Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

Header Page of 148 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÒ THANH SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Footer Page of 148 Header Page of 148 Công trình hoàn thành Bộ môn Di truyền học & Sinh học đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TS Chu Hoàng Mậu PGS TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Họp trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Vào hồi , ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiều luận án Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên, Thư viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên Thư viện Quốc gia Việt Nam Footer Page of 148 Header Page of 148 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Lo Thanh Son, Le Van Son, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang Mau (2014), “Cloning and Designing Vector Carrying GmEXP1 Gene Isolated from Local Soybean Cultivar Sonla, Vietnam”, International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), (3), pp.191 - 194 Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Tách dòng, thiết kế vector chuyển gen GmEXP1 vào thuốc Nicotinana tabacum”, Tạp chí Khoa học Tự nhiên Công nghệ ĐHQGHN, 29(4), tr.44 - 52 Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Nghiên cứu đặc điểm gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ phân lập từ số giống đậu tương địa phương Sơn La (Glycine max (L.) Merrill)”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 1, tr.192 - 196 Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Bùi Thị Doan, Lò Thanh Sơn, Chu Hoàng Mậu (2014), “So sánh trình tự gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ phân lập từ mRNA hai mẫu đậu tương địa phương Bắc Kạn Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 118(4), tr.129 - 134 Các trình tự gen đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Accession number of GmEXP1_cDNA: HG799004, HG799005, HG799006, HG799007, HG799008, HG799009, HG799010, LN681352, LN681353 Accession number of GmEXP1_DNA: LM651915, LM651916 Footer Page of 148 -1- Header Page of 148 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) loại trồng chiến lược nhiều quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô lúa mì Đậu tương có giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế Hạt có hàm lượng protein cao, chứa nhiều amino acid không thay vitamin cần thiết cho thể người động vật Thân để lại đất nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần vi khuẩn Rhizobium cộng sinh có khả cố định đạm giúp cải tạo độ phì sử dụng bền vững nguồn tài nguyên đất Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu gây khó khăn lớn cho sản xuất nông nghiệp nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ thu hẹp diện tích sản suất nông nghiệp Việt Nam có khoảng 75% diện tích đồi núi, đất dốc nên thường xuyên khan nguồn nước gây khó khăn cho canh tác nhiều loại trồng, có đậu tương Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, khả thích ứng rộng, bố trí phù hợp với nhiều cấu trồng sản xuất, lại thuộc nhóm trồng chịu hạn Khô hạn có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển tất giai đoạn đậu tương Thiếu nước giai đoạn trước hoa nở làm giảm tới 40% suất hạt đậu tương so với ảnh hưởng hạn giai đoạn sau nở hoa Chính chọn tạo giống đậu tương có khả chịu hạn tốt vấn đề cấp thiết mang tính thời giới cũng Việt Nam Trong điều kiện khô hạn, điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào phát triển mạnh rễ sẽ giúp thu nhiều nước từ lớp đất sâu, đảm bảo trình sinh trưởng phát triển bình thường thực vật Thực vật có rễ phát triển kéo dài, khả đâm xuyên tốt, vươn tới lớp đất sâu sẽ có hội thu nhận nhiều nước điều kiện khô hạn Đồng thời, điều chỉnh thẩm thấu tế bào chóp rễ chế tích luỹ chất khô, tăng cường kênh vận chuyển tích cực, tăng cường hô hấp trao đổi ion cũng giúp thực vật dễ dàng lấy lượng nước ỏi đất Mặt khác, điều kiện hạn, thực vật có loạt phản ứng kết hợp để tăng cường khả chống chịu với điều kiện hạn điều chỉnh đóng mở khí khổng, giảm thoát thoát nước, tăng cường tích nước tế bào… Trong loạt phản ứng nói thực vật Footer Page of 148 -2- Header Page of 148 điều kiện khô hạn môi trường việc nghiên cứu tác động vào phát triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc số lượng rễ bên xem biện pháp hữu hiệu việc cải thiện khả chịu hạn đậu tương Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn trồng xem giải pháp quan trọng tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu Hướng tiếp cận nghiên cứu cải thiện phát triển rễ đậu tương quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm ứng dụng công nghệ sinh học đại, công nghệ gen coi biện pháp có hiệu nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương có khả chịu hạn cao Từ lý thực đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmEXP1 liên quan đến phát triển rễ đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát Tạo dòng chịu hạn mang cấu trúc gen chuyển liên quan đến kéo dài rễ phân lập từ đậu tương kỹ thuật chuyển gen 2.2 Mục tiêu cụ thể (i) Xác định khác biệt phát triển rễ sai khác trình tự nucleotide gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ số giống đậu tương địa phương (ii) Phát triển vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ đậu tương (iii) Tạo dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1 biểu kéo dài rễ cao so với đối chứng không chuyển gen (iv) Tạo dòng đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên quan đến phát triển kéo dài rễ Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu so sánh phát triển rễ số giống đậu tương thông qua tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô rễ phân nhóm giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển rễ (2) Nghiên cứu thông tin gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ, thiết kế cặp mồi, khuếch đại, tách dòng xác định trình tự gen từ đậu tương Footer Page of 148 -3- Header Page of 148 (3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ (4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ vào thuốc thông qua A.tumefaciens Phân tích biểu gen chuyển thuốc chuyển gen hệ T T1 Phân tích, so sánh phát triển rễ dòng chuyển gen đối chứng hệ T1 phương diện chiều dài rễ chính, khối lượng khô thể tích rễ (5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ vào đậu tương Những đóng góp luận án Luận án công trình Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen biểu gen GmEXP1 liên quan đến phát triển rễ thuốc đậu tương Việt Nam Ứng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR Western blot đánh giá mức độ biểu gen chuyển chuyển gen bước đầu tạo dòng đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 Kết đạt luận án có giá trị khoa học thực tiễn cao tiếp cận nghiên cứu tạo dòng chịu hạn theo hướng cải thiện phát triển rễ kỹ thuật chuyển gen thực vật Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Về mặt khoa học Kết nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc gen GmEXP1 phân lập từ đậu tương SL1, DT84 Cơ sở khoa học hiệu kỹ thuật chuyển gen việc cải thiện đặc tính chịu hạn trồng khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc gen GmEXP1 tạo dòng thuốc chuyển gen có rễ phát triển tốt so với đối chứng Kết bước đầu tạo đậu tương chuyển gen mở hướng nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen cải thiện khả chịu hạn đậu tương Việt Nam Các báo đăng tải tạp chí khoa học công nghệ quốc tế nước với trình tự gen công bố Ngân hàng Gen quốc tế tư liệu có giá trị tham khảo nghiên cứu giảng dạy Footer Page of 148 -4- Header Page of 148 Về mặt thực tiễn Các dòng thuốc chuyển gen tạo có rễ phát triển tốt so với đối chứng góp phần giải vấn đề cụ thể việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen cải thiện khả kéo dài rễ đậu tương trồng khác nhằm nâng cao khả chống chịu hạn Kết thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến phát triển rễ, tạo chuyển gen thuốc đậu tương kết bước đầu cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen cải thiện khả chịu hạn thực vật mở triển vọng ứng dụng thực tiễn chọn giống trồng chịu hạn Việt Nam Cấu trúc luận án: Luận án có 127 trang (kể tài liệu tham khảo) chia thành chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (33 trang), Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (16 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (46 trang); Chương 4: Thảo luận chung kết nghiên cứu (09 trang); Kết luận đề nghị (01 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (02 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (8 trang) Luận án có 25 bảng, 31 hình tham khảo 150 tài liệu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo 18 tài liệu tiếng Việt; 130 tài liệu tiếng Anh tài liệu từ internet để tổng kết nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Vai trò rễ thực vật đậu tương tác động hạn; (2) Một số gen liên quan đến phát triển rễ thực vật đậu tương; (3) Chuyển gen liên quan đến hoạt động rễ đậu tương nhờ A tumefaciens Bộ rễ thực vật giữ vai trò quan trọng, quan hấp thu nước chủ yếu cung cấp cho hoạt động sống tế bào thể Những có rễ phát triển kéo dài, đâm xuyên sâu lan toả rộng sẽ có nhiều hội thu nhận nước dinh dưỡng dễ dàng vượt qua điều kiện khô hạn (Huck cs, 1983) Sự phát triển rễ thực vật đậu tương quy định nhiều gen liên quan đến đặc điểm hình thái, sinh trưởng phát triển, trao đổi chất (Taylor cs, 1978; Uga cs, 2013) Cho đến nay, gen chìa khoá xác định phát triển kéo dài rễ chưa tìm Ở Footer Page of 148 -5- Header Page of 148 đậu tương, gen EXP1 xác định protein expansin hoạt động chủ yếu vùng sinh trưởng rễ rễ bên cho có liên quan đến hoạt động phát triển kéo dài rễ (McQueen-Mason cs, 1994; Choi cs, 2003; Lee cs, 2003) Protein expansin liên họ bao gồm phân họ α-expansin (EXPA), β-expansin (EXPB), expansin-like A (EXLA) expansin-like B (EXLB) có tác động kéo giãn, nới lỏng thành tế bào thực vật Protein expansin mã hoá đa họ gen (multi-gene family) phát nhiều thực vật lúa, yến mạch, đậu tương, ngô, khoai tây Riêng đậu tương có tới 75 gen EXP khác nằm 18 cặp NST tương đồng, gen GmEXP1 thuộc NST số 17 có kích thước 1491 bp gồm exon intron xen kẽ Trình tự mã hoá gen GmEXP1 dài 768 bp xác định protein α-expansin gồm 255 amino acid (Kende cs, 2004; Zhu cs, 2014) Protein tương ứng gồm vùng: vùng tín hiệu dẫn đầu; vùng chức DPBB xúc tác dạng enzyme endoglucanase vùng Pollen allerg bám dính chất (Wu cs, 2001) Khi thành tế bào đạt "pH sinh trưởng" = 4,5 - 6,0 tỷ lệ khối lượng expansin với thành tế bào đạt : 10.000 expansin gây biến đổi cấu trúc mạng lưới thành tế bào cách len lỏi, bẻ gãy liên kết phi hoá trị thành phần polysaccharide với (gồm pectin hemicellulose) làm lỏng lẻo mạng lưới polymer Áp lực sức trương tế bào làm khoảng cách vi sợi mở rộng theo chiều ngang chiều dọc (Cosgrove cs 2000, 2005) Hình 1.4 Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật expansin (theo Cosgrove - 2000) A: Expansin bẻ gãy liên kết phi hoá trị glycan với vi sợi cellulose; B: Expansin bẻ gãy liên kết hoá trị polysaccharide với nhau; C: Các vi sợi cellulose dễ dàng trượt đẩy giãn khoảng cách áp lực sức trương tế bào Ngoài tác động trực tiếp giãn thành tế bào, expansin gây hiệu gián tiếp tạo khoảng trống cho cellulolase tiếp xúc với chất, đẩy nhanh hiệu tăng kích thước tế bào Một số thực nghiệm chứng minh hoạt động phân bố expansin tế bào mô thuộc vùng sinh trưởng rễ đậu tương cho thấy Footer Page of 148 -6- Header Page of 148 vai trò quan trọng expansin việc kéo dài rễ, tạo điều kiện cho thực vật hấp thu nhiều nước dinh dưỡng từ lớp đất sâu (Cosgrove cs 1998) Những tiến kỹ thuật chuyển gen thực vật nhờ A tumefaciens mở khả tạo đậu tương chuyển gen GmEXP1 cải tiến phát triển kéo dài rễ nhằm cải thiện khả chịu hạn Sự tiến thể khâu: hoàn thiện quy trình tái sinh; chọn lọc hiệu gen thị, gen sàng lọc; ứng dụng thành công có hiệu kỹ thuật phân tử phân tích thể chuyển gen PCR, Real-time RT-PCR, Western blot; đánh giá xác biểu chức sinh học gen chuyển Nhờ đó, Việt Nam Thế giới đạt thành tựu chuyển gen đậu tương đáng khích lệ (Zhang 2010; Li 2013; de Paiva Rolla 2014; Trần Thị Cúc Hoà 2007; Nguyễn Thị Thuý Hường 2011; Nguyễn Thu Hiền 2014; Lò Thị Mai Thu 2014 ) Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Sáu giống đậu tương địa phương Sơn La Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực & Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam giống đậu tương DT84 Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam cung cấp dùng làm vật liệu đánh giá rễ nghiên cứu đặc điểm gen Hai giống đậu tương địa phương Bắc Kạn Vĩnh Phúc sử dụng làm vật liệu bổ sung tách dòng, xác định trình tự nucleotide phân tích đa dạng trình tự gen GmEXP1 Giống thuốc Nicotinana tabacum K326 Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Việt Nam cung cấp Các chủng vi khuẩn loại vector sử dụng đề tài luận án cung cấp Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam gồm: Escherichia coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens CV58; vector pBT tách dòng gen, vector pRTRA7/3, vector pCB301 2.2 Hoá chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu Hoá chất, KIT mua hãng tiếng Thế giới BioNeer, Fermentas, Invitrogen ; Các thí nghiệm thực từ tháng 02 năm 2012, thí nghiệm sinh lý đánh giá phát triển rễ kiểm tra chức sinh học gen chuyển tiến hành phòng thí nghiệm khoa Sinh Hoá - trường Đại học Tây Bắc Các thí nghiệm phân lập gen, thiết kế vector, Footer Page of 148 -7- Header Page 10 of 148 chuyển gen phân tích chuyển gen tiến hành phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Công trình hoàn thành Bộ môn Di truyền Sinh học đại, Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 2.3 Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm tiến hành theo sơ đồ tổng quát mô tả hình 2.1 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát Luận án sử dụng phương pháp nghiên cứu chia thành nhóm chính: (1) nhóm phương pháp sinh lý đánh giá phát triển rễ, (2) nhóm phương pháp phân lập, tách dòng xác định trình tự gen, (3) nhóm phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1, (4) nhóm phương pháp tạo chuyển gen, (5) nhóm phương pháp phân tích chuyển gen (6) phân tích, xử lý số liệu 2.3.1 Nhóm phương pháp sinh lý đánh giá phát triển rễ Các giống đậu tương, dòng thuốc nghiên cứu gây hạn hệ thống thí nghiệm gây hạn nhân tạo (thực theo Lê Trần Bình cộng 1998) sau nảy mầm đạt thật Mỗi giống/dòng bố trí song song lô thí nghiệm (lặp lại lần) lô đối chứng, lô 10 cây/1 giai Footer Page 10 of 148 - 10 - Header Page 13 of 148 Hình 3.1 Mối quan hệ giữa các giống đậu tương nghiên cứu dựa dữ liệu về phát triển rễ điều kiện gây hạn nhân tạo Dựa biểu tính trạng rễ đánh giá chương trình NTSYSpc 2.1, sơ đồ hình mối quan hệ giống đậu tương nghiên cứu thiết lập (hình 3.1) Bảy giống đậu tương nghiên cứu phân thành ba nhóm: nhánh I có giống SL1, có rễ phát triển mạnh nhất; nhóm II gồm có giống SL6, SL4 có rễ phát triển khá; nhóm III gồm giống SL2, SL3, SL5 DT84 nhóm có rễ phát triển nhất, giống DT84 có khoảng cách di truyền xa so với giống SL1 (10,47%) SL1 (giống địa phương Phù Yên - Sơn La) giống có rễ phát triển tốt phương diện đánh giá dùng làm vật liệu cung cấp gen GmEXP1; giống DT84 có rễ phát triển làm đối tượng tiếp nhận gen chuyển 3.2 ĐẶC ĐIỂM GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG 3.2.1 Đặc điểm gen GmEXP1 phân lập từ cDNA số giống đậu tương 3.2.1.1 Tách dòng cDNA xác định trình tự gen GmEXP1 Cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI thiết kế dựa trình tự gen GmEXP1 đậu tương AF516879 công bố Ngân hàng gen quốc tế để nhân phân lập gen GmEXP1 từ mẫu nghiên cứu; đồng thời mang trình tự chứa điểm cắt giới hạn enzyme NcoI/NotI phục vụ phát triển vector Sản phẩm PCR khuếch đại gen GmEXP1 từ cDNA kiểm tra gel agarose nhận băng DNA kích thước khoảng 0,79kb phù hợp với kích thước dự đoán thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.2-A) Gen GmEXP1 tách dòng với bước: gắn vào vector pBT; biến nạp vào E.coli DH5α sốc nhiệt; colony PCR chọn dòng mang gen đích tái tổ hợp cặp mồi pUC18_F/pUC18_R (Hình 3.2-B) Trước đọc trình tự, plasmid tái tổ hợp gen GmEXP1 cắt kiểm tra BamHI cho kết dương tính 7/7 mẫu thử Việc giải trình tự máy tự động thực lặp lại lần/mẫu Footer Page 13 of 148 - 11 - Header Page 14 of 148 A B Hình 3.2 Kết điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân gen GmEXP1 colony-PCR chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp - 6: giống đậu tương Sơn La; 7: giống DT84; 15 - 28: sản phẩm colony-PCR từ số dòng khuẩn lạc cặp mồi pUC18; (+): đối chứng dương PCR từ cDNA_GmEXP1 với cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI; M: thang chuẩn DNA 1kb Kết phân tích cho thấy, gen GmEXP1 phân lập từ cDNA giống đậu tương nghiên cứu có kích thước 768 bp tương đồng với trình tự công bố AF516879 từ 99,3 - 99,7% Như vậy, gen GmEXP1 phân lập thành công từ cDNA giống đậu tương nghiên cứu 3.2.1.2 So sánh trình tự nucleotide vùng mã hoá gen GmEXP1 So sánh trình tự nucleotide gen GmEXP1 giống SL1 DT84 với trình tự nucleotide mang mã số AF516879 cho thấy có vị trí sai khác (93, 258, 360, 594 722) có sai khác vị trí 722 dẫn đến thay đổi amino acid Mức độ tương đồng trình tự amino acid suy diễn protein expansin1 giống SL DT84 so với trình tự AF516879 đạt 99,3-99,7% Trình tự gen GmEXP1 đậu tương Bắc Kạn Vĩnh Phúc tương đồng với giống SL từ 99,4 - 100%; protein suy diễn giống Bắc Kạn khác các giống nghiên cứu amino acid vị trí 212 chứng tỏ bảo thủ, bền vững gen GmEXP1 tiến hoá chọn lọc dù khác khu vực phân bố 3.2.1.3 Phân tích đặc điểm gen GmEXP1 phân lập từ DNA tổng số So sánh trình tự gen GmEXP1 phân lập từ DNA tổng số với trình tự phân lập từ cDNA cho thấy, GmEXP1 hệ gen dài 1491 bp gồm exon intron xen kẽ Tổng chiều dài exon 768 bp mã hoá 255 amino acid Trình tự DNA gen GmEXP1 hai giống SL1 DT84 có điểm sai khác, gồm sai khác intron sai khác exon 3.2.2 Sự đa dạng trình tự vùng mã hoá gen EXP1 thực vật So sánh trình tự nucleotide vùng mã hoá đoạn gen EXP1 giống đậu tương nghiên cứu với 10 loài thực vật khác có mã số đăng ký NCBI Các Footer Page 14 of 148 - 12 - Header Page 15 of 148 giống đậu tương nghiên cứu có độ tương đồng với số trình tự gen GmEXP1 NCBI dao động từ 83,5 - 99,7%; gần giống đậu tương Hàn Quốc (AF516879) xa đậu tương Trung Quốc (JF694991) Hình 3.5 Sơ đồ hình thể khác biệt di truyền về trình tự nucleotide đoạn mã hoá gen EXP1 số loài thực vật Tỷ lệ tương đồng đoạn mã hoá gen EXP1 giống đậu tương nghiên cứu loại thực vật khác dao động khoảng 45,1 đến 92,6%, đó, gần đậu cove XM_007160571 (tương đồng 92,4 - 92,6%); xa lê dại KC855735 (tương đồng 45,1 - 45,2%) Các đối tượng thực vật nghiên cứu phân thành nhóm chính, nhóm I gồm 12 trình tự nhóm II có trình tự; khoảng cách di truyền hai nhóm 49,7% 3.3 PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN GmEXP1 3.3.1 Tạo cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 Cấu trúc chứa gen đích GmEXP1 gồm thành phần: CaMV35S khởi động phiên mã gen GmEXP1 tất mô bào thực vật; trình tự xác định chuỗi c-myc kháng nguyên phục vụ phản ứng Western blot; polyA ổn định cấu trúc mRNA A B C Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm DNA tinh sau cắt plasmid NcoI/NotI sản phẩm colony - PCR chọn dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp M: thang chuẩn DNA 1kb; SP1: Gen GmEXP1 tinh sau cắt pBT_GmEXP1 NcoI/NotI; SP2: Đoạn DNA đích tinh từ pRTRA7/3 cắt mở vòng NcoI/NotI 1-3: dòng khuẩn lạc; (-): PCR E.coli không biến nạp; (+): PCR gen GmEXP1 Footer Page 15 of 148 - 13 - Header Page 16 of 148 Tạo cấu trúc độc lập mang gen GmEXP1được tiến hành theo bước: i) Thu nhận gen đích GmEXP1 từ vector pBT_GmEXP1 cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI (Hình 3.6A); ii) Cắt mở vòng pRTRA7/3 NcoI/NotI (Hình 3.6B); iii) Gắn gen GmEXP1 lên vector pRTRA7/3 mở vòng nhân dòng E.coli DH5α Kết chọn dòng E.coli mang vector tái tổ hợp colony-PCR (hình 3.6C) cho thấy dòng vi khuẩn kiểm tra cho kết dương tính 3.3.2 Gắn cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào vector pCB301 tạo vector chuyển gen GmEXP1 Thu nhận cấu trúc độc lập mang gen GmEXP1 từ pRTRA7/3 tái tổ hợp HindIII Tiếp theo gắn cấu trúc độc lập mang gen GmEXP1 vào vector chuyển gen pCB301 sau mở vòng HindIII xúc tác T4 DNA ligase Vector tái tổ hợp pCB301_GmEXP1 nhân dòng E.coli, chọn lọc colony PCR cắt kiểm tra cấu trúc NotI (hình 3.9) C Hình 3.9 Sơ đồ kiểm tra gen GmEXP1 vector chuyển gen NotI A: Cấu trúc chứa gen gắn xuôi chiều; B: Cấu trúc chứa gen chuyển gắn ngược chiều; C: điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp NotI Kết kiểm tra NotI cho phép khẳng định thành công phát triển vector chuyển gen GmEXP1 Vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp dùng để chuyển gen GmEXP1 vào tế bào thực vật qua lây nhiễm 3.4 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN GmEXP1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ 3.4.1 Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào thuốc nhờ A tumefaciens Tiến hành chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào thuốc N tabacum K326 nhờ A.tumefaciens với hai lần biến nạp qua giai đoạn: đồng nuôi cấy, tái sinh đa chồi, chọn lọc giai đoạn kéo dài chồi, rễ, bầu đất nhà lưới (hình 3.10) Footer Page 16 of 148 - 14 - Header Page 17 of 148 A B C D E F Hình 3.10 Hình ảnh mô tả trình biến nạp tái sinh tạo thuốc chuyển gen A Mảnh môi trường đồng nuôi cấy; B Tái sinh đa chồi; C Chọn lọc giai đoạn kéo dài chồi; D: Ra rễ; E: Cây bầu trấu cát; F: Cây nhà lưới Kết (bảng 3.6) cho thấy, với 60 mảnh K326 biến nạp tạo 175 in vitro sống sót môi trường MS có kháng sinh kanamycin 50 mg/l cefotaxim 400 mg/l; lựa chọn 44 chuyển gen (từ lô thí nghiệm) 15 không chuyển gen (từ lô ĐC1) sinh trưởng tốt đưa nhà lưới Bảng 3.6 Thống kê số lượng mẫu chuyển gen vào thuốc N tabacum Công thức Số mẫu biến nạp Số mẫu sống sót tạo cụm chồi Số sống sót rễ Số bầu đất Số nhà lưới TN 30 30 88 74 21 TN 30 29 87 75 23 ĐC0* 30 0 0 ĐC1* 30 30 103 15 15 Ghi chú: * ĐC0 thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; * ĐC1 thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh 3.4.2 Phân tích biểu gen chuyển GmEXP1 thuốc hệ T0 Xác định có mặt gen GmEXP1 hệ gen thuốc T0 Thu mẫu 44 chuyển gen T0, tách DNA thực PCR với cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI; kết kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose thu 32/44 có băng DNA kích thước khoảng 0,79 kb - tương ứng với kích thước gen đích GmEXP1 (hình 3.11) Hiệu suất chuyển gen giai đoạn đạt 32/60 = 53,33% Hình 3.11 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định có mặt gen GmEXP1 thuốc chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; - 44: thuốc chuyển gen; wt: đối chứng không chuyển gen; (+): PCR từ vector chuyển gen pCB301_GmEXP1 Footer Page 17 of 148 - 15 - Header Page 18 of 148 Xác định có mặt sản phẩm phiên mã gen chuyển thuốc chuyển gen T0 kỹ thuật RT-PCR Hình 3.12 Kết điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động gen GmEXP1 thuốc chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 24 - 36: sản phẩm RT-PCR thuốc chuyển gen (+): sản phẩm PCR vector chuyển gen GmEXP1; wt: sản phẩm RT-PCR thuốc không chuyển gen Các thuốc chuyển gen tách chiết RNA tổng số, thực tổng hợp cDNA enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) sau tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm RT-PCR kiểm tra gel agarose 0,8% cho kết 3/32 dương tính có băng DNA kích thước khoảng 0,79 kb tương đương với kích thước gen GmEXP1 (hình 3.12) Đánh giá mức độ phiên mã gen chuyển thuốc chuyển gen T0 Real-time RT-PCR Để tạo khuôn cho phản ứng Real-time RT-PCR, mẫu chuyển gen tách định lượng 500 ng RNA tổng số đưa vào phản ứng tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên Phản ứng Real-time RT-PCR thực khuếch đại thu nhận giá trị Ct sản phẩm cDNA gen chuyển GmEXP1 với cặp mồi qExp1-F/qExp1-R gen tham chiếu Actin với cặp mồi qActin-F/qActin-R A B Hình 3.14 Đồ thị ngưỡng nhiệt (A), biểu đồ phân tích nhiệt độ nóng chảy đỉnh chảy (B) hai gen GmEXP1 Actin mẫu thuốc chuyển gen T0 phản ứng Real-time Footer Page 18 of 148 - 16 - Header Page 19 of 148 Áp dụng phương pháp R=2-ΔΔCt Livak xác định tỷ lệ biểu phiên mã gen GmEXP1 so sánh với gen tham chiếu Actin qua phản ứng Real-time RT-PCR, kết phản ánh 26 36 có mức độ biểu gen chuyển tương đương nhau; 30 cao gấp khoảng lần Phân tích biểu gen GmEXP1 hệ T0 dựa có mặt protein expansin thuốc chuyển gen Hình 3.15 Hình ảnh lai Western (cơ chất TMB) thuốc chuyển gen T0 M: thang chuẩn protein; 26 - 36: mẫu protein thuốc chuyển gen; (+): protein 37kDa có chuỗi c-myc đầu C; wt: mẫu protein thuốc không chuyển gen Kết điện di protein tổng số lai Western (hình 3.15) biểu băng protein vị trí kích thước khoảng 30 kDa tương ứng với kích thước tính toán protein ngoại lai expansin phần mềm ExPASy Compute pI/Mw Như gen chuyển GmEXP1 từ đậu tương chuyển thành công vào thuốc T0, biểu phiên mã cho mRNA dịch mã cho protein expansin tương ứng 3.4.3 Phân tích đánh giá biểu chức sinh học gen chuyển GmEXP1 thuốc hệ T1 Chọn lọc thuốc T1 mang gen chuyển kháng sinh Gieo hạt thuốc môi trường không kháng sinh có kháng sinh chọn lọc cho kết quả, hạt thuốc T036 khả nảy mầm; hạt đối chứng không mang cấu trúc gen chuyển nên bị đào thải môi trường kháng sinh kanamycin; số hạt 26 30 nảy mầm môi trường kháng sinh chọn lọc mang cấu trúc gen chuyển Các chuyển gen T1 sống sót qua chọn lọc kháng sinh ưu tiên phát triển phục vụ thí nghiệm phân tích gen chuyển GmEXP1 Đánh giá mức độ phiên mã gen chuyển dòng thuốc chuyển gen T1 Real-time RT-PCR Footer Page 19 of 148 - 17 - Header Page 20 of 148 Tiến hành thu mẫu thuốc chuyển gen T1 (dòng 26, 30); tách định lượng RNA tổng số; tổng hợp cDNA kiểm tra PCR để chuẩn bị khuôn cho phản ứng real-time Hình 3.18 Biểu đồ so sánh tỷ lệ biểu gen GmEXP1 thuốc chuyển gen hệ T1 so với mẫu chuyển gen T026 Phản ứng Real-time RT-PCR thực với hai cặp mồi xác định gen chuyển GmEXP1 gen tham chiếu Actin thuộc hai dòng chuyển gen T126 T130 thu giá trị ngưỡng nhiệt Ct Phân tích kết mức độ biểu gen GmEXP1 thuốc chuyển gen T1 t-Test (với α=0,001) cho thấy, hai dòng T126 T130 có mức độ biểu phiên mã nhau, đồng ổn định với mức độ tin cậy 99,9% Các T126-4, T130-3, T130-4 có mức độ biểu gen chuyển cao T026 từ 1,32 đến 1,79 lần Nguyên nhân biến động biểu phiên mã gen chuyển GmEXP1 cá thể xuất phát từ tương tác nhân tố bên tế bào như: hiệu vị trí gen chuyển NST đích; thay đổi số lượng copy qua sinh sản hữu tính; hiệu biểu gen đích có thay đổi hệ thống biểu hệ sau Phân tích protein ngoại lai dòng thuốc chuyển gen T1 western blot Protein tổng số từ thuốc T1 dương tính với RT-PCR điện di biến tính SDS-Page; chuyển lên màng lai nitrocellulose; bloking sữa tách béo 5% PBS; lai kháng thể 1; lai kháng thể màu với chất DAB Kết màng lai cho thấy thuốc chuyển gen kiểm tra có protein kích thước khoảng 30 kDa tương ứng với kích thước protein đối chứng dương T0 Footer Page 20 of 148 - 18 - Header Page 21 of 148 Như nói, gen ngoại lai GmEXP1 phân lập từ giống đậu tương SL1 chuyển thành công vào thuốc lá, di truyền biểu ổn định đến mức độ dịch mã qua hai hệ T0 T1 Hình 3.19 Kết lai Western (cơ chất DAB) các đòng thuốc chuyển gen hệ T1 - 4: Các chuyển gen dòng số 26; - 8: Các chuyển gen dòng số 30; wt: Cây thuốc không chuyển gen làm đối chứng âm; (+): Protein chuyển gen T026 làm đối chứng dương; M: thang chuẩn protein 10 - 180 kDa Đánh giá biểu chức sinh học gen chuyển GmEXP1 thuốc hệ T1 Sự biểu chức sinh học gen GmEXP1 đánh giá qua đặc điểm phát triển rễ T1 điều kiện hạn so với đối chứng Kết so sánh thể tích, khối lượng khô rễ chiều dài rễ trình bày bảng 3.10, 3.11 3.12 luận án Hình 3.20 Hình ảnh thí nghiệm gây hạn nhân tạo thuốc (A) so sánh hình thái rễ có tưới nước không tưới nước (B) giai đoạn ngày gây hạn WT: Cây thuốc đối chứng không chuyển gen; 26, 30: Các dòng thuốc chuyển gen Kết phân tích cho thấy, thể tích rễ chuyển gen so với đối chứng tăng mạnh khoảng ngày đầu gây hạn (29,82 - 41,15%) sau giảm dần nhiều nước; khối lượng khô rễ chuyển gen tăng từ 30,64 đến 39,69% so với đối chứng không chuyển gen Chiều dài rễ qua giai đoạn gây hạn không chuyển gen tăng từ 1,59 đến 9,82% so với đối chứng chuyển gen tăng từ 4,85 đến 22,27% So với đối chứng không chuyển gen điều kiện hạn, dòng thuốc chuyển gen T1 có chiều dài rễ tăng từ 31,07 đến 41,23% chứng tỏ mối liên quan gen chuyển GmEXP1 thay đổi chiều dài rễ thuốc chuyển gen Footer Page 21 of 148 - 19 - Header Page 22 of 148 3.5 KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG GEN CHUYỂN GmEXP1 3.5.1 Chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 vào đậu tương nhờ A tumefaciens Hạt đậu tương khử trùng khí Clo, nảy mầm 4-5 ngày GM thu nhận nách mầm làm vật liệu nhận gen Biến nạp cấy trúc gen GmEXP1 thông qua lây nhiễm vi khuẩn A.tumefaciens vào nách mầm kết hợp gây tổn thương vật nhọn Quá trình biến nạp, tái sinh tạo đậu tương chuyển gen minh hoạ hình 3.21 A B C D E F Hình 3.21 Hình ảnh minh hoạ trình biến nạp tái sinh tạo đậu tương chuyển gen A: Mẫu biến nạp CCM; B: Cảm ứng tạo chồi SIM lần 1; C: Cảm ứng tạo chồi SIM lần 2; D: Chọn lọc kéo dài chồi SEM; E: Tạo rễ RM; F: Cây giá thể Qua hai lần biến nạp với 380 mảnh mầm (Bảng 3.13) thu 103 mẫu tạo chồi, 34 mẫu có chồi kéo dài môi trường kháng sinh chọn lọc SEM, 21 chồi rễ khoẻ mạnh thu T0 phát triển giá thể Lô ĐC1 tạo khoẻ mạnh giá thể làm đối chứng Bảng 3.13 Thống kê số lượng mẫu chuyển gen vào đậu tương DT84 Lô thí nghiệm TN1 TN2 ĐC0* ĐC1* Số mẫu thí nghiệm Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi rễ Số sống giá thể 180 200 30 30 50 53 11 16 18 12 Ghi chú: * ĐC0 mầm đậu tương không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; * ĐC1 mầm đậu tương không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh 3.5.2 Phân tích đậu tương chuyển gen hệ T0 3.5.2.1 Xác định có mặt gen chuyển GmEXP1 hệ gen đậu tương Tách chiết DNA tổng số từ đậu tương chuyển gen PCR với cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI để xác định có mặt gen chuyển GmEXP1 Sản phẩm điện di gel agarose (hình 3.22) cho thấy số xuất hai băng DNA kích thước khoảng 0,79 (tương ứng kích thước gen chuyển) 1,51 kb (tương ứng với kích thước gen nội tại) Footer Page 22 of 148 - 20 - Header Page 23 of 148 Hình 3.22 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển GmEXP1 các đậu tương chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; - 9: sản phẩm PCR chuyển gen; (+): sản phẩm PCR vector chuyển gen GmEXP1; (-): sản phẩm PCR DNA đậu tương không chuyển gen Điều rằng, hệ gen đậu tương chuyển gen số số (ký hiệu DT04 DT07) có mặt gen ngoại lai GmEXP1 Hiệu suất chuyển gen GmEXP1 giai đoạn đánh giá đạt 2/380 = 0,53% 3.5.2.2 Phân tích biểu gen chuyển GmEXP1 dựa có mặt protein expansin ngoại lai đậu tương chuyển gen Điện di protein tổng số từ hai đậu tương DT04 DT07 thực lai hai loại kháng thể sau chuyển lên màng lai nitrocellulose Kết màu với chất DAB (hình 3.23) cho thấy, DT04 xuất băng màu vị trí khoảng 30 kDa tương đương kích thước protein expansin đối chứng dương Hình 3.23 Kết lai Western (cơ chất DAB) đậu tương chuyển gen hệ T0 M: thang chuẩn protein 10-180 kDa; DT04, DT07: mẫu chuyển gen số 7; (-): mẫu đậu tương không chuyển gen; (+): protein thuốc chuyển gen Kết cho thấy, đậu tương chuyển gen GmEXP1 biểu đến mức độ dịch mã cho protein expansin ngoại lai Như thấy, vector chuyển gen pCB301_GmEXP1 thiết kế không phù hợp với thuốc mô hình mà có khả chuyển gen đích GmEXP1 vào đậu tương Cây đậu tương chuyển gen biểu protein expansin ngoại lai kết khẳng định thành công quy trình chuyển gen GmEXP1 vào đậu tương Footer Page 23 of 148 - 21 - Header Page 24 of 148 Chương THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chọn tạo giống trồng chịu hạn mang tính thời - Biến đổi khí hậu toàn cầu, mưa không đồng đều, khô hạn kéo dài gây hoang hoá, thu hẹp diện tích canh tác nông nghiệp, giảm suất chất lượng sản phẩm nông nghiệp - Xây dựng giống trồng ổn định suất, phẩm chất thích ứng với điều kiện vấn đề mang tính chiến lược phát triển kinh tế nông nghiệp nhiều quốc gia, có Việt Nam - Khoa học sinh học nghiên cứu sở phân tử đặc tính di truyền, sinh lý, hoá sinh tìm lời giải cho vấn đề mang tính thời nói Một số phương pháp ứng dụng triển vọng ứng dụng công nghệ gen cải thiện đặc tính chịu hạn đậu tương Việt Nam - Đậu tương trồng quan trọng chiến lược nhiều quốc gia thuộc nhóm chịu hạn kém, đòi hỏi áp dụng tiến khoa học nhằm cải thiện đặc tính - Chọn tạo giống đậu tương chống chịu tốt với điều kiện khô hạn tiến hành từ lâu với biện pháp lai giống truyền thống, gây tạo đột biến thực nghiệm thu thành định như: DT2008 (Viện Di truyền Nông nghiệp); giống ML48, ML61 (Chu Hoàng Mậu 2001) - Kỹ thuật chuyển gen súng bắn gen A.tumefaciens thực thành công từ 1988 (Hinchee) ngày có nhiều thành tựu đậu tương chuyển gen; Việt Nam cũng có số tác giả thực chuyển gen tái sinh thành công đậu tương chuyển gen chống chịu sâu hại; chống chịu hạn; sản xuất vaccin thực vật; kháng bệnh virus minh chứng tiềm kỹ thuật chọn tạo giống đậu tương cải thiện khả chịu hạn Lựa chọn gen đích phù hợp nhằm cải tiến rễ - cải thiện khả chịu hạn đậu tương Gen đích lựa chọn đề tài luận án GmEXP1 cho hiệu cải tiến rễ dẫn đến làm tăng khả chịu hạn đậu tương lý do: Footer Page 24 of 148 - 22 - Header Page 25 of 148 - Gen chuyển GmEXP1 lấy từ giống đậu tương có khả chịu hạn tốt, xác định protein expansin cho hiệu giãn thành tế bào vùng sinh trưởng dẫn đến kéo dài rễ, làm tăng khả nhận nước đậu tương từ lớp đất sâu vùng ngoại vi điều kiện khô hạn, cải thiện khả chịu hạn - Sử dụng gen GmEXP1 từ giống đậu tương chịu hạn tốt chuyển vào giống đậu tương chịu hạn sẽ tránh khó khăn biểu chức sinh học protein ngoại lai hệ thống biểu vì: + Expansin hoạt động độc lập, không nằm chuỗi phản ứng trao đổi chất nên không bị giới hạn chất cũng ức chế sản phẩm xúc tác + Expansin protein điều hoà nên không gặp trở ngại biểu tương quan số lượng vị trí tương tác DNA; vấn đề ức chế phản hồi; vấn đề kiểm soát vị trí đích Thiết kế cấu trúc chứa đoạn gen chuyển phát triển vector chuyển gen - Cấu trúc chứa đoạn gen chuyển GmEXP1 phải cấu trúc biểu độc lập tế bào chủ phải dễ sàng lọc, đánh giá biểu Promoter 35S, c-myc polyA thành phần cần thiết cho cấu trúc - Vector pCB301 dùng để chuyển cấu trúc chứa gen GmEXP1 vào thực vật cung cấp đủ thành phần cần thiết cho chuyển gen như: LB, RB, OriV, nptII, operon TrfA Những khó khăn chuyển gen đậu tương nhờ A tumefaciens giải pháp khắc phục - Hiệu suất tạo đậu tương chuyển gen phụ thuộc nhiều yếu tố: vi khuẩn, vector chuyển gen, mô tiếp nhận, khả tái sinh giống đậu tương nhận gen - Nách mầm hạt chín sử dụng làm mô tiếp nhận nhờ hệ số tạo chồi cao dễ thu nhận nguyên liệu biến nạp với số lượng lớn - Khó khăn đặc trưng chuyển gen đậu tương dễ nhiễm khuẩn vệ tinh hàm lượng protein mô bào cao giải điều chỉnh kháng sinh; khó khăn mùa vụ sinh thái lựa chọn giải pháp tính toán thời gian biến nạp tái sinh trùng khớp chu kỳ sinh học giống giải pháp sử dụng buồng sinh trưởng điều khiển chủ động nhiệt độ ánh sáng Footer Page 25 of 148 - 23 - Header Page 26 of 148 Ứng dụng tiến kỹ thuật phân tích chọn lọc dòng chuyển gen Một số kỹ thuật phân tử cho phép phân tích xác thể chuyển gen giai đoạn Từ chọn lọc xác rút ngắn thời gian chọn tạo dòng chuyển gen Các kỹ thuật ứng dụng đề tài luận án như: - Kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho phép kiểm tra nhanh chóng có mặt gen chuyển thể chuyển gen Hiệu suất tạo chuyển gen kiểm tra kỹ thuật thuốc đạt 32/60 = 53,33%; đậu tương đạt 2/380 = 0,53% Tuy nhiên kết phân tích dương tính giả nhiều nguyên nhân đến từ trạng thái tồn gen chuyển không gắn hệ gen tế bào nhận (Nguyễn Đức Thành 2003) - Kỹ thuật RT-PCR cho phép kiểm tra nhanh sản phẩm biểu phiên mã (mRNA) gen chuyển qua hai bước: tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với mồi ngẫu nhiên PCR khuếch đại cDNA đích với cặp mồi đặc hiệu Kỹ thuật cho kết nhanh chóng, nhiên định tính, không định lượng - Kỹ thuật Real-time RT-PCR kết hợp phương pháp tính Livak (Livak cs 2001) cho kết mức độ biểu phiên mã gen chuyển thuốc chuyển gen T0 có khác biệt nhau; hệ T1 dòng 26 30 có mức độ biểu trung bình tương đương nhau, ổn định đồng Qua cho thấy, Real-time RT-PCR sử dụng làm công cụ đắc lực phân tích mức độ biểu phiên mã gen chuyển, mở hướng phương pháp phân tích chuyển gen Việt Nam - Kỹ thuật lai Western phát biểu dịch mã gen chuyển GmEXP1 dòng chuyển gen cho thấy gen chuyển hoạt động dịch mã di truyền ổn định qua hai hệ T0 T1 Sự biểu chức sinh học gen chuyển GmEXP1 đánh giá qua tiêu phát triển rễ điều kiện gây hạn không gây hạn cho thấy mối liên quan vai trò ý nghĩa gen GmEXP1 số tính trạng phát triển rễ thực vật Từ năm 2003, Lee cs chứng minh vai trò gen GmEXP1 cách biểu thành công gen ngoại lai thuốc mô hình Tuy nhiên chưa thấy công bố việc biểu gen đậu tương Có thể nói, kết thử nghiệm tạo đậu tương chuyển gen GmEXP1 biểu thành công protein expansin tái tổ hợp giống đậu tương DT84 nghiên cứu Thế giới Việt Nam Footer Page 26 of 148 - 24 - Header Page 27 of 148 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Sự phát triển rễ giống đậu tương địa phương Sơn La giống DT84 điều kiện gây hạn nhân tạo đánh giá dựa tiêu chiều dài rễ chính, thể tích khối lượng khô rễ Giống đậu tương SL1 có rễ phát triển tốt nhất, tiếp đến giống SL4, SL6 rễ phát triển giống SL2, SL3, SL5 DT84 1.2 Gen GmEXP1 giống đậu tương nghiên cứu tách dòng thành công xác định trình tự nucleotide; vùng mã hoá gen có kích thước 768 nucleotide mã hoá 255 amino acid 1.3 Vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 phát triển chuyển thành công vào thuốc N tabacum K326 nhờ A.tumefaciens tạo 44 thuốc chuyển gen T0 trồng nhà lưới 1.4 Gen chuyển GmEXP1 xác định tồn hệ gen 32 thuốc hệ T0 3/32 có gen chuyển biểu giai đoạn phiên mã dịch mã, hiệu suất chuyển gen đạt 5% Mức độ biểu phiên mã gen chuyển GmEXP1 hệ T1 dòng 26 dòng 30 tương đương Gen chuyển di truyền ổn định biểu protein expansin tái tổ hợp qua hệ T0 T1 Trong điều kiện hạn không gây hạn, dòng thuốc chuyển gen T1 có khả kéo dài rễ cao so với đối chứng từ 34,56% đến 41,23% 1.5 Cấu trúc mang gen GmEXP1 chuyển thành công vào giống đậu tương DT84 nhờ A.tumefaciens tạo hai đậu tương chuyển gen T0 dương tính với PCR Protein expansin tái tổ hợp biểu dòng đậu tương chuyển gen hiệu suất chuyển gen đạt 0,27% Đề nghị Tiếp tục phân tích dòng đậu tương chuyển gen qua hệ T1, T2, T3 nhằm chọn tạo dòng ổn định tính trạng phát triển kéo dài rễ có khả chịu hạn cao Footer Page 27 of 148 ... 148 (3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ (4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến kéo dài rễ vào thuốc... dung có liên quan, bao gồm: (1) Vai trò rễ thực vật đậu tương tác động hạn; (2) Một số gen liên quan đến phát triển rễ thực vật đậu tương; (3) Chuyển gen liên quan đến hoạt động rễ đậu tương nhờ... nghệ gen coi biện pháp có hiệu nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương có khả chịu hạn cao Từ lý thực đề tài luận án: Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmEXP1 liên quan đến phát triển rễ đậu tương (Glycine