NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN ĐÀN CHÓ NUÔI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH CARE PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN ĐÀN CHÓ NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

BÙI THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA CHÓ MẮC BỆNH CARE VÀ MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH CARE PHÂN LẬP ðƯỢC TRÊN ðÀN CHÓ NUÔI TẠI TRUNG TÂM CHÓ NGHIỆP VỤ TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 08 năm 2011

Tác giả luận văn

Bùi Thị Hiền

LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp hoàn thành luận văn này, cho phép tôi ựược bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc nhất ựến TS Nguyễn Thị Lan, người hướng dẫn khoa học ựã tận tình giúp ựỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện ựề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, Viện đào tạo Sau ựại học, các cán bộ và chuyên gia thuộc Phòng thắ nghiệm trung tâm khoa thú y, Trung tâm chó nghiệp vụ Trường đại học nông nghiệp Hà Nội ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi và giúp ựỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ựến gia ựình và bạn bè ựã giúp ựỡ, ựộng viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thiện luận văn

Hà Nội, tháng 08 năm 2011 Tác giả luận văn

Bùi Thị Hiền

2.7 Phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức và việc nghiên

3.4 Phương pháp nghiên cứu 24

4.4 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch của một số tổ chức chó mắc bệnh 42 4.5 Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero- DST 45

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

4.6 Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST 46

DANH MỤC HÌNH

4.7 Phế nang ñứt nát, lòng phế nang chứa nhiều dịch phù (HE x10) 41

4.12 Hạch lympho xuất huyết, số lượng lymphocytes giảm (HE x40) 41

4.19 CPE do CDV24-H (virus phân lập) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm 51 4.20 CPE do Onderstepoort (virus vắc xin) gây ra sau 36 giờ gây nhiễm 51

4.25 Biểu ñồ biểu diễn sự nhân lên của virus phân lập CDV24-H 53

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Bệnh Care hay còn gọi là bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm

cấp tính nguy hiểm của loài chó, do virus care (Canine Distemper Virus –

CDV) gây ra Bệnh thường xảy ra ở chó non, lây lan nhanh, tỷ lệ chết rất cao với các triệu chứng như: sốt, viêm cata ở niêm mạc, ñặc biệt là niêm mạc ñường hô hấp, viêm phổi, nổi mụn ở da và những triệu chứng thần kinh Bệnh Care xảy ra ở khắp nơi trên thế giới, không những ở chó nuôi mà còn ở nhiều quần thể ñộng vật hoang dã Người ta cho rằng những chó mắc bệnh Care mà không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng là mối ñe dọa nghiêm trọng cho việc bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi Thống kê các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care góp phần quan trọng vào sự tuyệt chủng của chồn chân ñen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong ñịnh kỳ của chó hoang dã châu Phi Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn ñàn ðặc biệt virus Care ñã biến ñổi và

có khả năng gây bệnh cho một số ñộng vật biển

Ở Việt Nam, bệnh Care ñược phát hiện từ năm 1920 ðến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao

Canine distemper virus (CDV) là nguyên nhân gây nên bệnh Care

CDV thuộc họ Paramixoviridae, giống Morbillivirus và có mối liên quan gần

gũi về tính kháng nguyên và ñặc tính sinh học với virus gây bệnh sởi ở người

và virus dịch tả trâu bò CDV có kích thước tương ñối lớn, ñường kính từ 150

- 250 nm, với cấu trúc xoắn, nhân là một ARN sợi ñơn, có vỏ Lipoprotein Virus Care chỉ có một serotype duy nhất nhưng có nhiều chủng ñược phân lập ở nhiều khu vực ñịa lý khác nhau trên thế giới và có những ñặc trưng riêng

ðể ñối phó với căn bệnh này, nhiều nước trên thế giới trong ñó có Việt Nam ñã sử dụng vắc xin nhằm khống chế bệnh Tuy nhiên, bệnh Care vẫn xảy

ra và gia tăng ở nhiều nước Tỷ lệ chó ñã ñược tiêm vắc xin phòng bệnh Care

nhưng vẫn mắc bệnh này ngày càng tăng ở các nước như: Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, một số nước châu Âu Ở Việt Nam, bệnh xảy ra thường xuyên trên những chĩ chưa tiêm phịng và cả những chĩ đã tiêm phịng Vì thế vấn đề đặt

ra là liệu cĩ phải đã xuất hiện các virus Care biến chủng mới cĩ đặc tính khác với virus vắc xin khiến việc sử dụng vắc xin phịng bệnh kém hiệu quả hay khơng? Hay là do một nguyên nhân khác? Vì vậy, việc tìm hiểu các đặc tính sinh học của virus Care phân lập được trong thời gian gần đây, tìm hiểu các đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chĩ mắc bệnh Care là rất cần thiết nhằm cung cấp những thơng tin giá trị về dịch tễ bệnh, là cơ sở cho việc chọn chủng virus chế vắc xin phịng bệnh hiệu quả, đồng thời đưa ra các biện pháp khống chế bệnh nhằm làm giảm tỷ lệ chết do bệnh gây ra, giảm thiệt hại cho người chăn nuơi

Xuất phát từ thực tế đĩ, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên

cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chĩ mắc bệnh Care và một số đặc tính sinh học của virus gây bệnh Care phân lập được trên đàn chĩ nuơi tại trung tâm chĩ nghiệp vụ- trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội”

1.3 Ý nghĩa của đề tài

Xác định được biến đổi đại thể, vi thể của các cơ quan, tổ chức của chĩ mắc bệnh Care, xác định được vị trí khu trú thích hợp của virus Care giúp cho cơng tác chẩn đốn bệnh sớm, từ đĩ cĩ biện pháp can thiệp nhằm hạn chế thiệt hại do bệnh gây nên

Thực hiện đề tài thành cơng, cĩ thể cung cấp thêm thơng tin về những chủng virus Care đang lưu hành tại Việt Nam, làm cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn về virus Care như nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử, chế tạo kít chẩn đốn nhanh virus, chế tạo vắc xin virus…

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử bệnh Care

Bệnh Care hay còn gọi là bệnh sài sốt chó tên khoa học là canine

distemper (CD) xuất hiện ở châu Âu, một số nước châu Á và Nam Mỹ từ giữa

thế kỷ 18 (Timothy Y Woma và Moritz Van Vuuren, 2009) Tác nhân gây bệnh trong thời kì này ñược quy cho nhiều loại vi khuẩn khác nhau (Veranus Alva Moore, 1908)

Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp Henri Carré phân lập ñược mầm bệnh từ nước mũi của chó bị bệnh Mẫu bệnh phẩm ñược ông ñem lọc qua màng lọc vi khuẩn và ñem gây bệnh thực nghiệm cho chó khỏe mạnh khác thì thấy vẫn gây ñược bệnh Vì thế, ông kết luận nguyên nhân của bệnh là do virus Sau này, người ta lấy tên ông ñể ñặt tên cho mầm bệnh và tên bệnh (David T Smith và Donald S Martin, 1979)

Hiện nay bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra ở chó nuôi mà còn ở nhiều quần thể ñộng vật hoang dã Người ta cho rằng những chó mắc bệnh Care không biểu hiện triệu chứng rõ ràng là mối ñe dọa nghiêm trọng cho việc bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi Thống kê các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care góp phần quan trọng vào sự tuyệt chủng của chồn chân ñen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong ñịnh kỳ của chó hoang

dã châu Phi (Assessment M.E, 2005) Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư

tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn ñàn (Timothy Y Woma

và Moritz van Vuuren, 2009) ðặc biệt virus Care ñã biến ñổi và có khả năng gây bệnh cho một số ñộng vật biển (Kennedy S và cộng sự, 1989)

Ở Việt Nam, bệnh ñược phát hiện từ năm 1920 Cho ñến nay, bệnh xảy

ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006)

Năm 1950, một vắc xin phòng bệnh ñầu tiên ñược phổ biến tương ñối rộng rãi ñể phòng bệnh này Chương trình tiêm phòng cho chó ñã ñược thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới nhằm khống chế bệnh (Lan NT và cộng sự, 2005) Tuy nhiên, trường hợp chó tiếp tục mắc bệnh sau khi ñã tiêm phòng vắc xin ñược ghi nhận ngày càng nhiều trên thế giới và ở Việt Nam khiến người ta ñặt câu hỏi liệu có phải virus ñã biến ñổi tính kháng nguyên và làm cho vắc xin không giữ ñược hiệu quả như trước?

2.2 Căn bệnh học

2.2.1 Phân loại virus gây bệnh Care

Virus gây bệnh Care (Canine Distemper Virus - CDV) thuộc họ

Paramixoviridae, giống Morbillivirus CDV có mối liên quan gần gũi về tính

kháng nguyên và sinh lý với virus gây bệnh sởi của người và virus dịch tả trâu

bò (Lan NT và cộng sự, 2005) Trước ñây, người ta ñã từng sử dụng huyết thanh chống bệnh dịch tả trâu bò ñể ñiều trị bệnh sài sốt chó (Lê Thị Tài, 2006)

Morbillivirus là một virus có kích thước tương ñối lớn, ñường kính 150

- 250 nm, cấu trúc xoắn, nhân là một ARN sợi ñơn, có vỏ Lipoprotein

Virus Care chỉ có một serotype duy nhất nhưng có nhiều chủng ñược phân lập ở nhiều khu vực ñịa lý khác nhau trên thế giới và có những ñặc trưng riêng (Lê Thị Tài, 2006) Nguyễn Thị Lan và cộng sự (2008), ñã mô tả trong cây phân loại dựa trên việc giải trình tự gen quy ñịnh protein H, trên thế giới có 5 type virus lớn, phân lập tại những vùng ñịa lý khác nhau và có ñặc tính cơ bản khác nhau là: type Châu Âu, cổ ñiển (Classic type), Asia 1, Asia 2 và USA Chủng gây bệnh tiêu chuẩn là chủng Snyderhill thuộc type Cổ ñiển Viện thú y Việt Nam hiện ñang sử dụng chủng này ñể công cường ñộc, kiểm nghiệm hiệu lực của vắc xin phòng bệnh Care trên chó (Lê Thị Tài, 2006) Gây bệnh bằng cách tiêm thẳng vào não chó non nhạy cảm có thể gây chết 100% chó trong vòng 8 - 10 ngày Gây bệnh qua ñường hô hấp bằng khí dung thì tỷ lệ tử vong chỉ bằng 50% như trong tự nhiên (Appel M.J và Summer B.A, 1995)

Chủng CDV ñược sử dụng ñể sản xuất vắc xin phòng bệnh ở Việt Nam cũng thuộc type Cổ ñiển Chia làm hai nhóm, nhóm có ñộc lực cao tiêu biểu là chủng Rockborn và nhóm nhược ñộc tiêu biểu là chủng Onderstepoort, Lederles Nhóm virus vắc xin có ñộc lực cao ñược biến ñổi từ chủng tiêu chuẩn bằng cách tiếp ñời nhiều lần qua tế bào thận chó Những chủng này sử dụng làm vắc xin có thể gây viêm não cấp tính cho chó non hoặc gây suy giảm miễn dịch (Takeshi Mori và cộng sự, 1994)

Nhóm virus nhược ñộc là kết quả của việc tiếp ñời virus nhiều lần qua phôi gà nên còn gọi là chủng “gà hóa” Những chủng này không gây bệnh trên chồn, ít gây phản ứng sau khi tiêm và cho khả năng phòng vệ tốt

Hầu hết những chủng virus vắc xin phòng bệnh Care cho chó ñều có biến ñổi về ñộc lực (giảm tính gây bệnh) nhưng vẫn giữ tính gây nhiễm và có thể gây bệnh cho một số loài thú hoang dã (Assessment M.E, 2005)

2.2.2 Hình thái, cấu trúc virus gây bệnh Care

Hình thái:

Hình 2.1 Cấu trúc virus Care

Virus quan sát ựược thấy có hình vòng tròn, hình bán nguyệt do các sợi cuốn quanh tạo thành Dạng tròn có ựường kắnh ựo ựược từ 115nm - 230nm Màng cuộn kép có ựộ dày 75 - 85A0 với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (David T Smith và Donald S Martin, 1979)

Cấu trúc:

Nucleocapside chứa ARN một sợi không phân ựoạn gần 1600 nucleotit

mã hóa thành 6 protein cấu trúc và 1 protein không cấu trúc

Bảng 2.1 Tắnh chất và chức năng các protein cấu trúc của CDV

Ký

Khối lượng phân tử

P Phosphoprotein 73 - 80

Kda

đóng vai trò quan trọng trong

sự sao chép của ARN

Nhạy cảm với những chất phân giải protein

Kda

Vai trò quan trọng trong sự trưởng thành của virus và nối nucleocapside với những protein vỏ bọc

Kết hợp virus với tế bào cảm nhiễm, làm tan dẫn ựến sự kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm

Không hấp phụ hồng cầu, không gây ngưng kết hồng cầu

(-) : Chưa rõ

2.2.3 Sức ñề kháng của virus gây bệnh Care

Celiker và Gillespie, năm 1954, dùng virus sài sốt chó thích nghi trên môi trường phôi trứng ñể nghiên cứu ảnh hưởng của ñiều kiện nhiệt ñộ ñến tính cảm nhiễm của virus và họ thấy rằng: virus Care rất mẫn cảm với nhiệt

ñộ Nó bị phá hủy ở nhiệt ñộ 500C - 600C trong 30 phút Trong mô cô lập, nó tồn tại ít nhất 1 giờ ở 370C và 3 giờ ở nhiệt ñộ phòng (200C) Thời tiết ấm áp, virus không thể tồn tại lâu trong chuồng nuôi chó, sau khi chó bị bệnh ñược chuyển ñi

Thời gian sống và duy trì ñộc lực của virus sẽ dài hơn trong ñiều kiện nhiệt ñộ lạnh Ở nhiệt ñộ ñóng băng (00C) nó có thể tồn tại hàng tuần Dưới nhiệt ñộ ñóng băng virus khá ổn ñịnh Ở nhiệt ñộ -650C virus tồn tại ñược ít nhất là 7 năm (Craig E Greene và Maxj Appel, 1987)

Việc bảo quản virus ở dạng ñông khô có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo quản giống virus, sản xuất vắc xin và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

2.2.5 ðộc lực của virus

ðộc lực của virus là một thông số gây nhiều ảnh hưởng ñến khả năng cảm nhiễm bệnh Các nhà khoa học ñã phân lập ñược chủng SH, A75/17 và chủng R252 có ñộc lực cao và vừa, ñầu tiên gây viêm não tủy tiếp ñó gây hủy myelin (vỏ bọc trên sợi trục của tế bào thần kinh) Các trường hợp khác có thể gây tổn thương thần kinh trung ương (Craig E Greene và Maxj Appel, 1987)

2.2.6 Cơ chế sinh bệnh

Virus gây bệnh Care là virus gây nhiễm hướng lympho, niêm mạc và

mô thần kinh ðầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của hệ hô hấp Sau ñó virus nhiễm vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết Tại ñây, virus tác ñộng ñến nội mạc mạch máu và gây sốt, cơn sốt này kéo dài từ 1 - 2 ngày Virus theo máu vào hệ hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương cũng như thần kinh mắt Từ ñó, các dạng bệnh lý ñặc trưng của bệnh ñược biểu hiện là kết quả sự suy yếu của hệ bạch huyết, hệ thống phòng

vệ quan trọng của cơ thể ðây là nguyên nhân gây ra suy giảm miễn dịch và tạo ñiều kiện ñể nhiễm trùng thứ phát xảy ra Ít ngày sau, cơn sốt thứ 2 xuất hiện, biểu hiện trầm trọng hơn do các nhiễm trùng nặng trong phủ tạng Các biểu hiện bệnh lý ñiển hình là: viêm kẽ phổi, viêm não và phá hủy myelin, sừng hóa gan bàn chân… (Jones T.C và cộng sự, 1997; Vương ðức Chất và

Lê Thị Tài, 2004)

Tỷ lệ chết của chó mắc bệnh phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch của chó Chó non có tỷ lệ chết cao nhất khi mắc phải các biến chứng như: viêm phổi, viêm não và một số bệnh lý khác Những chó lớn hơn, trong giai ñoạn tiến triển của bệnh thường gặp các bệnh về thần kinh như Encephalomyetilis (viêm não tủy) hay rối loạn tiền ñình Khoảng 15% các trường hợp bệnh gây tổn thương thần kinh trung ương là do CDV gây ra (Appel M.J và Summer B.A, 1995),

2.3 Truyền nhiễm học

2.3.1 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên, tất cả các giống chó ựều cảm thụ, nhưng mẫn cảm nhất

là chó nhập ngoại, chó nội ắt mắc hơn Ngoài ra, cáo, chó sói, rái cá và một số loài ựộng vật ăn thịt khác cũng mắc bệnh đặc biệt, người ta ựã ghi nhận ựược trường hợp ựộng vật biển mắc bệnh này Năm 1987, người ta tìm thấy bệnh

do virus Care trên hải cẩu (Phocasibirica) ở hồ Baikal Sibero những chủng này lần lượt ựược ựặt tên PDV1 và PDV2 (Phocin Distemper virus)

Trong phòng thắ nghiệm, có thể gây bệnh cho chó con và chồn Ngoài

ra, có thể dùng chuột lang, thỏ, chuột nhắt trắng, khỉ ựể gây nhiễm

Chồn và chó là ựộng vật rất mẫn cảm với bệnh, vì vậy, người ta thường tiêm truyền virus vào chồn non và chó non ựể giữ ựộc lực và ựặc tắnh kháng nguyên

2.3.2 Lứa tuổi mắc bệnh

Trong tự nhiên hầu hết xảy ra ở chó từ 2 ựến 12 tháng tuổi, nhiều nhất

là chó từ 3 ựến 6 tháng tuổi Những chó ựang bú mẹ ắt mắc bệnh do ựược miễn dịch thụ ựộng qua sữa ựầu Việc gây bệnh thử nghiệm trên chó 6 tháng tuổi dễ hơn chó 3 tuần tuổi do chó 3 tuần tuổi có kháng thể thụ ựộng thu nhận ựược từ mẹ (Hồ đình Chúc, 1993)

Người ta cũng ghi nhận virus Care gây viêm não trên chó lớn

2.3.3 Mùa vụ nhiễm bệnh

Tô Du và Xuân Giao (2006), khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Care cho rằng tất cả các loài chó ựều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm hơn là loài chó lai, chó cảnh, chó nội ắt mẫn cảm hơn Bệnh xuất hiện nhiều khi có sự thay ựổi thời tiết ựặc biệt là những ngày mưa Ở nước ta, bệnh thường diễn ra vào thời ựiểm giao mùa, từ xuân sang hè hoặc thu sang ựông

2.3.4 Chất chứa virus

Trong cơ thể chó bệnh, virus thường có trong máu, phủ tạng, chất bài

tiết, ựặc biệt nước tiểu thường xuyên có virus Não, lách, phổi, hạch, tuỷ xương thường có nhiều virus nhất (Lan NT và cộng sự, 2005)

2.3.5 đường xâm nhập và cách thức lây lan

Chó bị bệnh bài xuất virus qua các chất bài tiết của cơ thể như phân, nước tiểu, nước mũi, các dịch tiếtẦ và khuếch tán vào không khắ trong các giọt nước nhỏ Virus có thể tồn tại trong các dạng này 6 - 22 ngày ngoài môi trường Từ ựó, virus dễ dàng xâm nhập vào thức ăn, nước uống Những chó khác bị lây nhiễm bệnh do tiếp xúc trực tiếp với chó bệnh, do tiếp xúc với chất bài tiết chứa virus hay thông qua thức ăn, nước uống và phổ biến nhất là thông qua không khắ ô nhiễm mầm bệnh Do vậy, bệnh có tắnh lây lan rất cao Mặc dù, virus ựược bài tiết trong hầu hết những dịch tiết của cơ thể bao gồm cả nước tiểu nhưng bệnh ắt lây lan theo những chất tiết này Chó bị bệnh ựiển hình gây nhiễm cho chó khác theo dịch tiết ở ựường hô hấp do ho bắn ra

là chắnh (Hồ đình Chúc, 1993)

Một con ựường lây nhiễm thường gặp khác là virus xâm nhập vào ựường tiêu hóa theo thức ăn, nước uống đặc biệt, theo Nguyễn Vĩnh Phước

và cộng sự (1978), virus còn có thể xâm nhập vào cơ thể qua da

Trong phòng thắ nghiệm, ựưa virus vào cơ thể theo con ựường tiêm, uống, bôi vào niêm mạc mũi ựều gây ựược bệnh

2.3.6 Tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết

Thời kỳ ủ bệnh của Care thường là 3 - 6 ngày (dài nhất là 17 - 21 ngày)

và có thể kéo dài khoảng trên dưới 1 tháng Chó phát bệnh thường chết ở tỷ lệ

50 - 80%, thậm chắ 100% nếu không ựiều trị sớm (Hồ đình Chúc, 1993) Lúc bệnh phát ở dạng kế phát (thường kết hợp cùng bệnh parvovirus, viêm gan truyền nhiễm) tỷ lệ chết do bệnh càng cao (Vương đức Chất, Lê Thị Tài, 2004; Tô Du, Xuân Giao, 2006)

2.4 Triệu chứng bệnh tích

2.4.1 Triệu chứng

Theo Craig E.Greene và Maxj Appel Biểu hiện bệnh thường rất ña dạng phụ thuộc vào tuổi chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khoẻ, chế ñộ chăm sóc nuôi dưỡng và ñộc lực của mầm bệnh

Những phát hiện lâm sàng thấy rằng sốt thường xảy ra từ 3 ñến 6 ngày sau khi nhiễm, thời kỳ nung bệnh cho tới khi bắt ñầu xảy ra các triệu chứng lâm sàng của bệnh Care cấp tính thường từ 14 ñến 18 ngày Sau khi nhiễm bệnh một cơn sốt ngắn và bạch cầu giảm xảy ra giữa ngày thứ 4 tới ngày thứ

7 không có triệu chứng rõ rệt của bệnh Care Nhiệt ñộ trở lại bình thường giữa

7 ñến 14 ngày, sau ñó thân nhiệt lại tăng cao kèm theo viêm kết mạc và viêm mũi Tiếp theo ho, ỉa chảy, nôn mửa, biếng ăn, mất nước và giảm cân với sự suy nhược thường quan sát thấy ở chó mắc bệnh Care cấp tính Dịch mũi và mắt chảy ra có mủ nhầy Viêm phổi thường do bội nhiễm vi khuẩn Da bị phát ban có thể viêm mủ ở vùng da bụng Triệu chứng viêm não cấp tính có thể phát triển với những biểu hiện khác nhau: sự co thắt cơ vân theo nhịp (Myolonus), cơ vân bị vặn không theo ý muốn, thể hiện như dạng nhai kẹo cao su, vận ñộng không ñiều hòa và không phối hợp với nhau Phản ứng sợ hãi và mù là những triệu chứng thường thấy trong bệnh Care cấp tính Khi xuất hiện triệu chứng thần kinh thời gian ngắn sau thì chết

Theo Nguyễn Văn Thanh (2007), biểu hiện bệnh thường rất ña dạng phụ thuộc vào tuổi chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khoẻ, chế ñộ chăm sóc nuôi dưỡng và ñộc lực của mầm bệnh

ðầu tiên chó xuất hiện những triệu chứng chung: mệt mỏi, ủ rũ, ăn ít, không thích vận ñộng, chảy nước mắt, nước mũi, nôn mửa, sau ñó sốt, thân nhiệt lên ñến 400C - 41,50C kéo dài từ 24 - 26 giờ rồi thân nhiệt giảm xuống 38,50C - 39,50C lúc này chó ăn ít, mệt mỏi, 3 - 4 ngày sau xuất hiện cơn sốt thứ 2, ñó là do có sự bội nhiễm của các vi khuẩn kế phát, cơn sốt kéo dài 3 - 4

ngày, lúc này bệnh trầm trọng hơn không chỉ do ñộc lực của virus mà còn do

số lượng và ñộc lực của các vi khuẩn bội nhiễm cùng xuất hiện với cơn sốt thứ hai, chó bắt ñầu thể hiện các triệu chứng ở ñường hô hấp, tiêu hoá, da và thần kinh

- Triệu chứng ở ñường tiêu hoá:

Do viêm cata ở dạ dày và ruột non nên con vật khát, nôn mửa rồi ỉa chảy, lúc ñầu phân loãng, có bọt sau ñó có lẫn máu, phân có màu cà phê nhạt Trường hợp nặng phân có thể lẫn máu tươi, niêm mạc ruột bong ra làm phân

có mùi tanh khắm rất khó chịu Chó thường bị viêm niêm mạc miệng và hạch hạnh nhân

Nôn là triệu chứng thường gặp của bệnh Care Nôn thường xuất hiện sớm, lúc ñầu nôn ra thức ăn sau ñó nôn khan hoặc nôn ra bọt có màu vàng

- Triệu chứng ñường hô hấp:

Chó bị viêm mũi, thanh quản, phế quản rồi viêm phổi nên chó khó thở, nhịp thở tăng rõ, phổi có tiếng ran ướt Con vật chảy nhiều nước mũi lúc ñầu loãng sau ñặc dần, ñôi khi có mủ xanh hoặc máu ñen Chó bị ho, lúc ñầu ho khan, sau ướt, chó thở gấp, thè lưỡi ra mà thở

Ngoài ra, chó bệnh thường xuyên có viêm mắt, chảy nước mắt Lúc ñầu nước mắt trong, sau ñặc dần như mủ, chó bị loét, ñục giác mạc

- Triệu chứng trên da:

ðặc trưng là sự xuất hiện các nốt sài ở bụng, bẹn, ngực, phía trong ñùi ðầu tiên, ở các vị trí da trên nổi những nốt chấm ñỏ, những chấm ñỏ ñó biến thành những nốt sài to bằng hạt ñỗ xanh, hạt gạo, lúc ñầu ñỏ sau bội nhiễm vi khuẩn nên mềm ra, có mủ, khi vỡ làm lông bết lại, hôi hám Các nốt sài có thể

vỡ ra hoặc không vỡ ra rồi hình thành vảy, bong ñi, ñể lại một vết thương nhanh chóng lành và không hình thành sẹo

Sau khi bị bệnh 10 - 15 ngày, ở 80 - 90% số con bị bệnh, da ở gan bàn

chân tăng sinh dày lên, có khi bị nứt ra làm chó ñi khập khiễng

- Triệu chứng thần kinh:

Quá trình tiến triển, con vật có thể thể hiện các triệu chứng thần kinh như ủ rủ, buồn rầu hoặc hung dữ sau ñó là các cơn co giật ñều ñặn ở bắp thịt, mũi, tai, chân hoặc toàn thân cuối cùng là liệt Con vật loạng choạng, ñứng lên, ngã xuống, ñâm sầm vào tường, sùi bọt mép Cuối cùng chó nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt hạ và chết Tỷ lệ chết có thể 60%, bệnh kéo dài 2- 5 tuần Những con lành bệnh thường có di chứng gầy còm, ñi xiêu vẹo, mù và ñiếc…

2.4.2 Bệnh tích

Theo Appel M.J, Summer B.A (1995), bệnh tích ñại thể có thể gặp là sừng hoá ở mõm và gan bàn chân Tuỳ theo mức ñộ kế phát các vi khuẩn có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột, mụn mủ ở da…

Bệnh tích ñường tiêu hoá:

Viêm cata ruột, loét ruột, hạch ruột sưng, gan thoái hoá mỡ

Bệnh tích ñường hô hấp:

Viêm mũi, thanh quản, khí quản, viêm phổi, có mụn mủ trong phổi, có khi vỡ ra gây viêm phế mạc

Thần kinh:

Viêm não, não tụ máu, các tế bào thần kinh bị tổn thương

Ở tế bào thượng bì ñường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt có thể tìm thấy tiểu thể lents trong nguyên sinh chất

Theo Carter S.D, và cộng sự (1996): chó con trước sinh hoặc sơ sinh bị nhiễm Care thường bị teo tuyến ức, viêm phổi hoặc viêm ruột thể cata Tổn thương ñường hô hấp trên, viêm kết mạc mắt, viêm mũi, viêm nhánh khí phế quản, chó bị sừng hoá mũi, gan bàn chân Tổn thương nhẹ trung khu thần kinh, có thể gặp sung huyết màng não và tăng áp lực lên hệ thần kinh trung ương do phù não

Suy giảm lympho là bệnh tích ñiển hình ở chó có triệu chứng toàn thân Viêm kẽ phổi ñặc trưng là sự dày lên của vách phế nang và sự tăng sinh của biểu mô vách phế nang và ñại thực bào (Craig E Greene, Maxj Appel, 1987) Viêm tinh hoàn thường thấy ở chó mắc bệnh Care, ñiều này có thể giải thích ñược sự giảm tinh trùng, giảm chất tiết của tuyến tiền liệt sau khi hồi phục ở chó ñực (Craig E Greene, Maxj Appel, 1987)

Chó sơ sinh mắc bệnh có bệnh tích viêm não cấp tính, thoái hoá tế bào thần kinh và myelin bị phá huỷ Những con sống sót, các vùng ñốm hoại tử thay vào bởi các tế bào sao phì ñại, nơi tạo thành mạch lưới do ñại thực bào hấp thu myelin Biến ñổi trầm trọng nhất là chất trắng ở thần kinh trung ương, biến ñổi

có thể tìm thấy ở trên cuống tiểu não, sát trên sừng lưng ñến buồng não IV Tổn thương cũng thấy ở não giữa và thuỳ thái dương Các vùng trên bề mặt như bó thị giác, gốc nếp vỏ não, dây thần kinh bề mặt não… cũng bị ảnh hưởng

Ở một số chó, chủ yếu gây ảnh hưởng ở ñại não và ñồi thị Trường hợp nặng có thể làm huỷ myelin tạo các không bào xốp ở chất trắng, viêm phản ứng tế bào thần kinh ñệm Thể vùi trong bào tương và trong nhân chủ yếu tìm thấy ở tế bào sao và tế bào thần kinh

Chó không có miễn dịch sẽ phát triển thành viêm não và giảm bạch cầu, những tổn thương này ñược ñặc trưng bởi sự lan rộng của những ñám cặn lympho bào xung quanh vùng myelin bị huỷ và thần kinh bị thoái hoá Chúng có thể lan rộng và trầm trọng hơn ở trường hợp viêm não cấp tính Trường hợp mãn tính, tổn thương có thể phát triển thành xơ cứng trong não ñặc trưng bởi sự lắng cặn và thay thế của các mô thần kinh bởi các mạng lưới

tế bào sao dày ñặc

Ngược lại, tổn thương do tiêm vắc xin ñược ñặc trưng bởi sự viêm não dẫn tới hoại tử não với vùng ưu tiên là sừng bụng Thể vùi có thể tìm thấy trong nhân hoặc bào tương tế bào sao và các tế bào thần kinh

Kiểm tra tổ chức học, thể vùi Care thường thấy nhất trong bào tương và nhuộm màu axít Chúng cĩ đường kính bằng 1 - 5 µm, Và tìm thấy ở tế bào biểu bì mơ trong lớp màng nhầy, tế bào mắt, bạch cầu, tế bào thần kinh đệm

và tế bào thần kinh Thể vùi tìm thấy sau khi nhiễm bệnh 5 - 6 tuần trong hệ lympho và đường tiết niệu Thể vùi trong nhân phân bố nhiều nhất ở biểu mơ tuyến (Jones, T.C và cộng sự, 1997)

Hình thái thể vùi vẫn chưa được biết rõ Hĩa tổ chức cho thấy, thể vùi được tạo ra từ sự kết hợp giữa vỏ nucleocapside của virus và cặn của các tế bào nhiễm virus bị tan vỡ Ta khơng thể khẳng định hồn tồn là cĩ bệnh Care khi quan sát thấy thể vùi Thể vùi đặc trưng trong bào tương khi nhiễm bệnh Care cũng được tìm thấy ở bàng quang của chĩ bình thường Thể vùi xuất hiện muộn trong diễn biến của bệnh và khơng phải là đặc trưng của bệnh

Sự hình thành tế bào khổng lồ: đầu tiên trong chất trắng của thần kinh trung ương và tiếp đĩ là hạch lympho, phổi, lớp màng não mỏng là điểm riêng biệt của bệnh Care (Craig E Greene và Maxj Appel, 1987) Những phát hiện bệnh lý này cĩ thể sử dụng để chẩn đốn chính xác sự nhiễm virus Care

2.5 Chẩn đốn bệnh

2.5.1 Dựa vào đặc điểm dịch tễ học của bệnh

Bệnh chủ yếu xảy ra ở chĩ 2 đến 12 tháng tuổi, ở thời điểm giao mùa, thời tiết thay đổi, độ ẩm cao hoặc lạnh đột ngột

2.5.2 Dựa vào triệu chứng lâm sàng

Chẩn đốn bệnh Care thể cấp tính và á cấp tính cĩ thể dựa vào bệnh sử

và triệu chứng lâm sàng Khi cĩ những triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh thì cĩ thể nghi ngờ chĩ mắc bệnh Care Ở những chĩ chưa tiêm phịng hoặc chĩ trưởng thành khơng được tiêm phịng đầy đủ cĩ những triệu chứng sốt, triệu chứng hơ hấp như chảy nước mũi, ho, cĩ dử mắt , triệu chứng tiêu hĩa hoặc triệu chứng thần kinh thì khả năng chĩ mắc phải bệnh Care là rất

Bệnh do Leptospira: Viêm dạ dày, ruột chảy máu, viêm loét miệng và thường xuất hiện ở chĩ lớn, vàng da, niêm mạc, số lượng bạch cầu tăng

2.5.3 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

2.5.3.1 Tìm thể Lents

Lấy mẫu bệnh phẩm là dịch cạo niêm mạc mắt hay mũi chĩ bệnh, đem nhuộm Hematoxilin - Eosin, tìm tiểu thể Lents qua kính hiển vi Cần chú ý, ở não, thể Lents rất giống thể Negri ở bệnh dại (David T Smith và Donald S Martin, 1979)

2.5.3.2 Chẩn đốn virus học

Tiêm truyền bệnh phẩm cho động vật thí nghiệm

Mẫu bệnh phẩm là máu, lách, gan, phổi, các chất bài tiết và dịch nước mũi, nước mắt của chĩ nghi mắc bệnh đem nghiền, chế thành huyễn dịch và tiêm cho động vật thí nghiệm Tốt nhất là tiêm cho chồn hoặc chĩ non Ngồi

ra, cĩ thể tiêm cho chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ

Quan sát tiến triển của bệnh gây ra trên động vật thí nghiệm, mổ khám bệnh tích đại thể và kết luận

Trong bệnh phẩm cĩ thể phân lập được một số vi khuẩn kế phát như Pasteurella, Bacillus bronchisepticus, Staphylococcus, E coli và Salmonella

Phân lập virus trên mơi trường tế bào

Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên mơi trường tế bào một lớp thích hợp Virus Care chỉ cĩ thể nhân lên và gây bệnh

tích tế bào (Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp

Bệnh tích tế bào do CDV gây ra cĩ thể quan sát được là những thể hợp bào, tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE

Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào Tế bào mới nuơi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuơi cấy nhiều ngày (Lan NT và cộng sự, 2005)

2.5.3.3 Chẩn đốn huyết thanh học

Dùng phản ứng miễn dịch đánh dấu Enzym (ELISA)

2.5.3.4 Chẩn đốn phát hiện ARN của virus Care bằng kĩ thuật RT- PCR

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain

Reaction) là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp

PCR Phương pháp này cĩ thể phát hiện các ARN tồn tại với lượng rất thấp

mà khơng thể phát hiện bằng phương pháp khác

Do Taq polymerase sử dụng trong PCR khơng hoạt động trên ARN nên trước hết cần chuyển ARN thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược Reverse Transcriptase (RT) Sau đĩ, cDNA này sẽ được khuếch đại nhờ Taq polymerase Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gen đặc hiệu của virus Sự hiện diện của sản phẩm này được nhận biết qua điện di trên gel agarose (Lan NT và cộng sự, 2008)

2.5.3.5 Chẩn đốn phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đốn nhanh

Hiện nay, nhiều phịng khám thú y sử dụng phương pháp xét nghiệm nhanh bằng thiết bị thiết kế sẵn, đơn giản, tiện dụng và độ chính xác cao

Về bản chất, ñây là phương pháp xét nghiệm ELISA ñể phát hiện kháng nguyên của virus Care trong máu, dịch kết mạc mắt và nước mũi của chó Hai kháng thể ñơn dòng trong thiết bị sẽ kết hợp ñặc hiệu với các nhóm quyết ñịnh kháng nguyên khác nhau của virus Care Sau khi cho bệnh phẩm vào vị trí ñệm Cellulose của thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể ñơn dòng thứ nhất Rồi phức hợp này kết hợp với kháng thể ñơn dòng khác trong màng nitơ - cellulose của thiết bị ñể tạo thành hợp chất kép hoàn chỉnh Kết quả xét nghiệm ñược biểu hiện qua các vạch do thiết bị sử dụng theo phép

Những chó ốm phải nuôi cách ly, cũi, chuồng chó ốm phải tiêu ñộc bằng nước vôi hoặc thuốc sát trùng, xử lý chất bài tiết và thức ăn nước uống thừa của chó bệnh

Chó mới mua về phải nuôi cách ly, theo dõi ít nhất 10 ngày, nếu không thấy có biểu hiện của bệnh mới cho nhập ñàn

2.6.1.2 Phòng bệnh bằng tiêm phòng vắc xin

Tiêm vắc xin là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất ñối với các bệnh

do virus gây ra nói chung, trong ñó có bệnh Care Vắc xin phòng bệnh Care

ñược tiêm lần ñầu cho chó lúc 2 tháng tuổi, trong những trường hợp chó có nguy cơ lây nhiễm cao thì có thể tiêm phòng sớm hơn Tiêm nhắc lại sau mũi ñầu tiên 3 ñến 4 tuần Sau ñó, ñịnh kì tái chủng mỗi năm một lần ñể ñảm bảo khả năng bảo hộ

Theo Craig E.Greene and Maxj Appel: Kháng thể thụ ñộng truyền qua nhau thai và sữa ñầu có tác dụng bảo vệ cho chó con sau sinh và cai sữa 3% kháng thể truyền qua nhau thai và 97% truyền qua sữa ñầu, kết quả cho thấy rằng hiệu giá kháng thể ban ñầu ở chó con mới sinh bằng 77% lượng kháng thể ở con mẹ Nếu không có sự hấp thu sữa ñầu chó con có thể ñược bảo vệ ít nhất 1 - 4 tuần Kháng thể thụ ñộng thường biến mất sau 12 - 14 tuần tuổi Vì vậy, ñể phòng bệnh Care cho chó con, tiêm phòng vắc xin cho chó mẹ là việc làm cần thiết và hữu ích

Việc tiêm vắc xin không chỉ có tác dụng phòng bệnh ñối với những chó chưa bị nhiễm virus mà còn có tác dụng tốt ngay cả ñối với những chó bị ñã tiếp xúc và nhiễm virus nếu ñược tiêm vắc xin phù hợp và tiêm trong vòng 4 ngày sau khi nhiễm

Hiện nay, trên thị trường thuốc thú y Việt Nam, vắc xin phòng bệnh Care cho chó khá phong phú về chủng loại do doanh nghiệp trong nước sản xuất và nhập khẩu từ nước ngoài Thống kê từ danh mục vắc xin và chế phẩm sinh học ñược phép nhập khẩu năm 2008 cho thấy có tới 17 loại vắc xin phòng Care và 1 loại kháng huyết thanh (Homoserum - Merial, Pháp) ñể phòng và trị bệnh này Trong ñó có sự tham gia của những tên tuổi lớn như Intervet- Hà Lan, Merial- Pháp, Biocan - Cộng hòa Séc, PFRIZER - Mỹ, Fort Dodge Animal Health - Mỹ ðiều này chứng tỏ Việt Nam ñang ngày càng quan tâm ñến bệnh Care và việc phòng bệnh Care

Xí nghiệp Thuốc thú y trung ương (Vetvaco) ñã chế ñược vắc xin phòng bệnh Care từ chủng virus nhược ñộc ñông khô, sản xuất qua môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp, mỗi liều chứa tối thiểu 103 TCID50 virus

2.7 Phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức và việc nghiên cứu

virus Care trên môi trường tế bào

2.7.1 Phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức

Phương pháp nuôi cấy virus trên môi trường tế bào, tổ chức là phương pháp khoa học tiên tiến ñược sử dụng rộng rãi trong virus học ñể nghiên cứu

về virus như: nuôi cấy, phân lập, giám ñịnh, chuẩn ñộ, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và ñặc biệt dùng các môi trường tế bào tổ chức ñể nuôi cấy các virus vắc xin

Muốn nuôi cấy ñược virus trên môi trường tế bào thì yêu cầu trước tiên

là tế bào phải có thụ thể phù hợp với virus Nhờ ñó, virus mới xâm nhập vào, liên kết và lợi dụng bộ máy di truyền của tế bào ñể nhân lên

Với nhiều loại virus sự nhân lên của chúng tiến triển song song với sự thoái hoá của các tế bào nuôi, một số virus gây bệnh cho tế bào rất ñặc trưng Những biến ñổi có tính chất ñặc trưng ñó gọi là sự huỷ hoại của tế bào chủ

hay bệnh tích tế bào (Cyto Pathogenic Effect - CPE) hoặc các ổ tế bào bị hoại

tử Mỗi ổ tế bào bị hoại tử ñó ñược gọi là một ñơn vị plague, có thể ñánh giá ñược khối lượng virus gây nhiễm bằng số ñơn vị plague xuất hiện Có những

tế bào bị nhiễm virus chưa ñến mức bị chết nhưng chức năng của tế bào này

ra dạng CPE ñặc trưng là Syncytium (Pomeroy L.W và cộng sự, 2008)

2.7.2 Nuôi cấy virus gây bệnh Care trên môi trường tế bào

Trước ñây, khi chưa biết ñến và sử dụng tế bào Vero-DST, việc phân lập và hiệu giá CDV rất khó khăn do không có dòng tế bào thích hợp ñể virus sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào

Tế bào Vero ñã từng ñược sử dụng thường xuyên ñể phân lập virus Nhưng trong nhiều trường hợp, các chủng CDV hoang dại không tăng trưởng ñược trên dòng tế bào này Ngoài ra, người ta còn gây nhiễm CDV lên những

tế bào lympho kích thích mitogen chọn lọc từ chó SPF hay lên tế bào ñại thực bào màng treo ruột có nguồn gốc từ chồn SPF Tế bào B95a chiết xuất từ tế bào lympho B của khỉ Mamoset cũng ñã từng ñược sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu Việc gây nhiễm virus CDV lên những tế bào này có kết quả tốt nhưng lại bộc lộ nhiều khó khăn cho hiệu giá virus Tương tự như vậy, việc sử dụng dòng tế bào biểu mô thận MDCK cũng phân lập những mẫu CDV lâm sàng thành công nhưng mất nhiều thời gian trước khi phát triển CPE, nên không thuận lợi cho việc hiệu giá virus (Kai C và cộng sự, 1993)

Gần ñây, phân tử hoạt hoá tế bào lympho (Signal Lymphocyte Activation Molecule - SLAM) của người và nhiều ñộng vật khác (chó, bò…) ñược nhận diện là thụ thể thích hợp cho Morbillivirus bao gồm virus gây bệnh sởi, bệnh sài sốt và bệnh dịch hạch Seki và cộng sự (2003) ñã nghiên cứu và chứng minh ñược những tế bào Vero biểu hiện SLAM của chó rất nhạy cảm

ñể phát hiện CDV trong những mẫu lâm sàng và có thể phục hồi dòng ñại diện của CDV mà không cần có sự chọn lọc hay thích ứng Sau ñó, Nguyễn Thị Lan và cộng sự (2005) ñã nghiên cứu thành công ñặc tính sinh trưởng cụ thể của một số CDV trên dòng tế bào Vero có thể hiện phân tử hoạt hoá tế bào lympho của chó (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST) Nghiên cứu cũng làm rõ những ñặc tính sinh trưởng khác nhau khi gây nhiễm các CDV lên tế bào Vero và tế bào Vero-DST Qua ñó, có thể nhận thấy, tế bào Vero-DST

tương thích với nhiều giống CDV hơn Nó là tế bào thích hợp ñể sử dụng trong phân lập và hiệu giá virus (Lan NT và cộng sự, 2005)

2.8 ðịnh lượng virus

ðịnh lượng virus là xác ñịnh số lượng virus trong một ñơn vị cụ thể ñể xác ñịnh nồng ñộ virus ðây là một biến quan trọng trong việc sản xuất vắc xin virus, sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách sử dụng vec-tơ virus, nghiên cứu về ñặc tính sinh học hay những nghiên cứu khác về virus Virus ñược ñịnh lượng và

ñiều chỉnh ở MOI (Multiplicity Of Infection) nhất ñịnh ñể tối ưu hóa sản lượng

sản xuất và ñáp ứng nhu cầu thay ñổi không ngừng của các ứng dụng khác Trong nghiên cứu về ñặc tính sinh học của virus, ñịnh lượng virus xác ñịnh TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose - liều gây nhiễm 50% tế

bào) có vai trò quan trọng trong việc xác ñịnh lượng virus cần dùng ñể gây nhiễm tại MOI thích hợp, ñảm bảo việc so sánh ñặc tính sinh trưởng của các virus khác nhau một cách khách quan và chính xác Ở bước tiếp theo, xác ñịnh quy luật nhân lên của virus trên môi trường tế bào, log10 TCID50 là biến

số ñể xây dựng

TCID50 là mội biến số sử dụng phổ biến thể hiện ñịnh lượng của virus,

là số virus cần thiết ñể gây ra 50% bệnh tích tế bào cho môi trường tế bào gây nhiễm virus Khảo nghiệm về TCID50 ñược ứng dụng phổ biến trong các nghiên cứu lâm sàng phải xác ñịnh liều gây chết của virus Khi sử dụng cho nuôi cấy tế bào, các tế bào ñược ủ với virus ñể virus gây nhiễm và nhân lên thêm Sau ñó, căn cứ vào tỷ lệ chết của tế bào bị nhiễm virus ở những giếng

có ñộ pha loãng virus khác nhau mà tính toán ra TCID50

MOI (Multiplicity Of Infection) là tỷ lệ giữa tác nhân gây nhiễm với

ñích gây nhiễm Trong trường hợp gây nhiễm virus vào tế bào thì MOI lúc này ñược xác ñịnh là tỷ lệ giữa lượng virus và số tế bào trong một giếng nuôi cấy ñó

3 ðỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng nghiên cứu

Chó nghi mắc bệnh Care thu thập từ Trung tâm chó nghiệp vụ- Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội

Virus Care phân lập ñược từ những chó mắc bệnh Care ñã thu thập

3.2 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu một số triệu chứng lâm sàng trên chó nghi mắc bệnh Care Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý ñại thể và vi thể chủ yếu ở các cơ quan của chó nghi mắc bệnh Care

Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học của virus Care phân lập ñược trên môi trường tế bào

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm dùng cho nghiên cứu ñược thu thập từ các cơ quan: ruột, hạch lympho màng treo ruột, phổi, hạch lympho phổi, hạch amidal, lách, não, mí mắt,… của các chó nghi mắc bệnh Care tại Trung tâm chó nghiệp vụ

- Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội

3.3.4 Máy móc, dụng cụ

Máy móc sử dụng cho làm tiêu bản vi thể: máy ñúc tự ñộng, máy cắt Microton, nồi hấp, kính hiển vi chụp ảnh …

Máy móc sử dụng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus: box vô trùng, tủ

ấm 370C /5% CO2, tủ sấy, tủ lạnh - 200C, tủ lạnh - 800C, bình nitơ lỏng, máy li tâm lạnh, máy hút môi trường tự ñộng, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh,…

Dụng cụ sử dụng làm tiêu bản vi thể: dao cắt, panh kẹp, lam kính, lamen Dụng cụ sử dụng làm phân lập và hiệu giá virus: bình nuôi cấy tế bào, khay 96 giếng, ñĩa lồng, pipet, ñèn gas, bô can,…

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp quan sát, thống kê sinh học

ðể xác ñịnh ñược các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chó mắc bệnh Care, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của chó

từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý ñầu tiên ðồng thời dựa vào các ñặc ñiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan, tiến hành phân tích, thống kê ñể ñưa ra những kết quả chính xác

Xác ñịnh chính xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý nghĩa giới hạn những mẫu bệnh phẩm, loại bớt những mẫu bệnh phẩm ít có ý nghĩa

và có ích trong việc phân tích những kết quả của các bước tiếp theo

Thống kê bệnh tích tế bào sau các thời gian gây nhiễm virus, xử lý số liệu và vẽ biểu ñồ biểu diễn sự nhân lên của virus bằng phần mềm Microsoft Office Excel

3.4.1 Phương pháp mổ khám

ðể xác ñịnh ñược những biến ñổi bệnh lý trong các cơ quan, tổ chức của chó mắc bệnh Care, chúng tôi tiến hành mổ khám những chó có triệu chứng lâm sàng của bệnh, và một số chó ñã kiểm tra có kết quả dương tính với virus Care

Chó bệnh ñược cố ñịnh cẩn thận, phóng tiết, lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, bóc tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể chó, quan sát và chụp ảnh Tiến hành thu mẫu các cơ quan: não, hạch ruột, ruột non, ruột già, phổi, hạch phổi… Mẫu ñược chia làm hai phần khác nhau: một phần ñược ngâm trong formol 10%, có ghi nhãn ñánh dấu ñể làm tiêu bản bệnh lý vi thể; một phần ñược bảo quản tươi trong tủ - 800C ñể sau ñó tiếp tục xử lý mẫu, phân lập virus

3.4.2 Phương pháp xử lý mẫu

ðối với mẫu ñể làm tiêu bản vi thể, các tổ chức ñược ngâm trong formol 10%, sau 24 giờ dung dịch formol ñược thay thế dung dịch formol 10% mới nhằm loại máu và cặn bẩn có trong tổ chức còn tươi Sau ñó, tiếp tục làm như vậy cho ñến khi bình formol chứa tổ chức ñược trong, không chứa cặn bẩn và màu lạ là ñạt yêu cầu, có thể bảo quản thời gian dài ñể làm tiêu bản vi thể hoặc lưu mẫu

ðối với mẫu dùng phân lập virus, các tổ chức ñược bảo quản và xử lý riêng ñể có thể phân lập virus từ các cơ quan riêng rẽ với nhau Mẫu bệnh phẩm ñược nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau ñó ñược ñồng nhất trong dung dịch DMEM (có bổ sung 10% kháng sinh) bảo quản ở -80oC cho ñến khi sử dụng

3.4.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể

Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ñổi ñại thể cần tiến hành làm tiêu bản ñể xác ñịnh bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm ñúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:

Cố ñịnh bệnh phẩm

Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% ñến khi bệnh phẩm

“chín”

Vùi bệnh phẩm

Tiến hành lần lượt các bước sau:

Rửa formol: Rửa bệnh phẩm dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h

ðưa mẫu vào hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng

Hệ thống máy chuyển ñúc mẫu tự ñộng gồm 12 bình