mercapto Ethanol tiến hành theo phương pháp của Murray và cs (1980) [91].
Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA
Sử dụng bộ kít Trizol Reagents (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu nghiên cứu theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Sử dụng bộ kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis của hãng Fermantas để
tổng hợp cDNA từ RNA tổng sốđã tách chiết theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Kỹ thuật PCR khuếch đại gen GmEXP1
Gen GmEXP1 được khuếch đại từ DNA hoặc cDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế. Thành phần phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với Master Mix
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)
1 PCR Master Mix 2X 12,5
2 SoyExp1F_NcoI 10 pmol/l 1,0
3 SoyExp1R_NotI 10 pmol/l 1,0
4 DNA hoặc cDNA khuôn 500 ng/l 2,0
5 Nước khử ion - 8,5
Tổng thể tích 25
Chu trình nhiệt và thời gian của phản ứng PCR khuếch đại gen GmEXP1: Biến tính khởi động ở 94oC trong 5 phút; (biến tính ở 94oC trong 40 giây; gắn mồi ở
56oC trong 30 giây; tổng hợp kéo dài ở 72oC trong 45 giây) × 30 chu kỳ; ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút; bảo quản ở 4oC.
2.3.2.3.Tách dòng gen GmEXP1 và xác định trình tự nucleotide
Kỹ thuật tách dòng gen được thực hiện theo Sambrook và cs [107] với các
bước cơ bản sau:
Tinh sạch gen đích
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kít GeneJET PCR Purification của hãng Fermentas theo quy trình chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Gắn đoạn DNA vào vector tách dòng pBT
Sản phẩm tinh sạch PCR được gắn vào vector pBT để tạo plasmid tái tổ hợp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mang đoạn DNA quan tâm với thành phần và điều kiện phản ứng mô tảở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
1 T4 DNA Ligase Buffer 10X 2,0
2 T4 DNA Ligase 5 u/μl 1,0 3 GmEXP1 100 ng/μl 12,0 4 pBT 100 ng/μl 3,0 5 Nước khử ion - 2,0 Tổng 20 Điều kiện phản ứng: 20oC trong 3 giờ
Biến nạp vector tách dòng tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Duy trì hỗn hợp gồm 5 µl vector tái tổ hợp và 50 µl dịch tế bào khả biến trong
nước đá 20 phút,sau đó chuyển ngay vào bể ổn nhiệt ở 42oC trong thời gian 1 phút 30 giây rồi đưa ngay vào nước đá trong thời gian 10 phút. Sau khi sốc nhiệt bổ sung 150 - 300 µl LB lỏng để nuôi phục hồi ở 37oC, lắc 200 rpm trong vòng 1 giờ. Cấy trải 150 - 250 µl dịch khuẩn lên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, X-gal 30 mg/l và IPTG 100 µM rồi nuôi ở 37oC trong vòng 16 giờ.
Bảng 2.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường Thành phần
LB lỏng Bacto pepton 10 g/l + Nacl 10 g/l + Yeast Extract 5 g/l, pH = 7
Sàng lọc các dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR
Dùng tăm tre khử trùng chấm những khuẩn lạc có khả năng mang plasmid tái tổ hợp gen GmEXP1, hoà ngay vào 5 µl nước khử ion - dung dịch này dùng làm DNA khuôn cho phản ứng colony-PCR. Cặp mồi sử dụng cho phản ứng có thể dùng cặp mồi đặc hiệu SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI hoặc dùng cặp mồi pUC18F/pUC18R. Thành phần phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt độ được thực hiện
như phản ứng PCR cơ bản đã được mô tả trong phần 2.3.2.2.
Tách chiết plasmid
Tách chiết plasmid bằng kít Plasmid Extraction theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Cắt kiểm tra gen GmEXP1 trên plasmid tái tổ hợp bằng BamHI
Xác định sự có mặt của gen GmEXP1 bằng cách sử dụng enzyme hạn chế
BamHI với thành phần phản ứng như bảng 2.6, điều kiện phản ứng: 37oC, 4 giờ. Sản phẩm cắt được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8%.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (μl) 1 BamHI Buffer 10X 1 2 BamHI 5 u/μl 1 3 Plasmid 200 ng/μl 5 4 Nước khử ion - 3 Tổng 10 Xác định trình tự nucleotide
Các plasmid tái tổ hợp mang gen GmEXP1 được xác định trình tự trên máy
đọc trình tự nucleotide tựđộng ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.