NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN ĐÀN CHÓ NUÔI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN ĐÀN CHÓ NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI BÙI THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE VÀ MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH CARE PHÂN LẬP ðƯỢC TRÊN ðÀN CHÓ NUÔI TẠI TRUNG TÂM CHÓ NGHIỆP VỤ TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ LAN HÀ NỘI - 2011 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 08 năm 2011 Tác giả luận văn Bùi Thị Hiền Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. ii LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn này, cho phép tôi ñược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến TS. Nguyễn Thị Lan, người hướng dẫn khoa học ñã tận tình giúp ñỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, Viện ðào tạo Sau ñại học, các cán bộ và chuyên gia thuộc Phòng thí nghiệm trung tâm khoa thú y, Trung tâm chó nghiệp vụ Trường ðại học nông nghiệp Hà Nội ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi và giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến gia ñình và bạn bè ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thiện luận văn. Hà Nội, tháng 08 năm 2011 Tác giả luận văn Bùi Thị Hiền Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii 1 MỞ ðẦU 50 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích của ñề tài 2 1.3 Ý nghĩa của ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Lịch sử bệnh Care 3 2.2 Căn bệnh học 4 2.3 Truyền nhiễm học 9 2.4 Triệu chứng bệnh tích 11 2.5 Chẩn ñoán bệnh 15 2.6 Phòng và trị bệnh 18 2.7 Phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức và việc nghiên cứu virus Care trên môi trường tế bào 20 2.8 ðịnh lượng virus 22 3 ðỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 ðối tượng nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Vật liệu nghiên cứu 23 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iv 3.4 Phương pháp nghiên cứu 24 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Hồ sơ thu thập mẫu 32 4.2 Triệu chứng chủ yếu của chó mắc bệnh Care 33 4.3 ðặc ñiểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care 35 4.3.1 Biến ñổi ñại thể của chó mắc bệnh Care 35 4.3.2 Biến ñổi vi thể của chó mắc bệnh Care 39 4.4 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch của một số tổ chức chó mắc bệnh 42 4.5 Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero- DST 45 4.6 ðặc tính sinh học của virus Care 48 4.6.1 Khả năng gây bệnh tích tế bào của virus Care 48 4.6.2 Biểu ñồ biểu diễn sự nhân lên của virus phân lập 52 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 ðề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Tên ñầy ñủ 1 CD Canine Distemper 2 CDV Canine Distemper Virus 3 CPE Cytopathogenic Effect 4 Cs Cộng sự 5 DAB 3,3'-Diaminobenzidine 6 DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium 7 DMSO Dimethyl sulfoxide 8 EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid 9 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 10 FCS Fetal calf serum 11 HE Hematoxyline Eosin 12 Hpi Hour post inoculation 13 IHC Immunohistochemistry 14 KN Kháng nguyên 15 KT Kháng thể 16 MOI Multiplicity of infection 17 PBS Photphate buffer saline 18 RT-PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reation 19 TCID 50 50% Tissue Culture Infective Dose Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Tính chất và chức năng các protein cấu trúc của CDV 6 4.1 Tiểu sử chó mắc bệnh Care 32 4.2 Triệu chứng chủ yếu của chó mắc bệnh Care 34 4.3 Biến ñổi ñại thể chủ yếu của chó mắc bệnh Care 36 4.4 Biến ñổi vi thể chủ yếu của chó mắc bệnh Care 40 4.5 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch 43 4.6 Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST 46 4.7 Bệnh tích tế bào khi gây nhiễm virus Care 49 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cấu trúc virus Care 5 4.1 Phổi viêm, gan hóa 38 4.2 Phổi viêm dính với thành ngực 38 4.3 ðại não sung huyết, xuất huyết 38 4.4 Hạch lympho màng treo ruột sưng, tụ máu 38 4.5 Ruột xuất huyết, chứa hơi căng phồng 38 4.6 Xuất huyết niêm mạc ruột 38 4.7 Phế nang ñứt nát, lòng phế nang chứa nhiều dịch phù (HE x10) 41 4.8 Phế nang thâm nhiễm tế bào viêm (HE x40) 41 4.9 Lông nhung ruột ñứt nát (HE x10) 41 4.10 Viêm cầu thận, xuất huyết (HE x40) 41 4.11 Hạch lympho xuất huyết, nang lympho teo (HE x10) 41 4.12 Hạch lympho xuất huyết, số lượng lymphocytes giảm (HE x40) 41 4.13 CDV phân bố ở phổi (IHC x10) 44 4.14 CDV phân bố ở vách phế nang (IHC x40) 44 4.15 CDV phân bố ở hạch phổi (IHC x10) 44 4.16 CDV phân bố ở lông nhung ruột (IHC x10) 44 4.17 CDV phân bố ở ruột (IHC x40) 44 4.18 CDV phân bố trong hạch ruột (IHC x40) 44 4.19 CPE do CDV24-H (virus phân lập) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm 51 4.20 CPE do Onderstepoort (virus vắc xin) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm 51 4.21 CPE do CDV24-H gây ra sau 48 giờ gây nhiễm 51 4.22 CPE do Onderstepoort gây ra sau 48 giờ gây nhiễm 51 4.23 CPE do CDV24-H gây ra sau 60 giờ gây nhiễm 51 4.24 CPE do Onderstepoort gây ra sau 60 giờ gây nhiễm 51 4.25 Biểu ñồ biểu diễn sự nhân lên của virus phân lập CDV24-H 53 4.26 Biểu ñồ so sánh sự nhân lên của CDV24-H và virus vắc xin 53 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Bệnh Care hay còn gọi là bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm của loài chó, do virus care (Canine Distemper Virus – CDV) gây ra. Bệnh thường xảy ra ở chó non, lây lan nhanh, tỷ lệ chết rất cao với các triệu chứng như: sốt, viêm cata ở niêm mạc, ñặc biệt là niêm mạc ñường hô hấp, viêm phổi, nổi mụn ở da và những triệu chứng thần kinh. Bệnh Care xảy ra ở khắp nơi trên thế giới, không những ở chó nuôi mà còn ở nhiều quần thể ñộng vật hoang dã. Người ta cho rằng những chó mắc bệnh Care mà không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng là mối ñe dọa nghiêm trọng cho việc bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi. Thống kê các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care góp phần quan trọng vào sự tuyệt chủng của chồn chân ñen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong ñịnh kỳ của chó hoang dã châu Phi. Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn ñàn. ðặc biệt virus Care ñã biến ñổi và có khả năng gây bệnh cho một số ñộng vật biển. Ở Việt Nam, bệnh Care ñược phát hiện từ năm 1920. ðến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao. Canine distemper virus (CDV) là nguyên nhân gây nên bệnh Care. CDV thuộc họ Paramixoviridae, giống Morbillivirus và có mối liên quan gần gũi về tính kháng nguyên và ñặc tính sinh học với virus gây bệnh sởi ở người và virus dịch tả trâu bò. CDV có kích thước tương ñối lớn, ñường kính từ 150 - 250 nm, với cấu trúc xoắn, nhân là một ARN sợi ñơn, có vỏ Lipoprotein. Virus Care chỉ có một serotype duy nhất nhưng có nhiều chủng ñược phân lập ở nhiều khu vực ñịa lý khác nhau trên thế giới và có những ñặc trưng riêng. ðể ñối phó với căn bệnh này, nhiều nước trên thế giới trong ñó có Việt Nam ñã sử dụng vắc xin nhằm khống chế bệnh. Tuy nhiên, bệnh Care vẫn xảy ra và gia tăng ở nhiều nước. Tỷ lệ chó ñã ñược tiêm vắc xin phòng bệnh Care Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 2 nhưng vẫn mắc bệnh này ngày càng tăng ở các nước như: Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, một số nước châu Âu. Ở Việt Nam, bệnh xảy ra thường xuyên trên những chó chưa tiêm phòng và cả những chó ñã tiêm phòng. Vì thế vấn ñề ñặt ra là liệu có phải ñã xuất hiện các virus Care biến chủng mới có ñặc tính khác với virus vắc xin khiến việc sử dụng vắc xin phòng bệnh kém hiệu quả hay không? Hay là do một nguyên nhân khác? Vì vậy, việc tìm hiểu các ñặc tính sinh học của virus Care phân lập ñược trong thời gian gần ñây, tìm hiểu các ñặc ñiểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care là rất cần thiết nhằm cung cấp những thông tin giá trị về dịch tễ bệnh, là cơ sở cho việc chọn chủng virus chế vắc xin phòng bệnh hiệu quả, ñồng thời ñưa ra các biện pháp khống chế bệnh nhằm làm giảm tỷ lệ chết do bệnh gây ra, giảm thiệt hại cho người chăn nuôi. Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Nghiên cứu ñặc ñiểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care và một số ñặc tính sinh học của virus gây bệnh Care phân lập ñược trên ñàn chó nuôi tại trung tâm chó nghiệp vụ- trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội” 1.2 Mục ñích của ñề tài Xác ñịnh ñược những biến ñổi ñại thể, vi thể chủ yếu của chó mắc bệnh Care, vị trí khu trú của virus Care trong các cơ quan, tổ chức của chó mắc bệnh. Xác ñịnh ñược ñặc tính sinh học của virus Care phân lập từ chó nuôi tại Trung tâm chó nghiệp vụ Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội. 1.3 Ý nghĩa của ñề tài Xác ñịnh ñược biến ñổi ñại thể, vi thể của các cơ quan, tổ chức của chó mắc bệnh Care, xác ñịnh ñược vị trí khu trú thích hợp của virus Care giúp cho công tác chẩn ñoán bệnh sớm, từ ñó có biện pháp can thiệp nhằm hạn chế thiệt hại do bệnh gây nên. Thực hiện ñề tài thành công, có thể cung cấp thêm thông tin về những chủng virus Care ñang lưu hành tại Việt Nam, làm cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn về virus Care như nghiên cứu ñặc tính sinh học phân tử, chế tạo kít chẩn ñoán nhanh virus, chế tạo vắc xin virus… [...]... PHÁP NGHIÊN C U 3.1 ð i tư ng nghiên c u Chó nghi m c b nh Care thu th p t Trung tâm chó nghi p v - Trư ng ð i h c Nông Nghi p Hà N i Virus Care phân l p ñư c t nh ng chó m c b nh Care ñã thu th p 3.2 N i dung nghiên c u Nghiên c u m t s tri u ch ng lâm sàng trên chó nghi m c b nh Care Nghiên c u bi n ñ i b nh lý ñ i th và vi th ch y u các cơ quan c a chó nghi m c b nh Care Nghiên c u m t s ñ c tính sinh. .. virus Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p ……………………… 19 2.7 Phương pháp nuôi c y virus trên t bào t ch c và vi c nghiên c u virus Care trên môi trư ng t bào 2.7.1 Phương pháp nuôi c y virus trên t bào t ch c Phương pháp nuôi c y virus trên môi trư ng t bào, t ch c là phương pháp khoa h c tiên ti n ñư c s d ng r ng rãi trong virus h c ñ nghiên c u v virus như: nuôi. .. nh ng ch t này ñ tiêu ñ c chu ng và b nh vi n thì hi u qu cao Ngoài ra virus Care còn m n c m v i tia UV (David T Smith và Donald S Martin, 1979) 2.2.4 ð c tính nuôi c y Có th nuôi c y CDV trên phôi gà, trên môi trư ng t bào th n chó, môi trư ng t bào th n kh và trên ch n (McCarthy A.J và c ng s , 2007) Trong quá trình nuôi c y trên ñ ng v t thí nghi m và trên phôi gà, virus thay ñ i ñ c l c ñ i v i... p ñ s d ng trong phân l p và hi u giá virus (Lan NT và c ng s , 2005) 2.8 ð nh lư ng virus ð nh lư ng virus là xác ñ nh s lư ng virus trong m t ñơn v c th ñ xác ñ nh n ng ñ virus ðây là m t bi n quan tr ng trong vi c s n xu t v c xin virus, s n xu t protein tái t h p b ng cách s d ng vec-tơ virus, nghiên c u v ñ c tính sinh h c hay nh ng nghiên c u khác v virus Virus ñư c ñ nh lư ng và ñi u ch nh MOI... a ñ u Vi c gây b nh th nghi m trên chó 6 tháng tu i d hơn chó 3 tu n tu i do chó 3 tu n tu i có kháng th th ñ ng thu nh n ñư c t m (H ðình Chúc, 1993) Ngư i ta cũng ghi nh n virus Care gây viêm não trên chó l n 2.3.3 Mùa v nhi m b nh Tô Du và Xuân Giao (2006), khi nghiên c u v d ch t h c b nh Care cho r ng t t c các loài chó ñ u c m th b nh, nhưng m n c m hơn là loài chó lai, chó c nh, chó n i ít m... nhà khoa h c ñã phân l p ñư c ch ng SH, A75/17 và ch ng R252 có ñ c l c cao và v a, ñ u tiên gây viêm não t y ti p ñó gây h y myelin (v b c trên s i tr c c a t bào th n kinh) Các trư ng h p khác có th gây t n thương th n kinh trung ương (Craig E Greene và Maxj Appel, 1987) 2.2.6 Cơ ch sinh b nh Virus gây b nh Care là virus gây nhi m hư ng lympho, niêm m c và mô th n kinh ð u tiên, virus nhân lên mô... nghi m, có th gây b nh cho chó con và ch n Ngoài ra, có th dùng chu t lang, th , chu t nh t tr ng, kh ñ gây nhi m Ch n và chó là ñ ng v t r t m n c m v i b nh, vì v y, ngư i ta thư ng tiêm truy n virus vào ch n non và chó non ñ gi ñ c l c và ñ c tính kháng nguyên 2.3.2 L a tu i m c b nh Trong t nhiên h u h t x y ra chó t 2 ñ n 12 tháng tu i, nhi u nh t là chó t 3 ñ n 6 tháng tu i Nh ng chó ñang bú m... n chó Nh ng ch ng này s d ng làm v c xin có th gây viêm não c p tính cho chó non ho c gây suy gi m mi n d ch (Takeshi Mori và c ng s , 1994) Nhóm virus như c ñ c là k t qu c a vi c ti p ñ i virus nhi u l n qua phôi gà nên còn g i là ch ng “gà hóa” Nh ng ch ng này không gây b nh trên ch n, ít gây ph n ng sau khi tiêm và cho kh năng phòng v t t H u h t nh ng ch ng virus v c xin phòng b nh Care cho chó. .. không gây b c, th hi n tính chuyên bi t ngưng k t h ng c a loài virus c u - - (-) : Chưa rõ Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p ……………………… 6 2.2.3 S c ñ kháng c a virus gây b nh Care Celiker và Gillespie, năm 1954, dùng virus sài s t chó thích nghi trên môi trư ng phôi tr ng ñ nghiên c u nh hư ng c a ñi u ki n nhi t ñ ñ n tính c m nhi m c a virus và h th y r ng: virus. .. nhi u nơi trên th gi i nh m kh ng ch b nh (Lan NT và c ng s , 2005) Tuy nhiên, trư ng h p chó ti p t c m c b nh sau khi ñã tiêm phòng v c xin ñư c ghi nh n ngày càng nhi u trên th gi i và Vi t Nam khi n ngư i ta ñ t câu h i li u có ph i virus ñã bi n ñ i tính kháng nguyên và làm cho v c xin không gi ñư c hi u qu như trư c? 2.2 Căn b nh h c 2.2.1 Phân lo i virus gây b nh Care Virus gây b nh Care (Canine