5. Ý nghĩa khoa học và thực ti ễn của đề tài luận án
2.3.5.Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen
2.3.5.1.Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR
Tách chiết DNA tổng số từ lá cây chuyển gen và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI để xác định sự có mặt của gen
GmEXP1. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.3.5.2.Phân tích cây chuyển gen bằng RT-PCR
Tách chiết RNA tổng số từ lá cây chuyển gen bằng kít Trizol Reagents; tổng hợp cDNA bằng kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis; thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI để khuếch đại cDNA gen đích
nhằm xác định sản phẩm phiên mã của gen chuyển. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
2.3.5.3.Phân tích cây chuyển gen bằng Real-time RT-PCR
Mức độ phiên mã của gen GmEXP1 ngoại lai được xác định bằng phản ứng Real-time RT-PCR với chất màu gắn huỳnh quang SYBR Green I của hãng Roche và house - keeping gene actin. Quy trình gồm các bước cơ bản sau: (1) Tách chiết RNA tổng sốở các mẫu theo kít Trizol Reagents; (2) Định lượng 1000ng RNA tổng số/mẫu bằng máy NanoDrop đưa vào phản ứng tổng hợp cDNA theo kít Maxima®
First Strand cDNA Synthesis; (3) Thực hiện phản ứng trên máy Real-time RT-PCR của hãng Roche (LightCycler®480) với thành phần ở bảng 2.11 theo chu trình nhiệt
các bước ở bảng 2.12; (4) Tính toán xác định kết quả dựa vào phương pháp 2-∆∆Ct của Livak [83] định lượng số bản sao cho gen đích (Tg, target gene) và gen tham
chiếu (Ref- reference gene).
Bảng 2.11. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR
Thành phần Nồng độ Thể tích (l)
Master mix for Real-time 2X 12,5
Primer F 10 pmol/l 0,5
Primer R 10 pmol/l 0,5
cDNA 500 ng/l 2,0
Nước khử ion - 4,5
Tổng thể tích: 20
Bảng 2.12. Chu trình nhiệt độ của phản ứng Real-time RT-PCR
Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian Tốc độ thay đổi nhiệt (oC /s)
Biến tính: (1 chu kỳ) 95 10 phút 20 Khuếch đại và định lượng: (45 chu kỳ) 95 10 giây 20 58 10 giây 20 72 20 giây 20 Phân tích nhiệt độ chảy: (1 chu kỳ) 95 0 giây 20 65 1 phút 20 95 0 giây 0,1 Kết thúc: (1 chu kỳ) 40 30 giây 20
2.3.5.4.Phân tích cây chuyển gen bằng Western blot
Kiểm tra hoạt động của gen chuyển qua sự có mặt của protein expansin1 bằng Western blot với các bước cơ bản sau: (1) Tách chiết protein tổng số (nghiền 0,5 g
lá trong nitơ lỏng và hoà tan trong 1ml PBS + Tween 0,05%, ly tâm 13000 rpm, 15 phút); (2) Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide - SDS 10%; (3) Chuyển
protein trên gel điện di lên màng lai nitrocellulose bằng máy Pierce G2 Fast Blotter (25V, 1,3 mA trong 20 phút); (4) Màng chứa kháng nguyên c-myc được phủ bằng 5% sữa tách béo pha trong dung dịch PBS + Tween 0,05% trong 16 giờ; (5) Lai
kháng thể 1(ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS 5% sữa tách béo có chứa kháng thể c-myc với độ pha loãng 700 lần, lắc trong 3 giờ ở nhiệt độ phòng); (6) Lai kháng thể 2 (ngâm màng trong 15 ml dung dịch PBS + 5% sữa tách béo có chứa kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horse Radish Peroxidase) trong 2 giờ); (7) Hiện màu trong dung dịch có chứa cơ chất TMB (3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine) hoặc DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride), hiển thị kết quả dưới ánh
sáng thường.
2.3.5.5.Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen GmEXP1 trên cây chuyển gen
Hạt của cây chuyển gen được gieo trên môi trường MS có kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l. Những hạt nảy mầm đến giai đoạn 2 lá thật được chuyển sang trồng trên hệ thống chậu cát vàng. Khi cây con đạt 3 - 4 lá thật thì bắt đầu đánh giá
khả năng phát triển bộ rễqua các giai đoạn 3, 5, 7 và 9 ngày gây hạn nhân tạo như (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mô tảở phần 2.3.1 của luận án.