nitrogenase mạnh
Phương pháp xác định khả năng di động *Nguyên tắc:
Xác định khả năng di động của vi khuẩn bằng phương pháp quan sát trực tiếp sự chuyển động của vi khuẩn trong tiêu bản giọt ép dưới kính hiển vi.
* Tiến hành:
- Nhỏ một giọt nước cất vơ trùng lên phiến kính sạch.
- Dùng que cấy vơ trùng lấy khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần quan sát cho vào giọt nước trên phiến kính.
26
- Lấy lam kính đậy lên phiến kính sao cho khơng tạo thành bọt khí giữa lam kính và phiến kính.
- Quan sát phiến kính dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu. Nếu vi khuẩn cĩ khả năng chuyển động, chúng ta cĩ thể quan sát thấy chúng di động, thay đổi vị trí.
Xác định hoạt tính catalase
Cấy vi khuẩn vào đĩa petri chứa mơi trường phân lập, đặt trong tủ ấm 370C. Sau 1 ngày nhỏ 2 giọt H2O2 30% vào khuẩn lạc của vi khuẩn, nếu sủi bọt ta kết luận cĩ hoạt tính catalase, ngược lại khơng cĩ.
Xác định khả năng cố định Đạm bằng thuốc thử Nessler
* Nguyên tắc: Phần lớn đạm amơn ở trong đất đều ở dạng trao đổi nên phải dùng một dung dịch muối để đẩy nĩ ra.
NH4+ + 2K2(HgI4) + 4KOH = NH2HgOI (vàng nâu) +7KI + 3H20 + K+
Hợp chất này để lâu thì lắng xuống, do đĩ nên so màu trong khoảng 1 giờ. Trong dung dịch cần xác định khả năng cố định đạm nếu cĩ chứa các ion Ca++, Mg++ sẽ gây đục dung dịch gây sai số vì vậy cần phải cho muối Xenhet để liên kết chúng dưới dạng phức chất tan tactrat.
* Dựng đường chuẩn Nessler
Pha dung dịch chuẩn (NH4)2SO4 (0.165g/50ml), sau đĩ pha lỗng 50 lần. Từ dung dich này pha thành các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ khác nhau:
Nồng độ (NH4)2SO4 (µgN/ml) Thể tích dung dịch chuẩn (ml) Thể tích nước cất vơ đạm (ml) OD trung bình 0 0 1 0 1.04 0.2 0.8 0.22 2.07 0.4 0.6 0.473 3.11 0.6 0.4 0.704 4.15 0.8 0.2 0.974 5.19 1 0 1.219
27
Cho 1ml mỗi dung dịch vào ống nghiệm sạch.
Thêm 0,2 ml dung dịch Xenhet vào ống nghiệm, lắc đều.
Thêm 0,3 ml dung dịch Nessler vào ống nghiệm, lắc đều.
Sau 5 phút tiến hành đo mật độ quang ở bước sĩng 420nm.
Tiến hành thí nghiệm 2 lần song song, lấy số liệu trung bình.
Dựng đường chuẩn bằng phần mềm Excel.
Hình 2.4: Đường chuẩn Nessler
Ta cĩ được phương trình đường chuẩn Nessler như sau: y=0.2409x – 0.0277 * Tiến hành:
+ Sau khi nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường lên men được 48h, dùng micropipet hút 1ml dịch lên men cho vào ống nghiệm sạch, vơ trùng.
+ Thêm 0,2 ml dung dịch Xenhet vào ống nghiệm, lắc đều + Thêm 0,3 ml dung dịch Nessler vào ống nghiệm, lắc đều
+ Tiến hành đo OD ở bước sĩng 420nm để xác định độ đục sau 5 phút
+ Thay giá trị OD vào phương trình đường chuẩn để xác định hoạt tính nitrogenase.
Sau các xác định hoạt tính nitrogenase, chọn chủng cĩ hoạt tính nitrogenase mạnh nhất để tiến hành xác định các điều kiện nuơi cấy thích hợp và khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn lên sự nảy mầm của hạt lúa.
28