Phân lập và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép và biện pháp điều trị

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHẠM TUẤN ANH PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ CHÉP VÀ BIỆN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

PHẠM TUẤN ANH

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH

SINH HỌC CỦA VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA

GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ CHÉP

VÀ BIỆN PHÁP ĐIỀU TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

PHẠM TUẤN ANH

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH

SINH HỌC CỦA VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA

GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ CHÉP

VÀ BIỆN PHÁP ĐIỀU TRỊ Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 60 64 01 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS.TS NGUYỄN QUANG TUYÊN

2 PGS.TS PHẠM THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học

vị nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong bài luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2016

Tác giả

Phạm Tuấn Anh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn, với sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể Tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và cảm ơn chân thành tới:

Giảng viên hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và PGS.TS Phạm Thị Tâm, Viện Đại học Mở

Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá

trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn của mình

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo công tác tại Viện Đại học

Mở Hà Nội và Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ hoàn thành Luận văn này Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo và cán bộ nhân viên các trạm Thú y Văn Quan, Cao Lộc và Đình Lập thuộc Chi cục Thú y tỉnh Lạng Sơn, đã giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này

Trong quá trình thực hiện luận văn không tránh khỏi thiếu sót Kính mong được sự góp ý nhận xét của quý thầy cô để giúp Tôi có nhiều kinh nghiệm

bổ ích cho công việc và cuộc sống sau này

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2016

Tác giả

Phạm Tuấn Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích của để tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn A.hydrophila 4

1.1.1 Tình hình trên thế giới 4

1.1.2 Tình hình trong nước 4

1.2 Một số đặc điểm về vi khuẩn A hydrophila, gây bệnh xuất huyết trên cá chép 5

1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn A hydrophila 5

1.2.2 Cơ chế gây bệnh 8

1.3 Yếu tố độc tố và gen gây bệnh 9

1.4 Biểu hiện bệnh 10

1.6 Mùa vụ xuất hiện bệnh 13

1.7 Cơ chế tạo vacin phòng bệnh cho cá 13

1.8 Điều trị bệnh xuất huyết ở cá do vi khuẩn A hydrophila gây ra 13

1.8.1 Điều trị bằng kháng sinh 14

1.8.2 Sử dụng chất kích thích miễn dịch 15

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Địa điểm nghiên cứu 16

2.3 Thời gian thực hiện 16

2.4 Nội dung 16

2.5 Vật liệu 16

2.5.1 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 16

2.5.2.Môi trường và hóa chất 17

2.6 Phương pháp nghiên cứu 19

2.6.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 19

2.6.2 Phân lập vi khuẩn A.hydrophila 19

2.6.3 Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh vật học của các chủng A.hydrophila phân lập được 21

2.6.4 Xác định các yếu tố của gây bệnh của các chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập được 24

2.6.5 Phương pháp xác định độc lực và khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập được 26

2.6.6 Phương pháp tách độc tố 27

2.6.7 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập được 28

2.6.8 Phương pháp xử lí số liệu 28

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả điều tra tình hình dịch tễ bệnh xuất huyết trên cá chép tại 1 số điểm nuôi cá ở 1 số huyện của tỉnh Lạng Sơn 29

3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Aeromonas spp gây bệnh trên cá chép 31 3.3 Kết quả xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp và khả năng gây dung huyết của vi khuẩn A hydrophila 38

3.3.1 Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy 38

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung huyết thạch máu của vi khuẩn A hydrophila 41

3.3.3 Ảnh hưởng của độ pH đến khả sinh trưởng của vi khuẩn A

hydrophila 42

3.3.4 Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) đến khả sinh trưởng của vi khuẩn A hydrophila 44

3.3.5 Kết quả xác định độc lực của các chủng A hydrophila phân lập được trên động vật thí nghiệm 45

3.4 Kết quả xác định các gen độc tố của các chủng A hydrophila gây bệnh cho cá chép 47

3.5 Khả năng gây bệnh cho cá chép của chủng vi khuẩn phân lập 48

3.5.1 Kết quả gây nhiễm cá bằng độc tố Aerolysin 49

3.5.2 Gây nhiễm bằng vi khuẩn 50

3.6 Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập được 51

3.7 Kết quả điều trị thử nghiệm điều trị bằng kháng sinh 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

A hydrophila : Aeromonas hydrophila

Môi trường LB : Môi trường Luria-Bertani

Môi trường TSA : Môi trường tryptone casein soy agar

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Điều tra tình hình cá mắc bệnh xuất huyết tại các ao nuôi 30

Bảng 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn A Hydrophila 33 Bảng 3.3 Một số đặc tính sinh vật học điển hình của vi khuẩn A

hydrophila phân lập được trên cá chép 35

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng

của vi khuẩn A hydrophila chủng C5 39

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng

của vi khuẩn A hydrophila chủng C8 40

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung

huyết thạch máu của vi khuẩn A hydrophila C5 và C8 41

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và phát triển của

vi khuẩn 43 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng và phát

triển của vi khuẩn A hydrophila 45 Bảng 3.9: Kết quả xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn A

hydrophila trên chuột bạch 46

Bảng 3.10 Đặc điểm hai cặp mồi sử dụng phát hiện các gen độc tố của vi

khuẩn A hydrophila gây bệnh trên cá chép 47 Bảng 3.11 Kết quả gây nhiễm vi khuẩn A hydrophila Chủng … (số cá

gây nhiễm 30 con/một thí nghiệm về nồng độ 51 Bảng 3.12: Kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng

vi khuẩn A hydrophila phân lập được 52

Bảng 3.13: Kết quả thực nghiệm phác đồ điều trị 54

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình

Hình 3.1: Mổ khám cá chép nghi nhiểm vi khuẩn A hydrophila 29 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn A hydrophila mọc trên môi trường

thạch máu 33

Hình 3.3 Hình dạng vi khuẩn A hydrophila ở vật kính 100X 36 Hình 3.4 Kết quả phản ứng KIA trên thạch nghiêng của vi khuẩn A

hydrophila phân lập được 37 Hình 3.5 Kết quả phản ứng sinh Indol của vi khuẩn A hydrophila phân

Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ phân lập vi khuẩn A hydrophila từ các mẫu bệnh phẩm

lấy tại Lạng Sơn 34 Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng

của vi khuẩn A hydrophila chủng C5 39

Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng

của vi khuẩn A hydrophila chủng C8 39

Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và phát triển của

vi khuẩn A hydrophila 43

Biều đồ 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn A hydrophila 44

Biểu đồ 3.7: Hiệu quả một số phác đồ điều trị bệnh xuất huyết trên cá chép

nuôi tại tỉnh Lạng Sơn 56

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngành thủy sản Việt Nam được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn là ngành sản xuất hàng hóa lớn đi đầu trong hội nhập kinh tế quốc tế với kim ngạch xuất khẩu năm 2015 đạt 6,72 tỷ USD (Theo báo cáo tổng kết năm 2015 của Tổng cục Thủy sản) Với sự tăng trưởng nhanh và hiệu quả, thủy sản đã đóng góp tích cực trong chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông nghiệp, nông thôn, đóng góp hiệu quả cho công cuộc xóa đói, giảm nghèo, giải quyết việc làm cho trên 4 triệu lao động, nâng cao đời sống cho cộng đồng dân cư khắp các vùng nông thôn, ven biển, đồng bằng, trung du, miền núi…, đồng thời góp phần quan trọng trong bảo

vệ an ninh quốc phòng trên vùng biển đảo của Tổ quốc

Ở nước ta nghề nuôi trồng thuỷ sản nước ngọt đã có từ lâu đời, với nhiều đối tượng nuôi truyền thống được nuôi phổ biến như: cá trắm, cá trôi, cá mè,

cá chép, cá rô phi,… cá chép là đối tượng nuôi quan trọng trong ao hồ, đầm, ruộng, lồng bè, là loài cá cho giá trị kinh tế cao, thịt cá thơm ngon được nhiều người nuôi và người tiêu dùng ưa thích Cá có thể nuôi đơn hoặc nuôi ghép đều cho năng suất và hiệu quả rất cao Người dân chủ yếu nuôi xen ghép các đối tượng này theo mô hình VAC hoặc nuôi lồng theo quy mô nhỏ để cung cấp nguồn thực phẩm trong gia đình hay trong một vùng nhỏ

Lạng Sơn có diện tích mặt nước tự nhiên là 8.545ha, trong đó có 1300 ha

có thể sử dụng đưa vào nuôi trồng thủy sản Có 03 hệ thống sông chính là: sông

Kỳ Cùng, sông Thương, sông Ngắn Quảng Ninh; hệ thống các hồ đập được quan tâm đầu tư hiện trên địa bàn có 271 hồ chứa, 692 đập, 96 trạm bơm điện, bơm thủy luân và có khoảng 2.340 công trình tiểu thủy Nghề nuôi trồng thủy sản của Lạng Sơn cũng nhờ đó mà ngày càng phát triển, theo số liệu của trung tâm thủy sản Lạng Sơn từ năm 2006 đến nay, diện tích nuôi trồng thủy sản được mở rộng, duy trì từ 900ha lên 1191ha, sản lượng thủy sản liên tục tăng, năm sau lớn hơn năm trước: năm 2006 là 1151 tấn; năm 2008 là 1136 tấn, năm 2013 là 1300 tấn,

năm 2015 là 1500 tấn Giá trị sản xuất thủy sản hàng năm đều tăng: năm 2006 đạt 23.973 triệu đồng, 2007 đạt 27.506 triệu đồng, năm 2010 đạt 37.316 triệu đồng, năm 2013 đạt 43.340 triệu đồng, năm 2015 đạt 47.688 triệu đồng Với các loại cá được nuôi chủ yếu là trắm cỏ, rô phi, chép lai…

Cùng với sự tăng trưởng của ngành nuôi trồng thuỷ sản và nghề nuôi cá nước ngọt nói riêng, dịch bệnh trên cá ngày một gia tăng, ảnh hưởng lớn đến hiệu quả kinh tế, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu tới sức khoẻ của người tiêu dùng Có rất nhiều nguyên nhân gây bệnh trên cá, có thể do virut, vi khuẩn, ký sinh trùng Trong đó, vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh khá quan trọng, là trở lực chủ yếu kìm hãm sự phát triển và mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản Hầu hết các vi khuẩn gây bệnh là một phần của hệ

vi sinh vật bình thường trong môi trường (nước biển, ao , hồ, sông rạch) và nói chung các vi khuẩn này được xem là tác nhân gây bệnh thứ cấp hoặc tác nhân gây bệnh cơ hội Trong các nghiên cứu về dịch bệnh trên cá, xác định được vi

khuẩn gây bệnh chủ yếu là những vi khuẩn Gram âm như: A hydrophila, A sobria, Pseudomonas, Vibrio,…

Vi khuẩn A hydrophila là tác nhân gây bệnh xuất huyết đốm đỏ trên hầu

hết các loài cá nuôi ở nước mặn, ngọt và lợ với tỷ lệ chết cao Vấn đề đặt ra là, cần có sự hiểu biết về các đặc tính sinh học của vi khuẩn này để đưa ra các biện pháp ngăn ngừa tác hại của bệnh, vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Phân lập và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép và biện pháp điều trị”

2 Mục đích của để tài

- Nắm được tình hình dịch tễ của bệnh xuất huyết trên cá chép do vi

khuẩn A hydrophila tại Lạng Sơn

- Xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn A hydrophila gây bệnh trên

cá chép

- Xây dựng biện pháp điều trị bệnh góp phần nâng cao hiệu quả nghề nuôi cá

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Bổ sung những hiểu biết khoa học cơ bản về đặc điểm dịch tễ học của bệnh xuất huyết trên cá chép

- Kết quả nghiên cứu của đề tài bổ sung thêm nguồn tư liệu cho những nghiên

cứu về A hydrophila trên cá chép nói riêng và trên thủy sản nói chung

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Kết quả là cơ sơ khoa học cho việc xây dựng các biện pháp phòng và điều trị bệnh xuất huyết trên cá chép

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn A.hydrophila

1.1.1 Tình hình trên thế giới

Dịch bệnh do vi khuẩn Aeromonas spp di động đã xuất hiện rộng rãi và

khá phổ biến vào thế kỷ XIX

Năm 1891, Sanarelli đã có nghiên cứu đầu tiên về sự bùng nổ dịch bệnh này ở cá chình Ban đầu, nguyên nhân gây bệnh được phỏng đoán do các vi

sinh vật gây ra hoặc do vi khuẩn Vibrio anguillarum Sau đó, Schaperclaus

(1929) [79] đã mô tả bệnh này xuất hiện ở cá chép với dấu hiệu bệnh lý là chứng

sưng lên của bụng và ông phân lập được loài vi khuẩn gây bệnh là Bacterium punctatum Trong khi đó, Toranzo và cs (1989) [87] đã tìm thấy A sobria khi

dịch bệnh này bùng nổ trên cá Mòi dầu hay cá Hồi nước ngọt Vào lúc đó, một hướng nghiên cứu khác đưa ra nguyên nhân chủ yếu gây bệnh phù trên cá chép

được xem là do virus và vi khuẩn A hydrophila (trước đây là B punctatum) là

tác nhân thứ cấp gây ra bệnh (Phạm Công Hoạt, 2012)[12]

1.1.2 Tình hình trong nước

Năm 972-1973, bệnh lở loét được phát hiện trên cá lóc ở An Giang và Đồng Tháp Năm 1975, bệnh đốm đỏ đã thấy xuất hiện đầu tiên tại Đồng Bằng sông Cửu Long với mức độ nhẹ nhưng đến năm 1983 bệnh đã bùng nổ thành dịch bệnh lở loét Dịch bệnh đã lan rộng khắp các vùng sông Tiền, sông Hậu, sông Đồng Nai, sông Sài Gòn với tỷ lệ cá bị nhiễm bệnh từ 60% - 70% (Đỗ Thị Hòa và Nguyễn Thị Muội, 2004) [10]

Từ năm 1986 đến 1997, bệnh xuất huyết đốm đỏ đã xuất hiện và bùng

nổ trở thành dịch bệnh cho cá trắm cỏ nuôi lồng Trong năm 1997, có khoảng 4.000 trong số 5.000 lồng nuôi cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ gây thiệt hại khoảng 500.000 USD (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I., 1998, trích dẫn bởi www.fistenest.gov.vn cập nhật ngày 31/10/2008) Những thiệt hại này không

những ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống của người dân mà còn để lại những hậu quả không nhỏ về kinh tế trong khu vực

Năm 1994 đến 1998, bệnh đã xuất hiện ở hầu hết các ao nuôi cá trắm cỏ

bố mẹ, ao nuôi thương phẩm Năm 1999 đến nay, dịch bệnh vẫn xảy ra hằng năm với mức độ khác nhau trên nhiều địa phương, gây thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi cá trắm cỏ (Phạm Công Hoạt, 2012) [12]

Năm 1999-2001 nhóm tác giả Phan Thị Vân, Nguyễn Thị Hà, Kim Văn Vạn, Phạm Thị Yên, Trần Thị Kim Chi [33] thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I đã tiến hành nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh đốm đỏ

trên cá trắm cỏ với kết quả cho thấy A hydrophila, A caviae chính là tác nhân

gây bệnh

Trước tình hình thời tiết đầu năm 2009 diễn biến phức tạp: nhiệt độ thấp cộng mưa phùn kéo dài là điều kiện thuận lợi cho nấm, vi khuẩn, một số vi sinh vật có hại ở đáy ao phát triển mạnh và xâm nhập vào mang, da, hệ tiêu hoá của

cá để gây ra bệnh xuất huyết làm cá chết hàng loạt, tỷ lệ chết cao đặc biệt nguy hiểm đối với cá chép, cá thịt chiếm 30-70%, cá giống chiếm 100% (Phạm Minh Thành và Nguyễn Văn Kiểm 2009) [28]

1.2 Một số đặc điểm về vi khuẩn A hydrophila, gây bệnh xuất huyết trên cá chép

* Phân loại vi khuẩn Aeromonas hydrophila:

1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn A hydrophila

A hydrophila là vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá, còn có tên gọi

khác là bệnh đốm đỏ, hoặc bệnh lở loét trên cá Nó thường tìm thấy trong các khu vực có khí hậu ấm, ngoài ra chúng ta còn tìm thấy trong muối tươi, biển và

nơi cửa sông, được phân lập từ người và động vật Vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên cá, người và động vật lưỡng cư như ếch, thằn lằn, cá sấu (Trust

và cs., 1974) [88]

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái

Nhận dạng về đặc điểm hình thái vi khuẩn A hydrophila là rất cần thiết

cho việc chuẩn đoán trong phòng thí nghiệm vì có sự khác biệt trong dịch tễ học, kháng sinh và tính nhạy cảm lâm sàng có thể có ý nghĩa giữa các loài Ngoài ra đó còn là một điều cần thiết để biết được sự tiến hóa của các loài

Aeromonas di động, có ý nghĩa trong quá trình tiến hóa của loài A hydrophila

thuộc nhóm vi khuẩn gram (-), thân thẳng, dạng hình que ngắn và kết thúc bằng hai đầu tròn, di động được nhờ có một tiên mao, không có khả năng hình thành bào tử Vi khuẩn có kích thước 0,5 x 1- 1,5 μm Chính nhờ cấu trúc của vi khuẩn như vậy, đã dẫn đến kết quả của những phản ứng sinh hóa, những phản ứng được thực hiện với mục đích giám định vi khuẩn mà ta đã tìm và phân lập được (Von Gravenitz và cs.,1968) [91]

Vi khuẩn A hydrophila cũng giống như những vi khuẩn khác, trên mỗi

môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ có hình thái khuẩn lạc khác nhau, thể hiện đặc tính khác nhau (Boulanger và cs., 1977) [42]

Trên môi trường đặc hiệu - môi trường thạch máu có bổ sung kháng sinh ampicilin và máu cừu, khuẩn lạc mọc trên môi trường này có màu trắng đục, kích thước 0,5-1cm, có khả năng gây dung huyết trên thạch máu do cơ chế độc lực của nó, tạo aerolysin Cytotoxic enterrotoxin (ATC) phá hủy các tế bào hồng cầu tạo nên các vòng sáng trắng trên bề mặt thạch (kiểu dung huyết beta) hoặc vòng sáng có ánh xanh (kiểu dung huyết alpha) (Allan và cs., 1981) [37]

Còn trên môi trường Rimsof khuẩn lạc có màu vàng trên nền thạch xanh Trên môi trường không đặc hiệu TSA, khuẩn lạc có màu vàng đục Trên môi trường LB khuẩn lạc bóng, trong, có màu nâu nhạt (Baba và cs.,

1988) [40]

1.2.1.2 Đặc điểm sinh học

A hydrophila là một trong 6 loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm nhất trong

họ Aeromonas di động, nó có thể tồn tại và phát triển trong bất cứ môi trường

nào, dù đó là môi trường hiếu khí hay môi trường kị khí, có thể là môi trường nước ấm, môi trường nước lạnh Đặc biệt loài này rất khó bị tiêu diệt, nó có thể

chịu nhiệt rất cao, lên tới 42ºC Mặc dù bệnh liên quan tới vi khuẩn A hydrophila được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm với những loài cá nuôi

theo mô hình thâm canh trên quy mô công nghiệp, nhưng nó cũng có thể ảnh hưởng đến các loài cá nuôi trong tự nhiên ở các hồ, ao, và nó cư trú trong hệ đường ruột của cá khỏe mạnh (Trust và cs., 1974) [88] Vi khuẩn này phổ biến hơn trong môi trường nuôi cá nước ngọt Nó được tìm thấy cả trong tầng nước

đứng và lớp trên cùng của lớp trầm tích A hydrophila có khả năng thích nghi

với môi trường có biên độ về pH rộng, nhiệt độ, độ đục, và độ mặn cao (T C Hazen, 1979) [85]… Nhiệt độ tối ưu có thể phụ thuộc vào các chủng đặc trưng

đã được nghiên cứu, nhưng thường là vào khoảng 25-35oC (Ventura và cs., 1987) [90]

Theo một số nghiên cứu cho thấy, vi khuẩn A hydrophila có thể sống và

phát triển ở nhiệt độ cao, lên tới 42ºC và ở nhiệt độ thấp như 4ºC nó cũng phát triển Đây là loại vi khuẩn gây bệnh trên cá nước ngọt nhưng cũng có khả năng gây bệnh trên cá nước mặn và cá nuôi ở vùng nước lợ, do đó mà nó có thể tồn tại trong môi trường có pH 4,5 - 8,5, nồng độ muối là 0,5% - 5% (Ventura và cs., 1988) [89]

1.2.1.3 Đặc tính sinh hóa

Davis và cs (1981) [46] nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào và thấy,

chủng A hydrophila có khả năng thủy phân tinh bột, casein, DNA, gelatin, tế

bào máu, huyết thanh,…nhưng không thủy phân xenlulo và pectin

Nghiên cứu về đặc tính sinh hóa và đặc tính enzym của vi khuẩn thuộc

họ Aeromonas nói chung và A hydrophila nói riêng, các tác giả đã tìm ra rất

nhiều phương pháp để đánh giá các chỉ tiêu này ví dụ như dùng các phản ứng

sinh hóa có khả năng sử dụng đường, sinh khí hay phân giải protein…Một trong những mục đích của việc làm các phản ứng sinh hóa là để định danh và phân loại vi khuẩn Các xét nghiệm sinh hóa này nhằm đánh giá khả năng lên men đường phản ứng carbohydrates được thử nghiệm bao gồm gentobiose, glucamine, glucose1 - phosphat, glucose 6 -phosphate, Inulin, lactulose, D-lyxose, maltotriose, palatinose, se-doheptulose, stachyose, D-tagatose, và xylitol (Zhang và cs., 2000) [95]

1.2.2 Cơ chế gây bệnh

Có một số bằng chứng cho rằng loài vi khuẩn này có khả năng gây bệnh bởi một số protein ngoại bào như: aerolysin, lypase, chitinase, amylase, gelatinase, hemolysins, enterotoxin, caseinase, elastase, lecithinnase, deoxyribonuclease và protease cùng với các chất gây độc cho tế bào, độc tố đường ruột và chất làm tan máu Khi tấn công vào cơ thể vật chủ, đầu tiên giống

vi khuẩn gây bệnh này bám vào các tế bào hồng cầu, theo hệ thống tuần hoàn lây nhiễm trên toàn cơ thể cá Vi khuẩn gây bệnh sẽ tiết ra enzyme gây rối loạn quá trình trao đổi chất của tế bào vật chủ Tuy nhiên người ta vẫn chưa biết được cơ chế gây ra bệnh cụ thể Gần đây, người ta đã đề xuất cơ chế gây bệnh TTSS (Type III secretion system), đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra bệnh của A hydrophila TTSS như là những chiếc máy chuyên tiết ra các protein độc rồi đưa trực tiếp vào tế bào vật chủ Các yếu tố này làm phá vỡ tế bào chức năng của vật chủ theo cách có lợi cho sự xâm nhập của chúng Trái ngược với cách tiết một cách bình thường thì hệ thống TTSS được kích hoạt khi tác nhân gây bệnh tiếp xúc với tế bào vật chủ Độc tố ADP- ribosylation được tiết ra bởi một số vi khuẩn gây bệnh rồi di chuyển qua TTSS

và đưa vào tế bào vật chủ dẫn đến sự gián đoạn của NK-kB, phá hoại các tế bào chủ chốt, gây hại cho cytoskeletal và apoptosis (Gado và cs., 1998) [54]

Do cấu trúc và đặc tính của vi khuẩn này phức tạp, khi cùng tồn tại với

vi sinh vật nào đó hoặc khi xâm nhập vào tế bào vi sinh vật, vi khuẩn này sẽ

gây hại cho vi sinh vật ấy Khi vào cơ thể vật chủ, đầu tiên nó sẽ đi qua các mạch máu đến cơ quan đích đã xác định trước, như thận, tim, ruột, gan…rồi tiết độc tố aerolysin Cytotoxic enterrotoxin(ATC) có khả năng gây bệnh cho vật chủ Aerolysin là một chất độc có khả năng gây hư hại tế bào Vì vậy chúng được coi là tác nhân gây bệnh cơ hội, nghĩa là chúng chỉ lây nhiễm với những phản ứng miễn dịch bị suy yếu (Mishra và cs., 1998) [65]

1.3 Yếu tố độc tố và gen gây bệnh

Phát hiện các yếu tố độc tố là một phần quan trọng trong việc phát hiện

khả năng sinh bệnh của vi khuẩn A hydrophila Có một số nghiên cứu cho rằng

yếu tố gây bệnh là do các ngoại độc tố như độc tố đường ruột và các enzym ngoại bào như lipase và các protease Nhưng kết quả phân tích do các phản ứng sinh hóa cho thấy không chính xác (Boulanger và cs., 1977) [42]

Vi khuẩn Aeromonas spp có một số độc tố như aerolysin, haemolytic,

độc tố tế bào cytotoxic và độc tố đường ruột enterotoxic Khi phân tích 15 mẫu

cá đã thấy 6 mẫu chứa độc tố là của vi khuẩn A hydrophila (40%) và được nuôi

cấy trên môi trường MRS (Ventura và cs., 1988) [89]

Các phản ứng PCR xác định rõ ràng chủng A hydrophila có khả năng

sản xuất ra gen độc tố aerolysin và có thể đựơc ứng dụng trong các xét nghiệm

độc tính đặc trưng cho các loài Aeromonas có khả năng gây dung huyết (T C Hazen, 1979) [85] Gen độc tố aerolysin, được tạo ra bởi A hydrophila là một

protein ngoại bào tan trong nước, có khả năng gây dung huyết Aerolysin liên kết với thụ thể SPE-cific glycoprotein trên bề mặt tế bào eukaryot Các độc tố aerolysin hình thành lỗ đi qua màng tế bào vi khuẩn như một preprotoxin có chưa một vài peptit tín hiệu loại bỏ cotraslationally Do đó protoxin là tiền thân của proaerolysin (là một protoxin không hoạt động), sau đó được kích hoạt bằng cách loại bỏ protein của khoảng 25 amino acid của nhóm cacboxy (Davis

và cs., 1981) [46] Các gen preproaerolysin được nhân đôi nhờ thể truyền

E.coli, và từ đó ta xác định được trình tự của các Nucleotide Mồi có bản chất

là một oligonucleotide được sử dụng trong phản ứng PCR-để xác định trình tự

gen Aer có độ dài 209-bp Mồi xuôi và mồi ngược được gọi là aerB và aerC

Các đoạn mồi được thiết kế bởi sự phân tích của máy tính, bằng các trình tự

của gen Aer đã được công bố Kết quả của PCR đã cho thấy có sự hoạt động của gen Aer trong chủng A hydrophila gây dung huyết theo kiểu beta-

hemolytic (Ventura và cs., 1988) [89]

1.4 Biểu hiện bệnh

A hydrophila được coi là tác nhân thứ cấp gây bệnh xuất huyết Gần đây

Huizinga và cs (1979) [55] xem xét lại nguyên nhân của bệnh xuất huyết và sự

xuất hiện của vi khuẩn A hydrophila 96% trong số cá bị tổn thương, những tổn

thương bắt đầu bởi enzym của vi khuẩn phân giải gelatin Tùy thuộc vào các yếu tố gây độc cũng như sức đề kháng của cá mà biểu hiện bệnh là khác nhau Ngoài ra còn phụ thuộc vào sự có mặt hay vắng mặt của yếu tố nhiễm khuẩn hoặc nhiễm trùng huyết Bệnh xuất hiện dưới hai thể, với các triệu chứng khác nhau:

- Thể nhiễm trùng: thường xuất hiện trên cá chép, trắm cỏ, trê, tai tượng, Cá bệnh có dấu hiệu ban đầu là bơi không định hướng, tách đàn, kém ăn hoặc

bỏ ăn, da cá bị sậm màu, cá bị mất nhớt do hệ enzym gelatinase thủy phân gelatin có trong vẩy cá và trở nên khô (còn gọi là bệnh tuột nhớt) Tỷ lệ chết ở thể nhiễm trùng máu đối với cá thịt từ 30-70% và có thể đến 100% đối với cá giống

- Thể nhiễm trùng toàn thân: các đốm đỏ xuất hiện trên thân cá, gốc vây, quanh miệng rồi biến thành vết loét ăn sâu vào bên trong, vây bị rách và dần dần cụt đi, bụng trướng to, xoang bụng bị viêm, chứa nhiều dịch nhầy có mùi hôi, xuất huyết nặng ở mô mỡ, tuyến sinh dục, ruột, dạ dày và bóng hơi, thuỷ tinh thể bị đục và lòi ra ngoài, túi mật sưng to, gan đổi sang màu xanh tái, ruột

bị loét

Cơ quan thường bị ảnh hưởng bởi bệnh này bao gồm các mang, thận,

gan, lá lách, tuyến tụy, và xương cơ bắp (Bach và cs., 1978) [41]

1.5 Nguồn lây bệnh

Ao cá, cá bệnh, ếch bệnh, (cũng như ếch nghỉ đông) cùng các loài cá khác,

có thể trở thành nơi ủ bệnh nhiễm trùng Một số tảo và các loài động vật nguyên sinh khác nữa (Kawakami và cs., 1978) [60] Trong nghiên cứu ở hồ chứa,

Huizinga và cs (1979) [55] tìm thấy mật độ vi khuẩn A hydrophila khi phân lập

từ các loài cá, rùa, cá sấu, và ốc sên, tôm càng xanh, ngoài ra người ta còn tìm thấy

vi khuẩn này trên người

* Bệnh trên cá: Bệnh xuất huyết thường gặp trên các đối tượng cá nước ngọt Ngoài ra thì một số loài cá nước mặn cũng có thể nhiễm loài vi khuẩn

này Rahim và cs (1985) đã phân lập được A hydrophila trên 5 loài cá nước

lợ, mặn: Anguillaris platosus, Lates calcarifer, Epinephelus megachir, Labeo ruhita và Serotherodon nilotica

Osborne và cs (1989) [70] tìm thấy mật độ Aeomonas di động cao trong

thời gian giữa mùa hè khi chất diệp lục trầm tích phụ và nhiệt độ nước cao nhất, điều này có vẻ tương quan với nồng độ lớn vi khuẩn trong dạ dày và trên da cá đối Các tác giả cho rằng, cá đối ủ mầm bệnh trong ruột và dạ dày Do đó, ruột

có thể coi là cổng thông tin, là nơi vi khuẩn có thể xâm nhập Trong điều kiện căng thẳng, nó có khả năng phát triển bệnh

- Cá ba sa (Pangasius bocourti): giải phẫu bên trong cho thấy: mô mỡ cá

xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to và có màu xanh dương, bóng hơi căng phồng, thận sưng, ruột, dạ dày, tuyến sinh dục, bóng hơi đều xuất huyết Có trường hợp 2 đoạn ruột lồng vào nhau (Trần Thanh Phú, 2009) [19]

- Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn, nổi đầu và “treo râu”, đầu hướng lên trên vuông góc với mặt nước (Phạm Công Hoạt và cs., 2011) [11]

- Cá bống tượng da mất hết nhớt, nên còn gọi là bệnh “tuột nhớt” (Phạm Công Hoạt, 2012) [12]

* Bệnh trên ếch: Bệnh xuất huyết trên ếch và các loài lưỡng cư khác thường xảy ra vào mùa xuân lúc nhiệt độ nước tăng lên Sức đề kháng của đối tượng ở giai đoạn này bị giảm xuống do thiếu máu và các protein huyết tương

giảm một cách đáng kể sau một thời gian dài mùa đông (Faktorovicha và K A., 1969) [52]

* Bệnh ở cá sấu: Khi cá sấu bị nhiễm vi khuẩn A hydrophila thì có một số

dấu hiệu biểu hiện như: chân bị phù, chậm chạp, bỏ ăn, có dịch trong bao tử, da chuyển vàng, lách sưng to mềm nhão Lách xung huyết rất nặng, cũng có nhiều hạt sắc tố màu nâu vàng, có những vùng hoại tử Gan bị viêm (tập trung nhiều bạch cầu), xung huyết và có rất nhiều các hạt sắc tố màu nâu vàng (Trust và cs., 1974) [88]

* Bệnh ở tôm: Bệnh do vi khuẩn A hydrophila gây ra ở tất cả các giai đoạn

phát triển của tôm, nhất là tôm phải sống trong môi trường nước bị nhiễm bẩn, thiếu thức ăn hoặc bị chấn thương cơ học (Paniagua và cs., 1990) [71],

Tôm bị bệnh đốm nâu thường kém ăn, trên thân xuất hiện các đốm, lúc đầu có màu nâu, về sau chuyển dần sang màu đen Vết đen có thể ở thân, mang, râu, chân với những hình dạng không nhất định Ogara và cs., (1998) [68] Tuy vết đen có ở lớp biểu mô ngoài, nhưng lại nằm phía trong của lớp vỏ kitin, nên mỗi khi tôm lột vỏ các vết bệnh này vẫn không mất đi Tôm bị nặng thường gầy yếu, ít hoạt động, nằm im ở đáy ao, râu, chân bị ăn cụt và chết rải rác (gọi

là bệnh hoại tử hay bệnh đốm nâu ở tôm càng xanh) Bệnh này đã từng gây thiệt hại không nhỏ ở nhiều địa phương nuôi tôm càng xanh Những ao nuôi tôm càng xanh bị bệnh, năng suất giảm từ 20- 30% (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2006) [17]

* Bệnh ở người: Con người cũng có thể bị nhiễm loài vi khuẩn này thông qua các loài thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn này như: hải sản, thịt, cá và thậm chí trong một số rau củ (De Figueredo và cs, 1977) [47]

Đặc điểm bệnh do vi khuẩn A hydrophila gây ra cho người khác với các

loài khác như cá, lưỡng thê Khi xâm nhập vào người nó gây ra bệnh viêm ruột

và dạ dày Biểu hiện bệnh lý của nó giống với bị dịch tả, hay một dạng bệnh lí của viêm dạ dày và ruột, gây ra hiện tượng phân lỏng, kết hợp với máu và các

dịch nhầy Loài này còn có thể xâm nhập vào não người và gây ra viêm não, xâm nhập vào biểu mô tạo nên những chỗ viêm, sưng trên da (Von Gravenitz

và cs., 1968) [91]

1.6 Mùa vụ xuất hiện bệnh

Ở Hoa Kì, dịch bệnh thường xuất hiện vào mùa xuân và đầu mùa hè, ở các loại cá nước ấm (Osborne và cs., 1989) [70]

Thời gian mà cá dễ mắc bệnh là vào mùa mưa Tỷ lệ thiệt hại từ 7-10% Vào thời điểm mùa mưa (tháng 9) và thời điểm giao mùa (tháng 11) thì chủng

A hydrophila có tần suất xuất hiện cao nhất (100%) Vi khuẩn A hydrophila

gây bệnh trên cá nước ngọt như cá lóc, trê, chép, trắm cỏ, tai tượng, basa, tra, bống tượng (Bùi Quang Tề, 1998) [22]

Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng thường tập trung vào mùa Xuân và mùa Thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh thường xuất hiện nhiều vào đầu mùa mưa (giao mùa) Tỉ lệ tử vong do bệnh này ở động vật thủy sản thường từ 30-70% (Phạm Công Hoạt, 2012) [12]

1.7 Cơ chế tạo vacin phòng bệnh cho cá

Loài Aeromonas di động là loài vi khuẩn gây bệnh trên cá, đa dạng về

nhóm kháng nguyên cũng như số lượng kháng nguyên trong cùng một nhóm

Số lượng kháng nguyên chủ yếu thuộc nhóm kháng nguyên H và O Ewing và

cs (1961) [51] miêu tả nhóm kháng nguyên O12 và kháng nguyên H9

Schachte (1978) [78] chỉ ra rằng, dùng vacxin tiêm hoặc ngâm sẽ thích sản xuất kháng thể

Do sự đa dạng về kháng nguyên giữa các nhóm vi sinh mà có những cách thức bổ sung khác nhau bao gồm việc nghiên cứu phát triển vacxin tiêm polyvalent, chống lại độc tố ngoại bào (toxoid), và sự phát triển của loại vacxin tổng hợp của tế bào kháng nguyên với toxoid Liu (1961) [63] lưu ý rằng, các hoạt động sinh học của độc tố ngoại bào sinh ra từ vi

khuẩn Aeromonas di động được trung hòa bởi một huyết thanh miễn dịch duy nhất chống lại vi khuẩn A hydrophila

1.8 Điều trị bệnh xuất huyết ở cá do vi khuẩn A hydrophila gây ra

(Thune, R L và J A Plumb, 1982) [86] Vi khuẩn A hydrophila cũng nhạy

cảm với các amino acid có nguồn gốc từ hydroximates và H2O2 Mặc dù kháng

sinh kiểm soát được A hydrophila nhưng ở mức độ nào đó, một nghiên cứu

cho thấy vi khuẩn đã kháng lại các tác nhân hóa trị liệu khi chúng được sử dụng

trong một khoảng thời gian dài Nhiều dòng A hydrophila được phân lập đã

có sự đề kháng với các loại kháng sinh ampicillin, carbenicillin, erythromycin, gentamicin, penicillin, tetracycline, nitrofuradantoin, ormetoprim-sulfadimethoxine, sulfamethoxazole-trimethoprim và triple sulfa (Wei Hua Chu, 2008) [92]

Tỷ lệ kháng lại kháng sinh ngày càng cao đối với nhóm A hydrophila được phân lập từ những loài cá nuôi, do áp lực mạnh về việc sử dụng hóa trị liệu trong nuôi cá công nghiệp Trong khi đó, những dòng A hydrophila được phân lập từ cá tự nhiên thì không có sự kháng lại kháng sinh

Hơn thế nữa, phần lớn những nhà nghiên cứu đã tìm thấy những plasmid có tính đối kháng đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành những dòng kháng kháng sinh) (Rao và cs.,1977) [76] Kích thước phân tử plasmid kháng

trong vi khuẩn A hydrophila từ 3 - 150 Kb Việc hạn chế sử dụng thuốc để điều

trị vi khuẩn cho cá nuôi để giảm sự phát triển những plasmid kháng trong vi khuẩn Do sự kháng lại kháng sinh cao nên khi tiến hành các phương pháp trị

liệu lâm sàng rất khó để kiểm soát những dòng A hydrophila được phân lập từ

những hệ thống nuôi thủy sản (Kingma, 1978) [61] Sự phát triển những dòng

kháng kháng sinh là do việc sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh và những loại kháng sinh có hiệu quả cao Ngoài ra, việc lây truyền những dòng vi khuẩn kháng kháng sinh đến con người hay động vật trên cạn đang là mối nguy cao đến sức khỏe cộng đồng Ngoài ra, việc gia tăng kháng sinh sẽ làm tăng chi phí trong nuôi trồng thủy sản công nghiệp Vì vậy việc quan trọng là giảm nguyên nhân gây bệnh và giảm sử dụng thuốc đến tối thiểu (Zacaria J và cs., 2009) [94]

[66] Sự gia tăng đường trong huyết thanh, cholesterol, protein tổng số, số lượng

tế bào máu đỏ, hemoglobin và hematocrit đã được tìm thấy trong A hydrophila lây nhiễm trên cá Chép sau khi được xử lý với dịch chiết từ lá cây Bột của hạt cây thảo dược (Achyranthes aspera) đã được bổ sung vào chế độ cho

ăn đã làm tăng khả năng miễn dịch bẩm sinh và sự kháng lại A hydrophila ở cá

Chép Ấn Độ (Ventura M T and J M Grizzle, 1988) [89]

Một số dịch chiết từ những động vật biển có màng áo như Mực biển (Ecteinascidia turbinate) để làm tăng miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể trên

cá Chình Mỹ (A rostrata) chống lại A hydrophila Một số báo cáo cho thấy polysaccharide có khả năng tăng đáp ứng miễn dịch của cá chống lại A hydrophila như tỷ lệ sống cá Rô Phi và cá Trắm Cỏ khi được tiêm một số polysaccharide trước khi bị lây nhiễm A hydrophila (Zhang và cs, 2000) [95].

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn A hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép

2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Địa bàn nghiên cứu: Hộ chăn nuôi cá tại một số huyện tỉnh Lạng Sơn

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Viện Đại học mở Hà Nội, Viện khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên

2.3 Thời gian thực hiện

- Xác định yếu tố gây bệnh và gen độc tố, độc lực và khả năng gây bệnh

của các chủng chủng A hydrophila phân lập được

- Xác định tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng A hydrophila phân

- Máy chạy điện di protein, DNA

- Bể nuôi cá, các thiết bị nuôi như máy sục khí, bông lọc,…

2.5.2.Môi trường và hóa chất

2.5.2.1 Môi trường

 Brain Heart Infusion (BHI) Broth:

Calf Brain-Beef Heart Infusion (Solids)

Pancreatic Digest of Gelatin Dextrose

Sodium Chloride Disodium Phosphate

17,5 10,0 2,0 5,0 2,5

 Peptone kiềm:

NaCl Peptone

1%

1%

 Môi trường nuôi cấy đặc hiệu của vi khuẩn:

Blood agar Máu cừu Ampicilin

40g/1l

6-7%

0,1%

 Môi trường thạch thường LB:

Tryptone Cao nấm men NaCl

KH2PO4 NaCl

- Hóa chất cho phản ứng PCR: Taq polymerase, MgCl, PCR buffer, mồi,

dNTP, dầu khoáng ,DNA của vi khuẩn A hydrophila, 1 cặp primer bắt cặp với

đoạn gen đặc hiệu DNA và nhân lên

- Hoá chất điện di DNA, protein: acrylamide 12%, Agarose 0,8%, glycine, EDTA, tris base, tris HCl, coomasie blue, ethidium bromide

- H2O2, NaOH, HCl

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptivestudy) dịch tễ học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm của (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [27], (Nguyễn Văn Thiện và cs., 2005) [29]

2.6.1.1 Phương pháp chọn mẫu điều tra

- Điều tra theo phương pháp điều tra thống kê ngẫu nhiên, mẫu chùm nhiều bậc: Chọn ngẫu nhiên huyện trên tỉnh, mỗi huyện chọn 3 xã

- Trực tiếp điều tra qua chẩn đoán lâm sàng, kết hợp với mổ khám những

cá bị chết có biểu hiện bệnh xuất huyết

- Điều tra cá chết vì bệnh xuất huyết theo các mùa: mùa xuân, mùa hè, mùa thu, mùa đông và theo từng nhóm môi trường ao nuôi

- Phỏng vấn chủ ao nuôi về những thông tin cần thiết

- Thông tin điều tra được ghi vào các phiếu điều tra

2.4.1.2 Các phương pháp đo lường trong dịch tễ

2.6.2 Phân lập vi khuẩn A hydrophila

- Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm:

Các mẫu cá chép có biểu hiện bơi lội không định hướng, mắt lồi, rách, cụt vây, tuột nhớt, tuột vảy, mang nhợt nhạt, có các chấm xuất huyết trên vây, vùng da tuột vảy nghi bị bệnh xuất huyết đốm đỏ lấy từ các ao nuôi khác nhau ở huyện Văn Quan, Cao Lộc, Đình Lập của tỉnh Lạng Sơn được đưa về phòng thí nghiệm để phân lập vi

khuẩn Aeromonas spp từ các mô: gan, thận, tim, ruột.

- Phương pháp phân lập vi khuẩn A Hydrophila: Theo quy trình sau

Quy trình phân lâp:

Mẫu cá chết, tiến hành giải phẫu bằng bộ giải phẫu, lấy các bộ phận tim, gan, thận, ruột nghiền nát trong túi PE đã tiệt trùng

Tăng sinh mẫu trong môi trường BHI môi trường dinh dưỡng tốt cho việc phát triển của vi khuẩn, hoặc môi trường Peptone kiềm trong thành phần môi trường bổ sung 1% muối Tỷ lệ tăng sinh: 25g mẫu trong 250ml môi trường Nuôi trong tủ ấm 30-37ºC trong 20-24h Khi vi khuẩn đã được tăng sinh khối, được cấy sang môi trường thạch máu Nuôi trong 24-36h ở nhiệt

độ phòng

Khi khuẩn lạc mọc đầy đủ, chọn khuẩn lạc điển hình to tròn, màu trắng đục hơi vàng, với các kiểu dung huyết khác nhau: dung huyết theo kiểu beta Đem nhuộm gram, quan sát hình thái vi khuẩn theo phương pháp Hucker’s Modification, dưới kính hiển vi, vật kính dầu Từ những khuẩn lạc điển hình

đó, cấy chuyển sang môi trường thạch máu bằng phương pháp cấy ria trên bề mặt thạch để làm thuần vi khuẩn Mỗi khuẩn lạc ở trên cấy chuyển sang một đĩa thạch máu Nuôi ở nhiệt độ môi trường trong 24-36h

Cấy chuyển sang LB Giữ giống

Mẫu

Làm phản ứng sinh hóa

Tăng sinh Cấy lên môi trường thạch máu

Nhuộm gram Cấy chuyển sang môi trường thạch máu

2.6.3 Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh vật học của các chủng A.hydrophila phân lập được

2.6.3.1 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn A hydrophila

4 Rửa nước tối đa 5 giây

5 Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút

6 Rửa bằng rượu trong 10 giây

7 Phủ lên mẫu với ethanol 95%

8 Rửa nước

9 Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin

10 Rửa qua nước Để khô

Đọc kết quả Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh Vi khuẩn Gram âm (G - ) có màu hồng đỏ

* Làm phản ứng lên men đường trong môi trường KIA (Kligler Iron Agar) Hấp tiệt trùng môi trường, rồi đổ ra các ống nghiệm vô trùng 7ml/ống,

để tạo ống thạch nghiêng sao cho phần thạch nghiêng bằng 2 lần phần thạch đứng, đỉnh thạch nghiêng cách nắp ống nghiệm khoảng 2,5cm Vi khuẩn được lấy từ đĩa thạch máu bằng que cấy vô khuẩn, cấy ria lên bề mặt thạch nghiêng, dùng que cấy kéo một đường từ dưới lên và cấy đâm sâu vào phần môi trường thạch đứng Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ phòng, sau 24h đem ra đọc kết quả Ghi nhận màu, sự sinh khí ở phần sâu, màu ở mặt thạch nghiêng, sự tạo thành màu nâu bởi FeS

* Làm phản ứng sinh Indol: Môi trường sử dụng cho phản ứng là môi trường tryptone waster Môi trường sau khi được tiệt trùng, để nguội Dùng que cấy vô trùng, lấy vi khuẩn cấy vào trong môi trường, nuôi ở nhiệt độ phòng

Sau 24h đem ra đọc kết quả bằng thuốc thử Kovac Trước khi bổ sung thuốc thử có thể bổ sung 1ml xylen vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách indol lên lớp dung môi hữa cơ Nhỏ 1-2 giọt Kovac vào ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy,

để vài phút quan sát hiện tượng trong lớp dung môi hữu cơ

* Phản ứng Catalase Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 trong 100ml nước cất)

1 Dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn để lên lam

2 Nhỏ lên vi khuẩn một giọt 3% H2O2

Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại không sủi bọt thì ( - )

* Khả năng sinh H2S Các bước thực hiện:

1 Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất)

2 Đun và khuấy cho tan hoàn toàn

3 Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút Để nguội ở 45oC

4 Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm

5 Để nghiêng ống nghiệm tạo một mặt phẳng nghiêng

6 Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm Ủ ở

28oC Đọc kết quả sau 14 - 28 giờ

Vi khuẩn chỉ lên men đường Glucose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng

và màu vàng ở phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid))

Vi khuẩn lên men đường Glucose và Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (A(acid)/A (acid))

Vi khuẩn chỉ lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline))

Vi khuẩn không lên men đường Glucose, không lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline))

Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm

* Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F) Các bước thực hiện:

1 Đun và khấy cho tan hoàn toàn môi trường O/F

2 Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội 45oC

3 Thêm 1% glucose tiệt trùng Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm

4 Cấy vi khuẩn vào 2 ống nghiệm có chứa môi trường O/F Sau đó phủ 0.5 - 1ml dầu parafin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm Để trong tủ ấm ở 28oC

Theo dõi và đọc kết quả sau từ 1 đến 7 ngày

Lên men (F) khi ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng

Oxidation (O) khi ống không có phủ parafin chuyển sang màu vàng Không i (N) cả hai ống đều có màu xanh lá cây hoặc xanh lơ

* Khả năng sinh gas từ glucose Môi trường Nutrient broth (công thức pha chế trên nhãn) + 0.4% Bromothymol blue (1.6%) Chuẩn độ pH về 6.8 Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút Để nguội và cho thêm 1% đường glucose vào

Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm đã tiệt trùng có chứa sẵn chuông tiệt trùng Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm Ủ ở 28oC

Đọc kết quả trong vòng 2 - 7 ngày

Nếu môi trường chuyển sang màu vàng và chuông nổi lên mặt môi trường cho phản ứng (+) và ngược lại thì ( - )

* Làm phản ứng thạch di động: môi trường bán thạch 0,5%-0,8% thạch Thành phần môi trường LB có bổ sung 0,5%-0,8% thạch Dùng que cấy thẳng, lấy vi khuẩn, cấy đâm sâu vào bên trong môi trường thạch, đọc phản ứng sau 48h

* Làm phản ứng phân giải gelatin: môi trường thực hiện phản ứng là Nutrient gelatin Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ môi trường thạch máu, cấy vi khuẩn bằng cách đâm sâu vào môi trường gelatin, nuôi ở nhiệt độ phòng Sau 2 ngày đến 14 ngày thì đem đọc kết quả phản ứng

Cấy chuyển sang môi trường LB: Chọn những chủng vi khuẩn cho kết quả dương tính với các xét nghiệm sinh hóa đem cấy chuyển sang môi trường

LB Nuôi ở nhiệt độ phòng trong 24h

Giữ giống trong môi trường BHI có bổ sung 15% glycerin, glycerin có tác dụng trong việc bảo vệ tế bào trong tủ đá Vi khuẩn được giữ trong các ống eppendof, nuôi ở nhiệt độ thường 24h, rồi cho vào tủ đá bảo quản

2.6.4 Xác định các yếu tố của gây bệnh của các chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập được

2.6.4.1 Phương pháp xác định khả năng dung huyết của các chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập được

Vi khuẩn A hydrophila được cấy trực tiếp lên thạch máu cừu, bồi dưỡng

370C trong 24 giờ, sau đó để ra ngoài điều kiện thường của phòng thí nghiệm khoảng 2 đến 3 giờ để dung huyết diễn ra hoàn toàn Căn cứ vào đặc điểm của dung huyết làm cơ sở để đánh giá các dạng dung huyết α, β, γ

Dung huyết không hoàn toàn (α - haemolysin): xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu nhỏ, có ánh xanh

Dung huyết hoàn toàn (β - haemolysin): xung quanh khuẩn lạc có vòng tan máu to, rõ

Không dung huyết (γ - haemolysin): xung quanh khuẩn lạc không có

b Quy trình phản ứng PCR

PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về

PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq

polymerase để khuếch đa ̣i in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị điều

nhiệt tuần hoàn (thermocycler) còn gọi là máy PCR PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triê ̣u lần các đoa ̣n DNA có chiều dài từ 200 - 3.000

bp Đoạn DNA đươ ̣c khuếch đa ̣i (DNA đích) đươ ̣c nhâ ̣n dạng nhờ că ̣p primer

đă ̣c hiệu (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.Quá trình nhân đoạn gene 16S rRNA từ DNA tổng số được tiến hành với cặp mồi 16S rRNA- F và rRNA- R

2.6.5 Phương pháp xác định độc lực và khả năng gây bệnh của các chủng

vi khuẩn A hydrophila phân lập được

2.6.5.1 Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn A hydrophila

Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn A hydrophila gây bệnh được thực

hiện bằng phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm Các bước thực hiện như sau:

- Bước 1: Các chủng vi khuẩn thuần từ môi trường giữ giống được cấy vào

môi trường BHI trong bình tam giác 100 ml sau đó canh trùng được bồi dưỡng

ở 370C trong 24 giờ, trong quá trình nuôi có lắc để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn

- Bước 2: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột bạch khỏe

mạnh, khối lượng từ 18 - 20 g/con, với liều 0,2 ml/chuột, tiêm xoang phúc mạc Trong thí nghiệm, mỗi lô chuột để 1 con không tiêm làm đối chứng

- Bước 3: Cho chuột ăn, uống bình thường và theo dõi những biểu hiện,

triệu chứng phản ứng sau tiêm Kiểm tra và đánh giá số chuột tới 7 ngày sau thí nghiệm Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô

để đánh giá độc lực của vi khuẩn

- Bước 4: Những chuột chết được đánh giá qua lâm sàng, mổ khám kiểm

tra sự biến đổi của các cơ quan nội tạng, sau đó tiến hành nuôi cấy và phân lập

lại vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm (máu tim) của chuột chết

2.6.5.2 Phương pháp gây nhiễm trên cá thí nghiệm

a Gây nhiễm bằng vi khuẩn A hydrophila

- Động vật thí nghiệm: cá chép có trọng lượng 30g, khỏe mạnh được nuôi trong bể nuôi phòng thí nghiệm, để tạo sự ổn định hơn về điều kiện sống, các yếu

tố môi trường, ngoại cảnh tác động đến quá trình sống của cá so với cá sống bên ngoài

- Liều vi khuẩn gây nhiễm: 105 - 108 tế bào vi khuẩn/ml

- Đường gây nhiễm: tiêm xoang bụng với liều 0,1ml/con Cá đối chứng được nuôi ở bể riêng, tiêm xoang bụng 0,1ml nước cất Số cá trong thí nghiệm

- Theo dõi triệu chứng bệnh, tỷ lệ chết của cá trong 15 ngày

b Gây nhiễm bằng độc tố của vi khuẩn A hydrophila

- Động vật thí nghiệm: cá chép có trọng lượng 30g, khỏe mạnh được nuôi trong bể nuôi phòng thí nghiệm, để tạo sự ổn định hơn về điều kiện sống, các yếu

tố môi trường, ngoại cảnh tác động đến quá trình sống của cá so với cá sống bên ngoài

- Liều độc tố gây nhiễm: tách được từ canh khuẩn chứa 103-106 tế bào vi khuẩn/ml

- Đường gây nhiễm: tiêm vào tĩnh mạch và phúc mạc của cá

- Theo dõi triệu chứng bệnh, tỷ lệ chết của cá trong 96 giờ

2.6.6 Phương pháp tách độc tố

Tăng sinh chủng vi khuẩn trong 100ml peptone kiềm trong bình tam giác 250ml Nuôi trong tủ lắc 30ºC Sau 36h, lấy canh khuẩn đem ly tâm lạnh 4000v / 15 phút ở nhiệt độ 5ºC Ly tâm xong, thu cặn vi khuẩn, bổ sung PBS vào với mục đích rửa tế bào vi khuẩn, loại bỏ những thành phần còn lại của môi trường Tiếp tục ly tâm, rồi lại rửa bằng PBS Quá trình lặp lại khoảng 4-6 lần Cuối cùng ta thu được cặn vi khuẩn

Bổ sung PBS vào cặn vi khuẩn thu được ở trên với tỷ lệ 1:1 Đem sốc nhiệt ở 60ºC trong 15 phút mục đích làm khả năng hoạt động của vi khuẩn yếu

đi, khả năng bảo vệ của tế bào vi khuẩn kém mạnh mẽ, do đó độc tố tiết ra ngoài môi trường, giải phóng ra khỏi tế bào với số lượng nhiều Sốc nhiệt trong

15, bỏ ra ngoài môi trường 30 phút Quá trình sốc nhiệt lại tiếp tục như vậy khoảng 2-3 lần Tiến hành sốc nhiệt xong, để ngoài môi trường 2 tiếng, đem ly tâm lạnh 4000v / 15 phút ở 5ºC với mục đích thu dịch nổi

Dịch nổi, bổ sung kháng sinh Norphlataxin 0,2% ở dạng tiêm, ủ trong 30 phút để diệt vi khuẩn còn sót lại trong dịch Dịch nổi thu được chính là độc tố của vi khuẩn tiết ra

2.6.7 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn A hydrophila phân lập được

Phương pháp được tiến hành với các chủng vi khuẩn ta đã phân lập được Tăng sinh chủng vi khuẩn trong các ống nghiệm đã được tiệt trùng chứa môi trường peptone kiềm, nuôi ở nhiệt độ phòng Sau 36h đem ra thử với các khoanh giấy kháng sinh Khoanh giấy kháng sinh trước khi đem thử được bảo quản trong tủ lạnh 4ºC Khi lấy ra tiến hành thí nghiệm, khoanh giấy kháng sinh được để ngoài môi trường 30 phút

Đầu tiên, vi khuẩn được pha loãng ở nồng độ 10-2 rồi cấy chang lên bề mặt thạch LB, chang đều vi khuẩn lên bề mặt thạch đến khi thấy bề mặt thạch

se lại Dùng kiêm tiêm vô trùng, lấy các khoanh giấy kháng sinh trong lọ đặt lên bề mặt thạch, mỗi đĩa thạch đặt 7 khoanh giấy kháng sinh, sao cho khoảng cách các khoanh giấy cách đều nhau Cứ như vậy làm lần lượt với 6 loại kháng sinh mà ta tiến hành lập kháng sinh đồ Nuôi vi khuẩn ở nhiệt dộ phòng, sau 24h đọc kết quả dựa vào đường kính vòng vô khuẩn

Đo đường kính của vòng vô trùng để xác định tính nhậy cảm của vi khuẩn với kháng sinh đó, nếu:

đó không tạo được vòng vô khuẩn rõ nét

2.6.8 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu thu thập được, xử lý theo phương pháp toán học thông dụng

và thống kê sinh vật học (Nguyễn Văn Thiện và cs., 2005) [29] Ứng dụng các phần mềm trong thống kê như Excel

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả điều tra tình hình dịch tễ bệnh xuất huyết trên cá chép tại 1

số điểm nuôi cá ở một số huyện của tỉnh Lạng Sơn

Để xác định được tỷ lệ cá chép mắc bệnh xuất huyết tại tỉnh Lạng Sơn tôi đã tiến hành điều tra các ao nuôi trên 3 huyện là Văn Quan, Cao Lộc và Đình Lập Các cá mắc bệnh có biểu hiện: bơi lội không định hướng, mắt lồi, rách, cụt vây, tuột nhớt, tuột vảy, mang nhợt nhạt, có các chấm xuất huyết trên vây, vùng da tuột vảy

Hình 3.1: Mổ khám cá chép nghi nhiểm vi khuẩn A hydrophila

Giải phẫu cá có các biểu hiện bệnh tích: mật sưng, dịch mật chứa nhiều sắc tố hồng cầu; gan, thận, tim xuất huyết Quá trình điều tra ở các ao thu ta được bảng số liệu sau: