Từ các mẫu thu được qua quá trình phân lập và nuơi cấy trên mơi trường Ashby đã thu được 15 chủng vi khuẩn. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập
STT Nguồn phân lập Tên
chủng Đặc điểm khuẩn lạc 1 L1 Trịn, trắng đục, bĩng, lồi, cĩ nhân đen 2 L2 Trịn, trắng đục, nhẵn,ướt 3
Đại Cát-Ninh Xuân-Ninh Hịa- Khánh Hịa ( pH=6.6)
L3 Trịn, trắng trong, bĩng, lồi
4 L4 Trịn, trắng trong, bĩng lồi, sinh
chất màu sau 3 ngày
5 L5 Trịn, trắng đục, bĩng, lồi
6 L6 Trịn, trắng đục, bĩng, nhầy ướt
7 L7 Trịn, trắng trong, bĩng, nhầy ướt
8 L8 Trịn, trắng đục, bĩng, lồi, sinh
chất màu sau 2 ngày
9 L9 Trịn, trắng đục, bĩng, lồi
10 L10 Trịn, trắng trong, bĩng, nhẵn
11 L11 Trịn, trắng trong, nhỏ li ti, lồi
12
Phước Lâm-Ninh Xuân-Ninh Hịa-Khánh Hịa ( pH=6,8 )
L12 Trịn, trắng đục, bĩng, nhầy
13 L13 Trịn, trắng đục, bĩng, lồi
14 L14 Trịn, trắng trong, bĩng, lồi
15
Vạn Khê -Ninh Lộc-Ninh Hịa- Khánh Hịa ( pH=6,7 )
L15 Trịn, trắng trong, bĩng, lồi, nhỏ li ti
37
Hình 3.1 (a): Hình thái khuẩn lạc của chủng L8
Hình 3.1 (b): hình thái tế bào chủng L8 dưới độ phĩng đại X-1000
Hình 3.1 (a): Hìn h thá i khuẩn lạc của c hủng L8 Hình 3.1 (b) : hì nh thái tế bào chủ ng L8 dưới độ phĩng đại X -1000
Nhận xét:
Từ các mẫu đất chúng tơi đã phân lập được 15 chủng vi khuẩn. Trong đĩ, mẫu đất lấy từ Phước Lâm-Ninh Xuân-Ninh Hịa-Khánh Hịa phân lập được nhiều chủng vi khuẩn nhất (9/15 chủng) điều này cĩ thể giải thích là do vùng đất này cĩ pH=6,8 thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập
nên số lượng các chủng vi khuẩn phân lập trên mẫu đất lấy từ Phước Lâm-Ninh
Xuân-Ninh Hịa-Khánh Hịa nhiều hơn hẳn so với các mẫu đất khác. Từ các chủng vi khuẩn phân lập được chúng tơi sẽ tiếp tục tuyển chọn để tìm ra các chủng cĩ hoạt tính nitrogenase mạnh để tiến hành khảo sát các điều kiện nuơi cấy thích hợp. 3.2. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật cĩ hoạt tính nitrogenase
3.2.1. Thử hoạt tính catalase
Để kiểm tra hoạt tính catalase của các chủng vi khuẩn, tiến hành nhỏ một giọt H2O2 30% vào tâm khuẩn lạc trên đĩa peptri, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2.
38
Bảng 3.2: Hoạt tính catalase của 15 chủng phân lập Chủng vi khuẩn L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11 L12 L13 L14 L15 Hoạt tính catalase (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-)
Kết quả cho thấy, cĩ 8 chủng dương tính với thuốc thử bao gồm các chủng : L1, L2, L3, L4, L8, L10, L12, L14 điều này chứng tỏ đây là các chủng vi khuẩn cĩ khả năng sinh enzyme catalase và chúng là những vi khuẩn hiếu khí. Phản ứng dương tính được nhận thấy chính là do các phân tử oxy sinh ra làm xuất hiện bọt khí, sơ đồ phản ứng như sau:
H2O2 catalase 2H2O + O2
Cĩ 7 chủng âm tính với thuốc thử bao gồm: L5, L6, L7, L9, L11, L13, L15 điều này chứng tỏ đây là những vi khuẩn khơng cĩ khả năng sinh enzyme catalase và chúng là những vi khuẩn kị khí.
Vì Azotobacter là chủng vi khuẩn hiếu khí nên ta cĩ thể kết luận các chủng vi
khuẩn kị khí gồm: L5, L6, L7, L9, L11, L13, L15 khơng phải là vi khuẩn
Azotobacter, các chủng cĩ hoạt tính catalase (+) bao gồm: L1, L2, L3, L4, L8,
L10, L12, L14 sẽ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
39 3.2.2. Xác định khả năng di động
Xác định khả năng di động của vi khuẩn bằng phương pháp quan sát trực tiếp sự chuyển động của vi khuẩn trong tiêu bản giọt ép dưới kính hiển vi. Kết quả cho thấy 8 chủng bao gồm: L1, L2, L3, L4, L8, L10, L12, L14 đều cĩ khả năng di động.
3.2.3. Xác định khả năng cố định đạm bằng thuốc thử Nessler
Sau khi sơ tuyển được 08 chủng vi khuẩn, chúng tơi tiếp tục tuyển chọn các chủng cĩ khả năng cố định nitơ mạnh dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Nessler. Kết quả được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3: Hoạt tính nitrogenase của các chủng phân lập
Chủng Hoạt tính nitrogenase ( µgN/ml) L1 47,2 L2 29,3 L3 23,5 L4 32,3 L8 65,0 L10 18,1 L12 19.0 L14 19,4
40 Nhận xét:
Kết quả cho thấy, cả 8 chủng đều cĩ khả năng cố định đạm và dựa vào kết quả của các thí nghiệm đã được tiến hành chúng tơi cĩ thể kết luận 8 chủng bao
gồm: L1, L2, L3, L4, L8, L10, L12, L14 là các chủng Azotobacter. Trong đĩ chủng
L8 là chủng cĩ hoạt tính nitrogenase cao nhất vì vậy chủng L8 sẽ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.4. Hoạt tính nitrogenase của 8 chủng phân lập
3.3. Xác định các điều kiện nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.3.1. Xác định pH nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.3.1. Xác định pH nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chủng L8 được nuơi cấy lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ phịng. Để xác định pH nuơi cấy thích hợp, tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường được chỉnh pH lần lượt là 6,0; 6,4; 6,8; 7,2; 7,6. Đo khả năng sinh trưởng (bằng phép đo OD) trước và sau nuơi cấy.Kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
41
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng L8
Chủng pH Giá trị OD ( 60h ) 6 0,771 6,4 1,241 6,8 1,418 7,2 1,352 L8 7,6 1,368
Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 Nhận xét:
Chủng L8 cĩ khả năng sinh trưởng trong dải pH từ 6-7,6 tuy nhiên ở pH quá cao hoặc quá thấp đều dẫn đến giảm khả năng sinh trưởng của chủng L8. Khi nuơi cấy chủng L8 ở pH thấp ( pH=6 ) thì sinh khối vi khuẩn sau 60h nuơi cấy chỉ bằng 54% so với nuơi cấy ở pH tối ưu. Khi nuơi cấy chủng L8 ở pH= 7,6 thì sinh khối vi khuẩn sau 60h nuơi cấy cũng bị ảnh hưởng, cụ thể là giảm chỉ cịn 96% so với nuơi cấy ở pH tối ưu. Kết quả cho thấy, mơi trường nuơi cấy cĩ pH= 6,8 là tối ưu cho chủng L8 sinh trưởng và phát triển. Đồng thời, pH=6,8 cũng chính là giá trị pH của mẫu đất mà chúng tơi phân lập chủng vi khuẩn trên, đây là một điểm thuận
42
lợi để ứng dụng chủng vi khuẩn đã tuyển chọn vào việc sản xuất phân bĩn vi sinh sử dụng cho vùng đất Ninh Hịa và các vùng lân cận. Tiến hành lên men ở bình tam giác thể tích 500ml, xác định được mật độ vi khuẩn trong bình là 3.108 CFU/ml. 3.3.2 Xác định nhiệt độ nuơi cấy cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chủng L8 được nuơi cấy lắc 150/phút ở các nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C, 400C. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng (bằng phép đo OD) trước và sau nuơi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng L8
Chủng Nhiệt độ (0C) Giá trị OD ( 60h ) 20 1,584 25 1,736 30 2,065 35 1,886 L8 40 0,477
43 Nhận xét:
Chủng L8 sinh trưởng tốt trong dải nhiệt độ từ 20-350C, nhưng khi nuơi cấy chủng L8 ở 400C thì vi khuẩn hầu như đã ngừng sinh trưởng, sinh khối vi khuẩn sau 60h giảm xuống chỉ cịn 2% so với sinh khối nuơi cấy ở nhiệt độ tối ưu. Khi nuơi cấy chủng L8 ở 200C thì sinh khối vi khuẩn sau 60h nuơi cấy cũng giảm đi đáng kể chỉ cịn 75% so với sinh khối nuơi cấy ở nhiệt độ tối ưu. Nhiệt độ tối thích cho chủng L8 sinh trưởng là 300C. Đây là nhiệt độ phịng nên rất thuận lợi cho việc nuơi cấy vi khuẩn cũng như nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn trên để sản xuất phân bĩn vi sinh.
3.3.3. Xác định nồng độ đường nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn chọn
Chủng L8 được nuơi cấy lắc 150/phút ở các nồng độ đường: 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng(bằng phép đo OD) trước và sau nuơi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6
44
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng sinh trưởng của chủng L8
Chủng Nồng độ đường (%) Giá trị OD ( 60h ) 0,125 0,886 0,25 1,850 0,5 1,692 1 1,617 L8 2 1,505
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 Nhận xét:
Chủng L8 phát triển tốt trong mơi trường cĩ nồng độ đường từ 0,125-2%. Tuy nhiên ở các nồng độ đường quá cao hoặc quá thấp đều làm giảm khả năng sinh trưởng của chủng L8. Khi nuơi cấy chủng L8 trong mơi trường cĩ nồng độ đường thấp (0,125%) sinh khối vi khuẩn sau 60h nuơi cấy giảm chỉ cịn 49% so với sinh khối nuơi cấy trong mơi trường cĩ nồng độ đường tối ưu. Khi nuơi cấy chủng L8 trong mơi trường cĩ nồng độ đường 2% sinh khối vi khuẩn sau 60h nuơi cấy cũng giảm chỉ cịn 82% so với sinh khối nuơi cấy trong mơi trường cĩ nồng độ đường tối ưu. Kết quả cho thấy, nồng độ đường tối thích cho chủng L8 sinh trưởng là 0,25%.
45
3.3.4. Xác định nồng độ muối nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Chủng L8 được nuơi cấy lắc 150/phút ở các nồng độ đường: 0,0075%, Chủng L8 được nuơi cấy lắc 150/phút ở các nồng độ đường: 0,0075%, 0,015%, 0,03%, 0,06%, 0,12%. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng (bằng phép đo OD) trước và sau nuơi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng L8
Chủng Nồng độ muối (%) Giá trị OD ( 60h ) 0,0075 1,580 0,015 1,670 0,03 1,703 0,06 1,882 L8 0,12 1,733
Hình 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 Nhận xét:
Chủng L8 phát triển tốt trong mơi trường cĩ nồng độ muối từ 0,0075-0,12%. Tuy nhiên ở các nồng độ muối quá cao hoặc quá thấp đều làm giảm khả năng sinh trưởng của chủng L8. Khi nuơi cấy chủng L8 trong mơi trường cĩ nồng độ muối thấp (0,0075%) sinh khối vi khuẩn sau 60h nuơi cấy giảm chỉ cịn 83% so với sinh khối nuơi cấy trong mơi trường cĩ nồng độ muối tối ưu. Khi nuơi cấy chủng L8
46
trong mơi trường cĩ nồng độ muối 0,12% sinh khối vi khuẩn sau 60h nuơi cấy cũng giảm chỉ cịn 92% so với sinh khối nuơi cấy trong mơi trường cĩ nồng độ muối tối ưu. Kết quả cho thấy, nồng độ muối tối thích cho chủng L8 sinh trưởng là 0,06%. 3.3.5. Nghiên cứu xác định thời gian nuơi cấy thích hợp và ảnh hưởng của thời gian đến khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Chủng L8 được nuơi cấy lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ, pH, nồng độ đường, nồng độ muối thích hợp. Để xác định thời gian nuơi cấy thích hợp, và khả năng cố định đạm tiến hành lấy mẫu xác định hoạt tính nitrogenase và đo khả năng sinh trưởng (bằng phép đo OD) sau: 0h; 6h;12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h. . Đồng thời, sau: 0h; 6h; 12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h lấy mẫu để tiến hành xác định hoạt tính nitrogenase bằng thuốc thử Nessler sau đĩ đem mẫu đi đo OD (bước sĩng 420nm), từ giá trị OD đo được thay vào phương trình đường chuẩn để xác định hoạt tính nitrogenase theo thời gian.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrogenase của chủng L8
Chủng Thời gian (giờ) Giá trị OD Hoạt tính nitrogenase
0 0,099 25,2 6 0,116 31,0 12 0,225 33,5 18 0,341 77,5 24 0,554 110,5 30 0,762 149,7 36 0,989 187,5 42 1,177 286,7 48 1,006 197,0 L8 54 0,748 153,2
47
Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrogenase của chủng L8
Nhận xét:
Quan sát chủng trong quá trình nuơi cấy, chủng L8 sẽ phát triển qua 4 pha liên tiếp bao gồm: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha tử vong.
Pha lag được tính từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia, nhưng trọng lượng và thể tích tế bào tăng rõ rệt do trong thời kì này vi khuẩn đang làm quen với mơi trường và chất dinh dưỡng..Kết quả cho thấy, pha lag diễn ra trong 18 giờ đầu của quá trình nuơi cấy. Trong pha này mật độ vi sinh vật trong mơi trường nuơi cấy cịn rất thấp nên trong 18h đầu hoạt tính cố định đạm của chủng L8 cịn ở mức thấp.
Đến pha log (từ 18h đến 36h nuơi), nồng độ tế bào tăng nhanh chĩng vì sau pha lag trong mơi trường nuơi đã cĩ số lượng lớn các tế bào đã thích nghi. Bên cạnh đĩ, đây cũng là thời gian vi sinh vật cĩ khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào lớn nhất để phân giải các chất dinh dưỡng trong mơi trường. Vì vậy, giai đoạn này các tế bào vi sinh vật diễn ra quá trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ nhất, dẫn đến số lượng tế bào tăng theo lũy thừa. Chính vì vậy lượng đạm tạo thành cũng tăng lên một cách mạnh mẽ. Kết quả cho thấy sau 18h nuơi, giá trị OD đo được của chủng L8 là 0,341 (đạt 29% so với giá trị OD cực đại). Ở pha này OD630 tăng liên tục, cứ
48
sau 6h nuơi cấy thì giá trị OD630 tăng khoảng 18÷ 20% (so với giá trị cực đại) cho đến khi các chủng phát triển chậm lại sau 36h nuơi cấy. Ở cuối pha này, mặc dù số lượng tế bào chưa đạt lớn nhất nhưng quần thể tế bào cĩ trạng thái sinh hĩa, sinh lý cơ bản là như nhau và tế bào vi sinh vật đã hồn thiện nhất cho nên việc nuơi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hĩa và sinh lý của vi sinh vật.
Bước sang pha cân bằng (từ 36h đến 48h nuơi) thì tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất giảm. Số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH giảm. Mặc dù ở giai đoạn này tốc độ tăng trưởng của tế bào vi sinh vật chậm lại nhưng đây lại là giai đoạn số lượng tế bào vi sinh vật là lớn nhất đồng thời hoạt tính nitrogenase cũng đạt cực đại nên thường chọn thời điểm đầu pha cân bằng để thu sinh khối vi sinh vật.
Pha suy vong (sau 48h) thì nồng độ tế bào của chủng L8 bắt đầu giảm xuống. Sau 54h nuơi thì mật độ tế bào của chủng giảm nhanh, nồng độ tế bào của chủng L8 chỉ cịn đạt được 64% (so với giá trị cực đại). Đồng thời hoạt tính nitrogenase cũng giảm đáng kể, đến 54h hoạt tính nitrogenase chỉ bằng 53% so với giá trị cực đại. Trong pha này hoạt tính nitrogenase giảm là do số lượng vi sinh vật trong mơi trường nuơi cấy giảm đi một cách nhanh chĩng, đồng thời vi sinh vật cịn lại trong mơi trường lại sử dụng lượng đạm đã được cố định để làm nguồn dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Kết quả ở bảng 3.8 và hình 3.9 cho thấy từ sau 48h vi sinh vật đã đến giai đoạn suy vong do chất dinh dưỡng trong mơi trường giảm xuống, sản phẩm bài tiết quá nhiều, vi khuẩn chết đi và tự phân nhờ các enzyme của bản thân. Vì vậy trong quá trình nuơi cấy tránh để vi sinh vật đạt đến giai đoạn này.
Từ kết quả thí nghiệm ta thấy khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzyme của chủng L8 tăng mạnh sau 18h nuơi cấy, bắt đầu pha ổn định sau 36h nuơi cấy. Sinh khối tế bào và hoạt tính nitrogenase đạt giá trị cực đại sau 42 giờ nuơi cấy lắc. Pha suy vong bắt đầu từ sau 48h, lúc này sinh khối tế bào và hoạt tính nitrogenase giảm đi nhanh chĩng. Như vậy, thời gian thích hợp để thu sinh khối chủng L8 là sau 42h
49
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn đến khả năng nảy mầm của hạt lúa của hạt lúa
Ảnh hưởng của nồng độ dịch nuơi cấy chủng L8 đến khả năng nảy mầm của hạt lúa được trình bày trong bảng 3.9.