Mẫu đất để phân lập vi khuẩn được lấy từ đất trồng lúa thuộc hai xã Ninh Xuân và Ninh Lộc, huyện Ninh Hịa, tỉnh Khánh Hịa.
Bảng 2.1: Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn
STT Ngày phân lập Nơi phân lập
1 6.2.2012 Đại Cát-Ninh Xuân-Ninh Hịa-Khánh Hịa
Kinh độ: 109005’21,29’’Đ Vĩ độ: 12030’01,28’’
2 6.2.2012 Phước Lâm-Ninh Xuân-Ninh Hịa-Khánh
Hịa
Kinh độ: 109004’10,27’’Đ Vĩ độ: 12030’24,28’’
3 6.2.2012 Vạn Khê-Ninh Lộc-Ninh Hịa-Khánh Hịa
Kinh độ: 109007’38,25’’Đ Vĩ độ: 1207’18,16’’
21 2.1.2. Thiết bị chuyên dụng
- Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha). - Tủ sấy (Binder, Đức).
- Máy lắc (GFL 3005,Đức).
- Nồi khử trùng autoclave (Tommy Kogyo Co, Ltd, Nhật Bản).
- Máy định lượng protein bằng quang phổ hấp thụ phân tử (UV/VIS) (Carry 100 Bio, Úc).
- Kính hiển vi 3 mắt ngắm cĩ camera và máy tính (Olympic, Mỹ). - Tủ lạnh LG-Nhật Bản.
- Cân điện tử.
2.1.3. Hĩa chất, mơi trường và thuốc thử
a) Mơi trường phân lập vi khuẩn (mơi trường Ashby)
Sucrose 20g CaCO3 5g K2HPO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,2g NaCl 0,2g K2SO4 0,1g Agar 15g pH ( ở 250C) 6,8 2
Hịa tan các thành phần của mơi trường trong 1lít nước cất, điều chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác. Đậy nút bơng, giấy báo rồi đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1050C trong 30 phút. Việc bao gĩi phải thật kín và cẩn thận để sau khi khử trùng khơng bị bật nút rất dễ nhiễm vi sinh vật, tránh mất nước và làm pH thay đổi.
22 b) Mơi trường lên men
KH2PO4 0,5g MgSO4.7H20 0,3g NaCl 0,3g FeSO4 0,005g MnSO4 0,005g (NH4)6Mo7O24 0,005g CaCO3 3,5g Propynol 380 ml Sucrose 20g pH (ở 250C) 6,8 2
Hịa tan các thành phần của mơi trường trong 1lít nước cất, điều chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác. Đậy nút bơng, giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1050C trong 30 phút.
c) Dung dịch nước muối sinh lý
Hịa tan 8,5g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút rồi để nguội.
d) Dung dịch H2O2 30%
Dung dịch H2O2 30% là dung dịch được sử dụng để thử hoạt tính catalase. e) Thuốc thử Nessler
- Dung dịch KCl 20%.
- Dung dịch muối KNaC4H4O6.4H2O (Tactrat Kali Natri) 50g muối hịa tan trong 100ml nước cất.
- Dung dịch NH4Cl tiêu chuẩn mẹ (0,1mg N/ml) 0,382g NH4Cl tinh khiết sấy khơ pha thành 1 lít.
Dung dịch NH4Cl đem dùng cĩ nồng độ 0,01 mgN/ml, lấy dung dịch mẹ pha lỗng 10 lần bằng nước cất.
-Thuốc thử Nessler: 15g HgI2 và 10g KI hịa vào 500ml nước cất, tiếp tục cho vào 40g NaOH. Quấy đều cho tan, để lắng vài ngày, gạn dung dịch rồi cho vào bình màu nâu để dùng.
23
Tất cả các dung dịch thuốc thử trên đều pha bằng nước cất vơ trùng, khơng chứa đạm.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu
Đề tài sử dụng cách tiếp cận kế thừa và chọn lọc các phương pháp phân lập và
tuyển chọn các chủng Azotobacter cĩ khả năng sinh enzyme nitrogenase theo sơ đồ:
Hình 2.2: Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu Mẫu
Phân lập
Pha lỗng Cấy trang Cấy ria Khuẩn lạc
Giữ giống
Tuyển chọn chủng Azotobacter cĩ
hoạt tính nitrogenase
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuơi cấy vi khuẩn đến sự nảy mầm
của hạt lúa
Xác định các điều kiện nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
24
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Azotobacter từ mẫu đất
Mục tiêu của thí nghiệm là tuyển chọn được chủng vi khuẩn Azotobacter cĩ
hoạt tính nitrogenase mạnh. Thí nghiệm được thực hiện theo các bước sau: Xử lý mẫu
Mẫu đất sau khi được lấy từ nơi phân lập sẽ được vận chuyển về phịng thí nghiệm, sau đĩ dùng đĩa petri vơ trùng cân 10g đất (trước khi cân phải lau cân bằng cồn 80% để khử trùng ).
Cho 10g đất vừa cân được vào bình tam giác 250 ml cĩ chứa sẵn 90ml nước cất vơ trùng, vơ đạm. Đậy kín bằng nút bơng rồi đưa lên máy lắc (200 vịng/ phút) trong 15 phút. Tiến hành đo pH của đất phân lập .
Tiến hành phân lập
- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml dung dịch nước cất vơ trùng, vơ đạm như trên.
- Dùng pipet vơ trùng hút 1ml dung dịch từ bình tam giác cho vào ống nghiệm đã được chuẩn bị, thu được dịch mẫu pha lỗng với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.
- Từ ống nghiệm 10-1, pha lỗng ra ống nghiệm cĩ nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1ml dung dịch từ ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml dung dịch nước cất vơ trùng, vơ đạm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm cĩ độ pha lỗng 10-2 , tiếp tục làm tương tự, ta cĩ các ống nghiệm cĩ độ pha lỗng mẫu 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.
- Mơi trường Ashby được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri vơ trùng, mỗi đĩa 10-15 ml. Dùng micropipet hút 0.1ml dịch đã pha lỗng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy trang, trang đều dịch mẫu trên mặt thạch. Sau đĩ cất và nuơi cấy mẫu phân lập ở 370C trong tủ ấm. Sau khoảng 48h vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc.
- Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa petri đã cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để thuận lợi cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 370C. Sau khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng vi khuẩn, tiến hành tinh
25
sạch nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi. Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống.
- Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng lẻ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Các chủng vi khuẩn đã được lựa chọn được cấy trên ống thạch nghiêng cĩ chứa mơi trường Ashby rồi để vào tủ ấm 370C. Sau 3-5 ngày khi vi sinh vật đã mọc tốt, đem các ống giống đi bảo quản trong tủ lạnh ở 4-60C. Sau 2-3 tháng cấy chuyền lại một lần. Để bảo quản giống được lâu từ 6 tháng đến 2 năm cĩ thể giữ giống trong paraffin lỏng vơ trùng hay giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đơng khơ.
Hình 2.3: Phương pháp phân lập vi sinh vật
2.2.3. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter cĩ hoạt tính nitrogenase mạnh nitrogenase mạnh
Phương pháp xác định khả năng di động *Nguyên tắc:
Xác định khả năng di động của vi khuẩn bằng phương pháp quan sát trực tiếp sự chuyển động của vi khuẩn trong tiêu bản giọt ép dưới kính hiển vi.
* Tiến hành:
- Nhỏ một giọt nước cất vơ trùng lên phiến kính sạch.
- Dùng que cấy vơ trùng lấy khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần quan sát cho vào giọt nước trên phiến kính.
26
- Lấy lam kính đậy lên phiến kính sao cho khơng tạo thành bọt khí giữa lam kính và phiến kính.
- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu. Nếu vi khuẩn cĩ khả năng chuyển động, chúng ta cĩ thể quan sát thấy chúng di động, thay đổi vị trí.
Xác định hoạt tính catalase
Cấy vi khuẩn vào đĩa petri chứa mơi trường phân lập, đặt trong tủ ấm 370C. Sau 1 ngày nhỏ 2 giọt H2O2 30% vào khuẩn lạc của vi khuẩn, nếu sủi bọt ta kết luận cĩ hoạt tính catalase, ngược lại khơng cĩ.
Xác định khả năng cố định Đạm bằng thuốc thử Nessler
* Nguyên tắc: Phần lớn đạm amơn ở trong đất đều ở dạng trao đổi nên phải dùng một dung dịch muối để đẩy nĩ ra.
NH4+ + 2K2(HgI4) + 4KOH = NH2HgOI (vàng nâu) +7KI + 3H20 + K+
Hợp chất này để lâu thì lắng xuống, do đĩ nên so màu trong khoảng 1 giờ. Trong dung dịch cần xác định khả năng cố định đạm nếu cĩ chứa các ion Ca++, Mg++ sẽ gây đục dung dịch gây sai số vì vậy cần phải cho muối Xenhet để liên kết chúng dưới dạng phức chất tan tactrat.
* Dựng đường chuẩn Nessler
Pha dung dịch chuẩn (NH4)2SO4 (0.165g/50ml), sau đĩ pha lỗng 50 lần. Từ dung dich này pha thành các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ khác nhau:
Nồng độ (NH4)2SO4 (µgN/ml) Thể tích dung dịch chuẩn (ml) Thể tích nước cất vơ đạm (ml) OD trung bình 0 0 1 0 1.04 0.2 0.8 0.22 2.07 0.4 0.6 0.473 3.11 0.6 0.4 0.704 4.15 0.8 0.2 0.974 5.19 1 0 1.219
27
Cho 1ml mỗi dung dịch vào ống nghiệm sạch.
Thêm 0,2 ml dung dịch Xenhet vào ống nghiệm, lắc đều.
Thêm 0,3 ml dung dịch Nessler vào ống nghiệm, lắc đều.
Sau 5 phút tiến hành đo mật độ quang ở bước sĩng 420nm.
Tiến hành thí nghiệm 2 lần song song, lấy số liệu trung bình.
Dựng đường chuẩn bằng phần mềm Excel.
Hình 2.4: Đường chuẩn Nessler
Ta cĩ được phương trình đường chuẩn Nessler như sau: y=0.2409x – 0.0277 * Tiến hành:
+ Sau khi nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường lên men được 48h, dùng micropipet hút 1ml dịch lên men cho vào ống nghiệm sạch, vơ trùng.
+ Thêm 0,2 ml dung dịch Xenhet vào ống nghiệm, lắc đều + Thêm 0,3 ml dung dịch Nessler vào ống nghiệm, lắc đều
+ Tiến hành đo OD ở bước sĩng 420nm để xác định độ đục sau 5 phút
+ Thay giá trị OD vào phương trình đường chuẩn để xác định hoạt tính nitrogenase.
Sau các xác định hoạt tính nitrogenase, chọn chủng cĩ hoạt tính nitrogenase mạnh nhất để tiến hành xác định các điều kiện nuơi cấy thích hợp và khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn lên sự nảy mầm của hạt lúa.
28
2.2.4. Phương pháp xác định điều kiện nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn tuyển chọn
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuơi cấy thích hợp cho chủng L8
Chọn vi khuẩn cĩ hoạt tính mạnh nhất và xác định điều kiện nuơi cấy thích hợp cho vi khuẩn tuyển chọn
Nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C, 400C pH mơi trường: 6; 6,4; 6,8; 7,2; 7,6. Nồng độ NaCl: 0,0075%; 0,015%; 0,03%; 0,06%; 0,12% Nồng độ đường: 0,125%; 0,25%; 0,5%; 1%; 2% Thời gian: 0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h, 54h
Chọn điều kiện nuơi cấy thích hợp
29
2.2.4.1. Phương pháp xác định pH nuơi cấy thích hợp *Nguyên tắc:
pH mơi trường cĩ ý nghĩa quyết định đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, một biến đổi nhỏ của pH cũng ảnh hưởng rất mạnh đến tế bào vi sinh vật. Do đĩ, việc xác định pH nuơi cấy thích hợp là rất cần thiết.
*Tiến hành:
Vi khuẩn được nuơi cấy lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ thích hợp. Để xác định pH nuơi cấy thích hợp, tiến hành nuơi cấy ở pH lần lượt là 6,0; 6,4; 6,8; 7,2; 7,6. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) trước và sau nuơi cấy, mẫu nào cĩ giá trị OD cao nhất chính là mẫu cĩ giá trị pH thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuơi cấy thích hợp cho chủng L8 Sau khi đã khảo sát được pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng L8 ta tiến hành lên men chủng vi khuẩn tuyển chọn trong bình tam giác thể tích 500ml, sau 48h tiến hành cấy trang đếm khuẩn lạc để xác định mật độ vi khuẩn trong bình lên men.
Nuơi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các pH
Xác định khả năng sinh trưởng bằng giá trị OD
Chọn pH thích hợp
30
2.2.4.2. Phương pháp xác định nhiệt độ nuơi cấy thích hợp *Nguyên tắc:
Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật cĩ thể coi là kết quả của các phản ứng hĩa học. Các phản ứng hĩa học lại phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ vì thế yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào. Mỗi lồi vi sinh vật chỉ cĩ thể tồn tại trong giới hạn nhiệt độ nhất định. Để nuơi cấy vi sinh vật thì việc nghiên cứu tìm ra nhiệt độ thích hợp cĩ ý nghĩa quan trọng.
*Tiến hành:
Vi khuẩn nuơi cấy lắc 150/phút ở các nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C, 400C. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) trước và sau nuơi cấy, mẫu nào cĩ giá trị OD cao nhất chính là mẫu cĩ giá trị nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nuơi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các nhiệt độ
200C
Xác định khả năng sinh trưởng bằng giá trị OD
Chọn nhiệt độ thích hợp
31
2.2.4.3. Phương pháp xác định nồng độ đường nuơi cấy thích hợp *Nguyên tắc:
Trong nuơi cấy vi sinh vật đường thường được sử dụng để làm nguồn cacbon cho sinh trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên để nuơi cấy các loại vi sinh vật khác nhau thì nồng độ đường sử dụng trong mơi trường nuơi cấy là khơng giống nhau. Vì vậy việc nghiên cứu để tìm ra nồng độ đường nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn cĩ ý nghĩa quan trọng.
*Tiến hành:
Vi khuẩn nuơi cấy lắc 150/phút ở các nồng độ đường: 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) trước và sau nuơi cấy, mẫu nào cĩ giá trị OD cao nhất chính là mẫu cĩ nồng độ đường thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ đường nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nuơi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các nồng độ đường
Xác định khả năng sinh trưởng giá trị OD
Chọn nồng độ đường thích hợp
32
2.2.4.4. Phương pháp xác định nồng độ muối nuơi cấy thích hợp *Nguyên tắc:
Trong quá trình nuơi cấy vi sinh vật, nguyên tố Na và Cl cũng là các nguyên tố mà nhiều vi sinh vật địi hỏi với lượng khơng nhỏ trong mơi trường nuơi cấy. Tuy nhiên, ở những lồi vi sinh vật khác nhau thì nồng độ muối bổ sung vào mơi trường nuơi cấy cũng khác nhau, vì vậy cần nghiên cứu để tìm ra nồng độ muối thích hợp đối với việc nuơi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn.
*Tiến hành:
Vi khuẩn nuơi cấy lắc 150/phút ở các nồng độ muối : 0,0075%, 0,015%, 0,03%, 0,06%, 0,12%. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) trước và sau nuơi cấy, mẫu nào cĩ giá trị OD cao nhất chính là mẫu cĩ nồng độ muối thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ muối nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chọn nồng độ muối thích hợp Nuơi cấy vi khuẩn được tuyển chọn
ở các nồng độ muối
Xác định khả năng sinh trưởng bằng giá trị OD
33
2.2.4.5. Phương pháp xác định thời gian nuơi cấy thích hợp và ảnh hưởng của thời gian đến khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
*Nguyên tắc:
Thời gian nuơi cấy vi khuẩn cĩ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng thu sinh khối. Thời gian nuơi cấy thích hợp là thời gian tại đĩ thu được sinh khối vi khuẩn nhiều nhất và hoạt tính nitrogenase mạnh nhất.
*Tiến hành:
Vi khuẩn được nuơi cấy lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ, pH, nồng độ đường, nồng độ muối thích hợp. Để xác định thời gian nuơi cấy thích hợp tiến hành đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) sau: 0h; 6h;12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h. Đồng thời, sau: 0h; 6h;12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h