Mục tiêu của thí nghiệm là tuyển chọn được chủng vi khuẩn Azotobacter cĩ
hoạt tính nitrogenase mạnh. Thí nghiệm được thực hiện theo các bước sau: Xử lý mẫu
Mẫu đất sau khi được lấy từ nơi phân lập sẽ được vận chuyển về phịng thí nghiệm, sau đĩ dùng đĩa petri vơ trùng cân 10g đất (trước khi cân phải lau cân bằng cồn 80% để khử trùng ).
Cho 10g đất vừa cân được vào bình tam giác 250 ml cĩ chứa sẵn 90ml nước cất vơ trùng, vơ đạm. Đậy kín bằng nút bơng rồi đưa lên máy lắc (200 vịng/ phút) trong 15 phút. Tiến hành đo pH của đất phân lập .
Tiến hành phân lập
- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml dung dịch nước cất vơ trùng, vơ đạm như trên.
- Dùng pipet vơ trùng hút 1ml dung dịch từ bình tam giác cho vào ống nghiệm đã được chuẩn bị, thu được dịch mẫu pha lỗng với nồng độ 10-1, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều.
- Từ ống nghiệm 10-1, pha lỗng ra ống nghiệm cĩ nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1ml dung dịch từ ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9ml dung dịch nước cất vơ trùng, vơ đạm khác, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm cĩ độ pha lỗng 10-2 , tiếp tục làm tương tự, ta cĩ các ống nghiệm cĩ độ pha lỗng mẫu 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.
- Mơi trường Ashby được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri vơ trùng, mỗi đĩa 10-15 ml. Dùng micropipet hút 0.1ml dịch đã pha lỗng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ và ngày phân lập. Dùng que cấy trang, trang đều dịch mẫu trên mặt thạch. Sau đĩ cất và nuơi cấy mẫu phân lập ở 370C trong tủ ấm. Sau khoảng 48h vi khuẩn đã phát triển trên đĩa thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc.
- Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa petri đã cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để thuận lợi cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 370C. Sau khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng vi khuẩn, tiến hành tinh
25
sạch nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi. Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống.
- Phương pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng lẻ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Các chủng vi khuẩn đã được lựa chọn được cấy trên ống thạch nghiêng cĩ chứa mơi trường Ashby rồi để vào tủ ấm 370C. Sau 3-5 ngày khi vi sinh vật đã mọc tốt, đem các ống giống đi bảo quản trong tủ lạnh ở 4-60C. Sau 2-3 tháng cấy chuyền lại một lần. Để bảo quản giống được lâu từ 6 tháng đến 2 năm cĩ thể giữ giống trong paraffin lỏng vơ trùng hay giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đơng khơ.
Hình 2.3: Phương pháp phân lập vi sinh vật