Chủng L8 được nuơi cấy lắc 150/phút ở các nồng độ đường: 0,0075%, 0,015%, 0,03%, 0,06%, 0,12%. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng (bằng phép đo OD) trước và sau nuơi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng L8
Chủng Nồng độ muối (%) Giá trị OD ( 60h ) 0,0075 1,580 0,015 1,670 0,03 1,703 0,06 1,882 L8 0,12 1,733
Hình 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh trưởng của chủng L8 Nhận xét:
Chủng L8 phát triển tốt trong mơi trường cĩ nồng độ muối từ 0,0075-0,12%. Tuy nhiên ở các nồng độ muối quá cao hoặc quá thấp đều làm giảm khả năng sinh trưởng của chủng L8. Khi nuơi cấy chủng L8 trong mơi trường cĩ nồng độ muối thấp (0,0075%) sinh khối vi khuẩn sau 60h nuơi cấy giảm chỉ cịn 83% so với sinh khối nuơi cấy trong mơi trường cĩ nồng độ muối tối ưu. Khi nuơi cấy chủng L8
46
trong mơi trường cĩ nồng độ muối 0,12% sinh khối vi khuẩn sau 60h nuơi cấy cũng giảm chỉ cịn 92% so với sinh khối nuơi cấy trong mơi trường cĩ nồng độ muối tối ưu. Kết quả cho thấy, nồng độ muối tối thích cho chủng L8 sinh trưởng là 0,06%. 3.3.5. Nghiên cứu xác định thời gian nuơi cấy thích hợp và ảnh hưởng của thời gian đến khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Chủng L8 được nuơi cấy lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ, pH, nồng độ đường, nồng độ muối thích hợp. Để xác định thời gian nuơi cấy thích hợp, và khả năng cố định đạm tiến hành lấy mẫu xác định hoạt tính nitrogenase và đo khả năng sinh trưởng (bằng phép đo OD) sau: 0h; 6h;12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h. . Đồng thời, sau: 0h; 6h; 12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h lấy mẫu để tiến hành xác định hoạt tính nitrogenase bằng thuốc thử Nessler sau đĩ đem mẫu đi đo OD (bước sĩng 420nm), từ giá trị OD đo được thay vào phương trình đường chuẩn để xác định hoạt tính nitrogenase theo thời gian.
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrogenase của chủng L8
Chủng Thời gian (giờ) Giá trị OD Hoạt tính nitrogenase
0 0,099 25,2 6 0,116 31,0 12 0,225 33,5 18 0,341 77,5 24 0,554 110,5 30 0,762 149,7 36 0,989 187,5 42 1,177 286,7 48 1,006 197,0 L8 54 0,748 153,2
47
Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính nitrogenase của chủng L8
Nhận xét:
Quan sát chủng trong quá trình nuơi cấy, chủng L8 sẽ phát triển qua 4 pha liên tiếp bao gồm: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha tử vong.
Pha lag được tính từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia, nhưng trọng lượng và thể tích tế bào tăng rõ rệt do trong thời kì này vi khuẩn đang làm quen với mơi trường và chất dinh dưỡng..Kết quả cho thấy, pha lag diễn ra trong 18 giờ đầu của quá trình nuơi cấy. Trong pha này mật độ vi sinh vật trong mơi trường nuơi cấy cịn rất thấp nên trong 18h đầu hoạt tính cố định đạm của chủng L8 cịn ở mức thấp.
Đến pha log (từ 18h đến 36h nuơi), nồng độ tế bào tăng nhanh chĩng vì sau pha lag trong mơi trường nuơi đã cĩ số lượng lớn các tế bào đã thích nghi. Bên cạnh đĩ, đây cũng là thời gian vi sinh vật cĩ khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào lớn nhất để phân giải các chất dinh dưỡng trong mơi trường. Vì vậy, giai đoạn này các tế bào vi sinh vật diễn ra quá trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ nhất, dẫn đến số lượng tế bào tăng theo lũy thừa. Chính vì vậy lượng đạm tạo thành cũng tăng lên một cách mạnh mẽ. Kết quả cho thấy sau 18h nuơi, giá trị OD đo được của chủng L8 là 0,341 (đạt 29% so với giá trị OD cực đại). Ở pha này OD630 tăng liên tục, cứ
48
sau 6h nuơi cấy thì giá trị OD630 tăng khoảng 18÷ 20% (so với giá trị cực đại) cho đến khi các chủng phát triển chậm lại sau 36h nuơi cấy. Ở cuối pha này, mặc dù số lượng tế bào chưa đạt lớn nhất nhưng quần thể tế bào cĩ trạng thái sinh hĩa, sinh lý cơ bản là như nhau và tế bào vi sinh vật đã hồn thiện nhất cho nên việc nuơi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hĩa và sinh lý của vi sinh vật.
Bước sang pha cân bằng (từ 36h đến 48h nuơi) thì tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất giảm. Số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH giảm. Mặc dù ở giai đoạn này tốc độ tăng trưởng của tế bào vi sinh vật chậm lại nhưng đây lại là giai đoạn số lượng tế bào vi sinh vật là lớn nhất đồng thời hoạt tính nitrogenase cũng đạt cực đại nên thường chọn thời điểm đầu pha cân bằng để thu sinh khối vi sinh vật.
Pha suy vong (sau 48h) thì nồng độ tế bào của chủng L8 bắt đầu giảm xuống. Sau 54h nuơi thì mật độ tế bào của chủng giảm nhanh, nồng độ tế bào của chủng L8 chỉ cịn đạt được 64% (so với giá trị cực đại). Đồng thời hoạt tính nitrogenase cũng giảm đáng kể, đến 54h hoạt tính nitrogenase chỉ bằng 53% so với giá trị cực đại. Trong pha này hoạt tính nitrogenase giảm là do số lượng vi sinh vật trong mơi trường nuơi cấy giảm đi một cách nhanh chĩng, đồng thời vi sinh vật cịn lại trong mơi trường lại sử dụng lượng đạm đã được cố định để làm nguồn dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Kết quả ở bảng 3.8 và hình 3.9 cho thấy từ sau 48h vi sinh vật đã đến giai đoạn suy vong do chất dinh dưỡng trong mơi trường giảm xuống, sản phẩm bài tiết quá nhiều, vi khuẩn chết đi và tự phân nhờ các enzyme của bản thân. Vì vậy trong quá trình nuơi cấy tránh để vi sinh vật đạt đến giai đoạn này.
Từ kết quả thí nghiệm ta thấy khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzyme của chủng L8 tăng mạnh sau 18h nuơi cấy, bắt đầu pha ổn định sau 36h nuơi cấy. Sinh khối tế bào và hoạt tính nitrogenase đạt giá trị cực đại sau 42 giờ nuơi cấy lắc. Pha suy vong bắt đầu từ sau 48h, lúc này sinh khối tế bào và hoạt tính nitrogenase giảm đi nhanh chĩng. Như vậy, thời gian thích hợp để thu sinh khối chủng L8 là sau 42h
49
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn đến khả năng nảy mầm của hạt lúa của hạt lúa
Ảnh hưởng của nồng độ dịch nuơi cấy chủng L8 đến khả năng nảy mầm của hạt lúa được trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng L8 lên khả năng nảy mầm của hạt lúa
STT Tỷ lệ dịch vi khuẩn : nước cất Tỷ lệ nảy mầm (%)
0 0 : 10 81 1 1 : 9 84 2 1 : 19 95 3 1 : 29 90 4 1: 39 86 5 1 : 49 84
Hình 3.10: Ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng L8 lên khả năng nảy mầm của hạt lúa
50 Nhận xét:
Từ bảng 3.9 và hình 3.10 cho thấy, khi cho hạt lúa giống ngâm trong dung dịch cĩ bổ sung dịch vi khuẩn chủng L8 thì tỉ lệ nảy mầm của hạt lúa luơn cao hơn mẫu đối chứng. Tuy nhiên khi ngâm hạt lúa trong dung dịch cĩ tỷ lệ dịch vi khuẩn: nước cất là 1:9 và 1:49 thì tỷ lệ nảy mầm của hạt lúa tăng khơng đáng kể ( chỉ tăng 3% so với mẫu đối chứng). Khi ngâm hạt lúa trong dung dịch cĩ tỷ lệ dịch vi khuẩn: nước cất là 1:29 và 1:39 thì tỷ lệ nảy mầm của hạt lúa cĩ tăng hơn so với tỷ lệ 1:9 và 1:49 nhưng vẫn thấp hơn so với tỷ lệ 1:19. Ở đĩa 1 nồng độ vi sinh vật cao tuy nhiên tỷ lệ nảy mầm khơng đạt hiệu suất cao nhất điều này cĩ thể là do nồng độ các sản phẩm trao đổi chất tạo thành gây ức chế lên quá trình nảy mầm của hạt, trong khi tại các đĩa 3,4,5 khi mật độ vi sinh vật giảm thì nồng độ các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật lại ở mức độ phù hợp, chính điều này đã kích thích sự nảy mầm của hạt.Tỷ lệ nảy mầm của hạt lúa tăng mạnh nhất khi ngâm hạt lúa trong dung dịch cĩ tỷ lệ dịch vi khuẩn: nước cất là 1:19 ( tăng 14% so với mẫu đối chứng ). Như vậy trong thực tế sản xuất cĩ thể tiến hành ngâm hạt lúa giống vào trong dung dịch cĩ tỷ lệ dịch nuơi cấy chủng vi khuẩn L8: nước cất là 1:19 để tăng khả năng nảy mầm của hạt giống.
51
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
Sau quá trình phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter cĩ hoạt tính
nitrogenase từ đất trồng lúa tại huyện Ninh Hịa, tỉnh Khánh Hịa chúng tơi đã thu được một số kết quả sau:
1. Đã phân lập được 15 chủng vi khuẩn từ đất trồng lúa tại huyện Ninh hịa,
tỉnh Khánh Hịa. Trong đĩ, 8 chủng vi khuẩn Azotobacter (bao gồm: L1, L2,
L3, L4, L8, L10, L12, L14) cĩ hoạt tính nitrogenase. Chủng L8 là chủng vi
khuẩn Azotobacter cĩ hoạt tính nitrogenase cao nhất trong tất cả các chủng
tuyển chọn.
2. Điều kiện lên men thích hợp cho chủng L8 là: - pH mơi trường nuơi cấy là 6,8. - Nhiệt độ nuơi cấy thích hợp là 300C.
- Nồng độ đường trong mơi trường nuơi cấy thích hợp là 0,25%. - Nồng độ muối trong mơi trường nuơi cấy thích hợp là 0,06%. - Thời gian nuơi cấy thích hợp là 42h.
3. Dịch nuơi cấy chủng vi khuẩn L8 cĩ khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt lúa, khi ngâm hạt lúa trong dung dịch cĩ tỷ lệ dịch vi khuẩn: nước cất là 1:19 thì tỷ lệ nảy mầm của hạt lúa đạt cao nhất, tăng 14% so với mẫu đối chứng. 4.2 Kiến nghị
Qua quá trình nghiên cứu chúng tơi đề nghị một số ý kiến như sau: 1. Định danh chủng L8.
2. Khảo sát sâu hơn các điều kiện nuơi cấy tối ưu cho chủng L8 trong cơng nghiệp.
3. Tiếp tục nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm phân bĩn vi sinh từ chủng L8.
52
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Gia Huy, Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở cơng nghệ vi sinh vật và ứng dụng,
Nhà xuất bản Giáo Dục.
2. Lê Văn Tiềm, Trần Cơng Tàu (1999), Phân tích đất cây trồng, Nhà xuất bản
Nơng nghiệp.
3. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2000), Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm,
Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
4. Nguyễn Đức Lượng (2006), Cơng nghệ vi sinh vật ( tập 1), Nhà xuất bản Đại học
quốc gia.
5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước,
Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương
pháp nghiên cứu vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa hoc kỹ thuật Hà Nội.
6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học,
Nhà xuất bản Giáo Dục.
7. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (2002),
Cơng Nghệ Enzym, Nhà xuất bản Nơng Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng Anh
8. Aquilanti L., Favilli F., Clemanti F. (2004), “Comperison of different strategies
for isolation and preliminaru identification of Azotobacter from soil sampes”, Soil
Biology and Biochemistry, 36, 1475-1483.
9. Bhatia R., Ruppel S. (2008), “Diversity studies of Azotobacter spp from wheat cropping systems of India”, Joural of Basic Microbiology, 48 (4), 455-463.
10. Bretrand H., Nalin H., Bally R. (2001), “Isolation and identification of the most
efficient plant growth promoting bacterio associated with canola”, Biology and
Fertility of Soil, 33, 152-156.
11. Chaway C.P, Hynes R.K, Nelson L.M (1989), “Plant growth-promoting
rhizobacteria effects on growth and nitrogen fixation of lentils and pea”, Soil
53
12. Damir O., Mladen D. (2011), “Cultivation of the Bacterium Azotobacter
chroococcum for preparation of biofertilizers”, African Journal of Biotechnology,
Vol. 10(16), 3104-3111.
13. Duff J.T, Wyss O. (1961), “Isolation and classification of a new series of
Azotobacter bacteriophage”, J.gen.Microbial, 24, 273-289.
14. Gatierrez I., Torres A.B, Moreno N. (2011), “Optimising carbon and nitrogen
sources for Azotobacter chroococcum growth”, African Journal of Biotechnology,
10 (15), 2951-2958.
15. Glick B.R (1995), “The enhancement og plant growth by free-living bacteria”,
Canadian Journal of Microbiology, 41, 109-117.
16. Islam M.Z, Sharif D.I, Hossain M.A (2008), “A comparative study of
Azotobacter spp. from diffirent soil samples”, J.Soil.Nature, 2 (3), 16-19.
17. Jones I.W, Greaves J.E (1993), “Azotobacter chroococcum and its relationship to accessory growth factory”, African Journal of Biotechnology, 5 (2), 751-763. 18. Kizilkaya R. (2008), “Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp. strain
isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the
microbiologycal properties of soils”, J.Environ. Biol, 30 (1), 73-82.
19. Kloepper J.W, Hume D.J, Scher F.M (1988), “Plant growth-promoting
rhizobacteria on canola”, Plant Disease, 72, 42-45.
20. Sachin D. (2009), “Effect of Azotobacter chroococcum (PGPR) on the Growth of
Bamboo (Bambusa bamboo) and Maize ( Zea mays) Plants”, Biofrontiers, 1, 24-31.
21. Sandeep C., Rushmi S.N, Shurmila V. , Surekha R., Tejuswini R., Suresh C.K
(2011), “Growth Response of Amaranthus Gangeticus Azotobacter chroococcum isolated from different Agroclimatic Zones Kamalaka”, Journal of Phytology, 65
(3), 56-73
22. Sarwar K., Macrac I.C (1992), “Determination of bacterially derived auxins
using a microplate method” Lett. Appl. Microbiol, (20), 282-586.
23. Shaukat et al. (2006), “Growth response of triticum aestivum to plant growth promoting rhizobacteria used as a biofertilizers”, Reseach Journal of Microbiology,
54
24. Suliasih, Widawati S. (2005), “Isolation and identification of Phosphate solubilizing and nitrogen fixing Bacteria from soil in Wamena Biogical Garden,
Jayawijaya, Papua”, Biodiversitas, 6, 157-177.
25. Vigyan K., Sirohi K. (2010), “Methodology of nitrogen Biofertilizer
production”, Journal of Advances in Developmental Research, 1 (1), 3-6.
* TRANG WEB
55 PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Thành phần mơi trường phân lập
Sucrose 20g CaCO3 5g K2HPO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,2g NaCl 0,2g K2SO4 0,1g Agar 15g pH ( ở 250C) 6,8 2
Phụ lục 2: Thành phần mơi trường lên men
KH2PO4 0,5g MgSO4.7H20 0,3g NaCl 0,3g FeSO4 0,005g MnSO4 0,005g (NH4)6Mo7O24 0,005g CaCO3 3,5g Propynol 380 ml Sucrose 20g pH (ở 250C) 6,8 2