phân lập và tuyển chọn một số dòng aspergillus niger sinh pectin methylesterase hoạt tính cao

   MSHV: 62030803  ASPERGILLUS NIGER SINH   3     MSHV: 62030803  ASPERGILLUS NIGER SINH     Mã ngành: 62 42 01 07     3 2008 - 2012  Chuyên ngành Vi sinh  i       u ca NCS Trn Thanh Trúc vi s ng dn ca PGS. TS. Nguyi và TS. Nguy liu và kt qu trình bày trong luc công b riêng l bi tác gi khác trong bt k công trình nào .  PGS. TS.  TS.    2008 - 2012  Chuyên ngành Vi sinh  ii    PGS. TS. .  , tôi xin PGS. TS.            .   luôn   , cùng tôi  . .  Giám , ã giúp                   ,    và các phòng ng;    p,    này. GS. TS. . TS.     Xin cám  ý và    2008 - 2012  Chuyên ngành Vi sinh  iii      d.   03 3    2008 - 2012  Chuyên ngành Vi sinh  iv   Aspergillus niger sinh pectin methylesterase   liên qu9.2012.                   enzyme pectin methylesterase (P   dòng Aspergillus niger (A. niger  dòng Aspergillus niger    các  khoai tây (Potato Dextrose Agar, PDA), Czapek Dox Agar (CZ) n các dòng    60 dòng  dòng   các dòng  dòng   dòng có ,  T 1 , N 1 , So 2 và R 1  .  dòng R 1 và So 2    gene dòng T 1 , N 1 , So 2 và R 1,  A. niger  ÷ 100%.  A. niger So 2 và R 1                        ly trích   gian ly trích  khô i    Quá trình  % MgCl 2 và 0,15% CaCl 2   5  (mL/g) 2008 - 2012  Chuyên ngành Vi sinh  v  ly trích   1 v/w (mL/g). ly trích   .    protein    protein,                 A. niger    m mg/mL  A. niger  ÷    CaCl 2   A. niger.       Từ khóa: Aspergillus niger, cải thiện cấu trúc, cơ chất giàu pectin, hoạt tính cao, lên men bề mặt cơ chất rắn, pectin methylesterase, phân lập, tuyển chọn. 2008 - 2012  Chuyên ngành Vi sinh  vi  SUMMARY Aspergillus niger biosynthesize high activity pectin atory of Food Technology Department, College of Agriculture and Applied Biology, Can Tho University and other laboratories, from 11.2008 to 9.2012. The thesis was conducted to investigate the biosynthesis process and application of pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) in solid state fermentation (SSF) of isolated and selected Aspergillus niger from the practical conditions of Vietnam. Sixty species which have morphologically similar Aspergillus niger were isolated from the peels of rich pectin fruits which have been found to be widely in Mekong delta, such as orange, pomelo, citrus, apple and fig peels on Potato Dextrose Agar (PDA), Czapek Dox Agar (CZ) and Malt Extract Agar (MEA). To indicate the pectinase activity of the organisms, diameters of clear zone around colonies on pectin - agar medium were measured. The result showed that all of sixty isolates have the ability of pectinolytic activities, in which 14 out of the 60 isolates were able to produce a higher pectinase activity, based on the average clear zone diameters were larger than 20 mm. Further screening of PME production of the 14 selected isolates, the maximum PME production was obtained by 4 isolates (T 1 , N 1 , So 2 and R 1 ) which were isolated from the peels of Ziziphus mauritiana (  Citrus lemon   Citrus sinensis L.  and Citrus maxima R two isolates of R 1 and So 2 with the proportion of 1:1, was conducted to investigate the suitable conditions for PME biosynthesis by solid state fermentation. In addition, the identification by sequencing of 28S rRNA gene, revealed that 4 selected isolates T 1 , N 1 , So 2 and R 1 had 99 ÷ 100% identity to Aspergillus niger. The optimal conditions of pectin methylesterase biosynthesis from A. niger So 2 and R 1 in solid-state fermentation were evaluated, based on the individual factors (substrate characteristics, nutrients, buffer solutions and incubation time) which influenced to PME production were investigated. After that, the Response surface methodology (RSM) based on four-variable central composite design (CCD) can be used to model the correlation of the fermentation conditions such as inducer concentration, initial pH, incubation temperature and moisture content of medium to PME activity. Moreover, some extraction parameters consist of type of solvent, pH, ratio of solvent and fermented solids were studied. In addition, the best combination of extraction temperature, contact time was also determined. Especially, the use of rich pectin of agricultural material in Mekong Delta (mixture of apple pomace and pomelo peels at the ratio of 1:1 w/w) as a fermentation medium was taken into consideration for the PME production of A. niger in this investigation. With the 2008 - 2012  Chuyên ngành Vi sinh  vii  addition of 0.1% urea combined with 0.5% MgCl 2 and 0.15% CaCl 2 into media, the highest PME obtained after 96 hours incubation at a temperature of 35.5°C, pH 4.0 (adjusted by citrate buffer), fermentation temperature and moisture content adjusted to 57.4% and 16.5% v/w of inducer concentration (10 5 cfu/mL). In addition, citrate buffer (pH 3.6) at 35°C and 50 min provided the best recovery in order to obtain highest value of PME. The ratio 2:1 (v/w) of solvent and substrate was determined as an optimal condition for concentrated enzyme extracts. Maximum production of PME (about 79.1 U/g of substrate) was recorded under optimum conditions of SSF and extraction. Ethanol was the appropriate precipitant for PME purification with the optimal ratio of cold ethanol and crude enzyme 3: 1 (v/v). In this case, specific activity of PME was 10.02 U/mg protein , the purification factor achieved 7.98 fold and the PME recovery yield obtained 91.48%. Combined with the cross flow membrane step, the specific activity of PME reached to 15.63 U/mg protein and the purification factor achieved 12.40 ± 0.89 fold in comparison to the crude enzyme solution. The molecular weight of the enzyme was found to be 43 kDa and K m was 0.6014 g/L. The activity of the enzyme was stimulated by NaCl or CaCl 2 . In addition, the optimum temperature and pH of A. niger PME were 38 ÷ 40°C and 5.0, respectively. Isothermal inactivation of partial purified A. niger PME could be described by a fractional  conversion model and the inactivation rate constants increase with increasing temperatures from 50 to 70°C. The obtained technical PME enzyme also proved the positive effects to improving of the texture of frozen pineapples and fermented cucumbers. Key words: Aspergillus niger, isolation, high activity, pectin methylesterase, rich pectin substrate, screening, solid state fermentation, texture improvement. 2008 - 2012  Chuyên ngành Vi sinh  viii    i  ii  iv SUMMARY vi  viii  xiii DANH SÁCH HÌNH xv  xix  xx  1 1.  1 2.  2 3.  3 4.  3 5.  4 6.  5   6 1.1  6 1.1.1  6 1.1.2  6 1.1.3  7 1.1.4 PME 8 1.2  10 1.2.1  10 1.2.2   12 1.2.3 V  13 1.3 Aspergillus niger  19 [...]... hai chủng A niger So2 và A niger R1 đã đƣợc xác định: nhiệt độ và pH hoạt động tối ƣu cho hoạt động của enzyme, khả năng làm tăng hoạt tính PME của một số ion kim loại ở nồng độ thích hợp nhƣ Na+ và Ca2+ iv Những kết quả ý nghĩ về mặt ứng dụng Xác định đƣợc thành phần môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy để sinh tổng hợp PME hoạt tính cao với nguồn giống A niger chủ động đƣợc phân lập và tuyển chọn tại chỗ... năng sinh trƣởng và tổng hợp enzyme (Bhalla và Chatanta, 2000) Do đó, vấn đề tuyển chọn dòng A niger có khả năng sinh tổng hợp PME hoạt tính cao đòi hỏi nhiều thời gian và công sức nghiên cứu Hoạt động của PME đƣợc biết đến chủ yếu nhờ vào tác động của enzyme này trên pectin có độ methoxyl hóa cao (Sajjaanantakul và Pitifer, 1991; Bhalla và Chatanta, 2000) Chính vì thế, các nguồn phụ phẩm giàu pectin. .. 2008 - 2012 3.2.2 Tuyển chọn dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp PME hoạt tính cao 92 3.2.3 Khả năng kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu quả thu nhận PME 94 3.2.4 Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng So2 và R1 đặc hiệu theo các tỷ lệ khác nhau đến hiệu quả sinh tổng hợp PME hoạt tính cao 96 3.3 Bƣớc đầu định danh một số dòng A niger đã phân lập bằng kỹ thuật sinh học phân tử ... PME từ nấm mốc A niger 19 1.3.2 Vai trò của cơ chất pectin đối với sự phát triển của nấm mốc sinh tổng hợp enzyme PME 20 1.3.3 Nguồn nguyên liệu cho quá trình phân lập và tuyển chọn A niger sinh tổng hợp PME hoạt tính cao 21 1.4 Tổng quan về nấm Aspergillus niger 22 1.4.1 Giới thiệu chung 22 1.4.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger 23... quan sinh sản 23 1.4.4 Chuyên luận phân loại Aspergillus niger 24 1.4.5 Định danh Aspergillus niger theo phƣơng pháp truyền thống 24 1.4.6 Định danh nhóm loài Aspergillus b ng phƣơng pháp sinh học phân tử 25 1.5 Phƣơng pháp tu ển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp PME 26 1.5.1 Lý thuyết chung 26 1.5.2 Tuyển chọn dòng Aspergillus. .. 2012 ý nghĩ kho h Nghiên cứu đã phân lập đƣợc 60 dòng nấm mốc từ vỏ trái cây giàu pectin và tuyển chọn đƣợc 02 dòng A niger có nguồn gốc từ cam soàn (So2) và bƣởi Năm Roi (R1) đặc hiệu đối với PME Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử (PCR 28S- rRNA gene) kết hợp với phƣơng pháp truyền thống trong định danh 04 dòng A niger đặc hiệu đối với việc sinh tổng hợp PME Một số tính chất cơ bản của chế phẩm PME... và tuyển chọn từ các loại vỏ quả giàu pectin ở đồng b ng sông Cửu Long ii Mụ ti u ụ th (1) Phân lập, tách ròng và xác định đặc điểm các dòng A niger bản địa từ các vỏ quả giàu pectin phổ biến tại đồng b ng sông Cửu Long, làm nguồn nấm mốc sử dụng cho quá trình sinh tổng hợp PME (2) Tuyển chọn các dòng A niger đặc hiệu, phù hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp PME đạt hiệu quả cao Chuyên ngành Vi sinh. .. một cách cụ thể ngay từ bƣớc đầu phân lập và tuyển chọn các dòng A niger đặc hiệu với PME đến việc nghiên cứu xác định điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme phù hợp, ứng dụng hiệu quả trong lĩnh vực cải thiện cấu trúc rau quả 2 Mục ti u v nội dung nghi n cứu i Mụ ti u hính Nghiên cứu sinh tổng hợp và ứng dụng PME từ quá trình lên men bề mặt trên môi trƣờng rắn dòng A niger đặc hiệu đƣợc phân lập và. .. Cần hơ 2008 - 2012 Tính chất của pectin đƣợc đặc trƣng bởi hai chỉ số quan trọng là: MI - chỉ số methoxyl hóa, biểu hiện cho phần trăm khối lƣợng nhóm methoxyl (-OCH3) có trong phân tử pectin và DE - chỉ số ester hóa, thể hiện mức độ ester hóa của phân tử galacturonic acid trong phân tử pectin (Waldron et al., 1997; Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) Hình 1.3: Cấu trúc p ân tử pectin ( )Phân tử pectin (b) g carboxyl,... 47 2.2.2 Phƣơng pháp phân tích và đo đạc 48 2.2.3 Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu 50 2.3 Nội dung nghi n cứu 52 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 52 2.3.2 Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn dòng nấm mốc A niger đặc hiệu cho quá trình sinh tổng hợp PME 54 Nội dung 2: Xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men rắn sinh tổng 2.3.3 hợp PME .     Từ khóa: Aspergillus niger, cải thiện cấu trúc, cơ chất giàu pectin, hoạt tính cao, lên men bề mặt cơ chất rắn, pectin methylesterase, phân lập, tuyển chọn. 2008.  Chuyên ngành Vi sinh  iv    Aspergillus niger sinh pectin methylesterase   liên.  Aspergillus niger 22 1.4.1  22 1.4.2  Aspergillus niger 23 1.4.3  23 1.4.4  Aspergillus niger 24