Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa tại huyện ninh hòa

i LỜI CẢM ƠN Sau gần 3 tháng thực tập tại phòng Hóa phân tích và triển khai công nghệ, thuộc viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của TS. Trần Thị Thanh Vân và các cán bộ ở đây, tôi đã hoàn thành cuốn luận văn này. Qua đây tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị Thanh Vân người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm và tận tình chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực tập, cùng các anh chị phòng hóa phân tích và triển khai công nghệ, những người đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm học vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và các bạn cùng thực tập đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình cùng toàn thể bạn bè thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Nha Trang , tháng 7 năm 2012 Sinh viên Trần Hải Minh ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về Azotobacter: 3 1.1.1. Đặc điểm chung của Azotobacter: 3 1.1.2. Phân loại Azotobacter 5 1.1.3. Ảnh hưởng các nhân tố sinh thái đến sự sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn Azotobacter 6 1.1.4. Quá trình cố định nitơ: 8 1.1.5. Giới thiệu về quy trình sản xuất chế phẩm cố định đạm Azotobacterin 11 1.2. Tình hình trồng lúa và sử dụng phân bón ở Việt Nam: 12 1.2.1. Tình hình trồng lúa ở Việt Nam: 13 1.2.2. Tình hình sử dụng phân bón ở Việt Nam: 15 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Vật liệu 20 2.1.1. Mẫu phân lập vi sinh 20 2.1.2. Thiết bị chuyên dụng 21 2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 21 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 23 2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Azotobacter từ mẫu đất 24 2.2.3. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase mạnh 25 2.2.4. Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 28 iii 2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn đến khả năng nảy mầm của hạt lúa 34 Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Phân lập các chủng Azotobacter từ mẫu đất 36 3.2. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính nitrogenase 37 3.2.1. Thử hoạt tính catalase 37 3.2.2. Xác định khả năng di động 39 3.2.3. Xác định khả năng cố định đạm bằng thuốc thử Nessler 39 3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 3.3.1. Xác định pH nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 3.3.2 Xác định nhiệt độ nuôi cấy cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 42 3.3.3. Xác định nồng độ đường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 43 3.3.4. Xác định nồng độ muối nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 3.3.5. Nghiên cứu xác định thời gian nuôi cấy thích hợp và ảnh hưởng của thời gian đến khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn tuyển chọn 46 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn đến khả năng nảy mầm của hạt lúa 49 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 55 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại Azotobacter 5 Bảng 1.2: Một số mặt hàng xuất khẩu nông sản của Việt Nam 2000-2008 13 Bảng 1.3: Số lượng và giá trị gạo xuất khẩu Việt Nam qua các năm 14 Bảng 1.4: Lượng phân bón vô cơ sử dụng ở Việt Nam qua các năm 15 Bảng 1.5: Lượng phân bón vô cơ hàng năm cây trồng chưa sử dụng được 16 Bảng 2.1: Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn 20 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập 36 Bảng 3.2: Hoạt tính catalase của 15 chủng phân lập 38 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 41 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 42 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 44 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 45 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrogenase của chủng L8 46 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng L8 lên khả năng nảy mầm của hạt lúa 49 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình dạng tế bào Azotobacter sp 3 Hình 1.2: Sơ đồ giả thuyết về các con đường của quá trình cố định N 2 9 Hình 2.1: Cánh đồng nơi lấy mẫu 20 Hình 2.2: Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 23 Hình 2.3: Phương pháp phân lập vi sinh vật 25 Hình 2.4: Đường chuẩn Nessler 27 Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng L8 28 Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy thích hợp cho chủng L8 29 Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 30 Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ đường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 31 Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ muối nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 32 Hình 2.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 33 Hình 2.11: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn đã tuyển chọn lên khả năng nảy mầm của hạt lúa 35 Hình 3.1 (a): Hình thái khuẩn lạc của chủng L8 37 Hình 3.1 (b): hình thái tế bào chủng L8 dưới độ phóng đại X-1000 37 Hình 3.2(a): Hoạt tính catalase (-) 38 Hình 3.2(b): Hoạt tính catalase (+) 38 Hình 3.3: Hoạt tính nitrogenase của 8 chủng phân lập 39 Hình 3.4. Hoạt tính nitrogenase của 8 chủng phân lập 40 Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 41 Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 42 Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 44 Hình 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 45 Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrogenase của chủng L8 47 Hình 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng L8 lên khả năng nảy mầm của hạt lúa 49 Hình 3.11: Sự nảy mầm của hạt lúa của mẫu 0 và mẫu 2 sau 3 ngày 50 vi BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic Acid FDA Food and Drug Administration Fuc Fucose Gal Galactose Man Mannose OD Optical Density (Mật độ quang) RNA Ribonucleic Acid FAO Food and Agriculture Organization ATP Adenosine triphosphat N Nitơ 1 MỞ ĐẦU Đạm là chất dinh dưỡng có vai trò hàng đầu đối với cây trồng. Hàm lượng của chúng trong đất rất ít, dao động trong khoảng 4-30mg/100g đất, tùy vào loại đất. Vì vậy cây trồng thường thiếu đạm, để cung cấp nguồn đạm cho cây trồng, ngoài việc sử dụng phân đạm hóa học, một trong các phương pháp khác làm tăng cường lượng đạm trong đất để cung cấp cho cây trồng đang được nhiều người quan tâm là sử dụng các loại vi sinh vật cố định đạm từ không khí. Hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng vẫn sử dụng phân bón hóa học là nguồn cung cấp đạm chủ yếu và nguồn đạm này tăng nhanh trong những năm gần đây. Theo FAO, nhu cầu sử dụng phân bón hóa học tăng lên với tốc độ vũ bão. Năm 1905, cả thế giới mới chỉ sử dụng 1,4 triệu tấn NPK thì đến năm 1990 lượng phân bón hóa học mà thế giới sử dụng là 138 triệu tấn, năm 2000 là 144 triệu tấn, năm 2005 là 150 triệu tấn và hiện nay nhu cầu sử dụng phân bón hóa học của thế giới lên tới 200 triệu tấn/năm. Nhu cầu sử dụng phân bón hóa học tăng nhanh là xu thế tất yếu để đảm bảo lương thực, thực phẩm cho sự bùng nổ dân số trên hành tinh. Tuy nhiên, việc lạm dụng phân bón hóa học đã bộc lộ mặt trái của nó là gây ô nhiễm môi trường, làm giảm độ phì nhiêu của đất, gia tăng lượng tồn dư chất độc lên nông sản, thực phẩm. Thực trạng này đã xảy ra phổ biến ở phạm vi toàn cầu và trở thành nghiêm trọng ở các nước đang phát triển. Để có thể vừa đảm bảo an ninh lương thực, vừa phải duy trì và cải thiện độ phì nhiêu của đất canh tác, đồng thời không ngừng nâng cao chất lượng nông sản, tăng hiệu quả kinh tế và an toàn bền vững về môi trường, các nhà khoa học và các nhà sản xuất chuyển sang nghiên cứu nhiều về vi khuẩn cố định đạm cộng sinh, tự do hay nội sinh để làm phân đạm sinh học bón cho cây trồng. Phân bón vi sinh có nhiều đặc điểm nổi trội so với phân bón hóa học, ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân bón vô cơ, giảm chi phí sản xuất thì phân bón vi sinh còn góp phần bảo vệ môi trường và phát triển ngành nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân bón vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó nghiên cứu hoàn thiện và nâng cao chất lượng của phân bón vi sinh là một việc cấp 2 thiết hiện nay. Trong đó, công tác tuyển chọn, đánh giá hoạt tính của các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và vô cùng quan trọng trong quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh. Azotobacter là một vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất. Chúng có khả năng cố định đạm cao từ N 2 không khí và không phụ thuộc vào cây chủ, Azotobacter còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm và sinh một số chất có hoạt tính sinh hoc cao như: Thiamine, Riboflavin, Nicotine, Heteroauxin Indole acetic và Gibberellins chính nhờ những đặc điểm quan trọng đó mà vi khuẩn Azotobacter được dùng rộng rãi trong các chế phẩm phân bón vi sinh làm tăng năng suất cây trồng. Thêm vào đó, hiện nay Việt Nam chúng ta đang là một cường quốc về xuất khẩu gạo, cây lúa đang là cây trồng chủ lực đóng góp vào sự phát triển của xã hội, vì vậy vấn đề phát triển ngành trồng lúa đang là một vấn đề quan trọng đối với quốc gia. Và trong địa bàn tỉnh Khánh Hòa thì huyện Ninh Hòa được xem như là một vựa lúa chính của cả tỉnh, hàng năm sản lượng lúa của huyện Ninh Hòa chiếm hơn 1/3 sản lượng lúa của cả tỉnh. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa tại huyện Ninh Hòa-tỉnh Khánh Hòa”. 1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa tại huyện Ninh Hòa-tỉnh Khánh Hòa. 2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ nuôi cấy và pH của môi trường nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn tuyển chọn. 3. Nghiên cứu xác định nồng độ đường, nồng độ muối của môi trường nuôi cấy tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn tuyển chọn 4. Nghiên cứu xác định thời gian nuôi cấy tối ưu và khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn tuyển chọn. 5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuôi cấy vi khuẩn đến sự nảy mầm của hạt lúa. Đề tài được thực hiện tại phòng Hóa phân tích và triển khai công nghệ thuộc Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. 3 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Azotobacter: 1.1.1. Đặc điểm chung của Azotobacter: Azotobacter là chủng vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất và có tác dụng rất lớn trong việc làm tăng độ màu mỡ cho đất cũng như làm tăng năng suất cây trồng. Azotobacter tự nhiên cố đònh nitơ từ không khí trong vùng rễ. Mỗi chủng Azotobacter có các đặc tính về hóa học, sinh học riêng. Tuy nhiên một vài chủng có khả năng cố đònh nitrogen cao hơn so với các chủng khác (Islam M.Z và cs, 2008). Azotobacter là vi khuẩn hình cầu, Gram (-), khơng sinh nha bào, hiếu khí, sinh sản theo lối phân cắt giản đơn, lượng DNA trong tế bào Azotobacter thường ít hơn các vi khuẩn khác (Sachin D., 2009). Khi ni trong mơi trường thạch, vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc tan, lúc đầu khơng màu, sau biến thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen, nhưng khơng làm nhuộm màu mơi trường khuẩn lạc. Ngồi ra một số lồi Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng. Hình 1.1: Hình dạng tế bào Azotobacter sp (a) dưới kính hiển vi điện tử (b) tiêu bản âm 4 Vi khuẩn Azotobacter khi còn non có tiêm mao, có khả năng di động nhờ tiên mao , khi già tế bào mất khả năng di động, kích thước tế bào thu nhỏ lại. Vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc dạng S màu trắng trong, lồi nhầy. Khi già, khuẩn lạc có màu vàng lục hoặc màu nâu thẫm, tế bào được bao bọc bởi lớp vỏ dày và tạo thành nang xác, gặp điều kiện thuận lợi, nang xác này sẽ nứt ra và tạo thành các tế bào mới. Vi khuẩn Azotobacter thích ứng ở pH= 7.2-8.2, ở nhiệt độ 28-30 0 C, độ ẩm 40-60%. Azotobacter đồng hóa tốt các loại đường đơn và kép, cứ tiêu tốn 1g đường glucose nó có khả năng đồng hóa được 8-18 mg N (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002). Nồng độ muối 0.9% có thể gây chết Azotobacter nhưng trong môi trường nuôi cấy cần thiết phải bổ sung thêm muối. Azotobacter có khuynh hướng nhạy cảm với pH acid, nồng độ phosphate cao và nhiệt độ cao hơn 35 o C, Azotobacter sống cộng sinh trong rễ của một vài loài thực vật có khả năng sản xuất ra hormone kích thích sinh trưởng thực vật ( Islam M.Z và cs, 2008). Ngồi khả năng cố định nitơ, Azotobacter còn có khả năng tiết ra một số vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B6…và một số chất có hoạt tính sinh học cao như: Indole acetic, Gibberellins và các loại kháng sinh thuộc nhóm Anixomyxin. Khi Azotobacter được ứng dụng trong gieo hạt thì khả năng nảy mầm của hạt tăng lên một cách đáng kể, đồng thời Azotobacter cũng làm tăng khả năng chống chòu sâu bệnh của thực vật nhờ những chất kích thích sinh trưởng mà nó tạo ra. Vi khuẩn Azotobacter thuộc loại vi khuẩn sống theo phương thức dị dưỡng, chúng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau: disacarit, dextrin, tinh bột, acid hữu cơ, hợp chất thơm…Tuy vậy nhiều tác giả cho biết khơng ít các chủng Azotobacter khơng có khả năng đồng hóa lactose, manitol hoặc natribenzoat. Trên các mơi trường khơng chứa N khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đơi khi nhăn nheo. Chứng tỏ vi khuẩn Azotobacter có khả năng sinh trưởng trên mơi trường khơng có N. Sở dĩ chúng tồn tại được là vì có khả năng đồng hóa muối [...]... thời phân bón vi sinh cũng góp phần quan trọng trong vi c cải tạo đất, đáp ứng cho một nền nông nghiệp hữu cơ bền vững, xanh sạch và an toàn 20 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Mẫu phân lập vi sinh Mẫu đất để phân lập vi khuẩn được lấy từ đất trồng lúa thuộc hai xã Ninh Xuân và Ninh Lộc, huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa Bảng 2.1: Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn STT Ngày phân. .. tiếp cận kế thừa và chọn lọc các phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng Azotobacter có khả năng sinh enzyme nitrogenase theo sơ đồ: Mẫu Phân lập Pha loãng Cấy trang Cấy ria Giữ giống Tuyển chọn chủng Azotobacter có hoạt tính nitrogenase Xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuôi cấy vi khuẩn đến sự nảy mầm của hạt lúa Hình 2.2:... OD vào phương trình đường chuẩn để xác định hoạt tính nitrogenase Sau các xác định hoạt tính nitrogenase, chọn chủng có hoạt tính nitrogenase mạnh nhất để tiến hành xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp và khảo sát ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn lên sự nảy mầm của hạt lúa 28 2.2.4 Phương pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Chọn vi khuẩn. .. tiếp cận vấn đề nghiên cứu Khuẩn lạc 24 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Azotobacter từ mẫu đất Mục tiêu của thí nghiệm là tuyển chọn được chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase mạnh Thí nghiệm được thực hiện theo các bước sau: Xử lý mẫu Mẫu đất sau khi được lấy từ nơi phân lập sẽ được vận chuyển về phòng thí nghiệm, sau đó dùng đĩa petri vô trùng cân 10g đất (trước khi cân phải lau... cho cây trồng và các chế phẩm vi sinh bón vào đất (Nguyễn Đức Lượng, 2006) 1.1.5 Giới thiệu về quy trình sản xuất chế phẩm cố định đạm Azotobacterin: Azotobacterin là chế phẩm phân bón được làm từ vi khuẩn Azotobacter sống tự do trong đất và các vùng rễ của cây ngũ cốc (lúa, ngô, lúa mạch…), cây mía, cây hướng dương Một số chủng có hoạt tính cố định đạm cao thường được sử dụng sản xuất phân Azotobacterin... lâu từ 6 tháng đến 2 năm có thể giữ giống trong paraffin lỏng vô trùng hay giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô Hình 2.3: Phương pháp phân lập vi sinh vật 2.2.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase mạnh  Phương pháp xác định khả năng di động *Nguyên tắc: Xác định khả năng di động của vi khuẩn bằng phương pháp quan sát trực tiếp sự chuyển động của vi khuẩn. .. vì vậy ít gặp chúng ở đất chua Cũng có thể phân lập được một số chủng từ đất chua nhưng các chủng này thường đã mất khả năng cố định N phân tử 1.1.3.5 Phân đạm: Trong đất Azotobacter có khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng từ môi trường Nguồn N đối với Azotobacter không phải chỉ là N phân tử mà còn là muối amon, nitrat, axit Amin Tùy thuộc vào nồng độ của các hợp chất chứa N có trong môi trường mà... nm) trước và sau nuôi cấy, mẫu nào có giá trị OD cao nhất chính là mẫu có giá trị nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn Nuôi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các nhiệt độ 200C 250C 300C 350C 400C Xác định khả năng sinh trưởng bằng giá trị OD Chọn nhiệt độ thích hợp Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn ... bón phân hiện nay chủ yếu là bón vãi trên mặt đất, phân bón ít được vùi vào trong đất Xét về mặt hoá học đất, các keo đất là những keo âm (-) còn các yếu tố dinh dưỡng hầu hết là mang điện tích dương (+) Khi bón phân vào đất, được vùi lấp cẩn thận thì các keo đất sẽ giữ lại các chất dinh dưỡng và nhả ra một cách từ từ tuỳ theo yêu cầu của cây trồng theo từng thời kỳ sinh trưởng của cây Như vậy, bón phân. .. các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống - Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng lẻ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng Các chủng vi khuẩn đã được lựa chọn được cấy trên ống thạch nghiêng có chứa môi trường Ashby rồi để vào tủ ấm 370C Sau 3-5 ngày khi vi . Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa tại huyện Ninh Hòa- tỉnh Khánh Hòa . 1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt. đề nghiên cứu 23 2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Azotobacter từ mẫu đất 24 2.2.3. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase mạnh 25 2.2.4. Phương pháp. : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Phân lập các chủng Azotobacter từ mẫu đất 36 3.2. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính nitrogenase 37 3.2.1. Thử hoạt tính catalase 37 3.2.2. Xác định