tuyển chọn
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuơi cấy thích hợp cho chủng L8
Chọn vi khuẩn cĩ hoạt tính mạnh nhất và xác định điều kiện nuơi cấy thích hợp cho vi khuẩn tuyển chọn
Nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C, 400C pH mơi trường: 6; 6,4; 6,8; 7,2; 7,6. Nồng độ NaCl: 0,0075%; 0,015%; 0,03%; 0,06%; 0,12% Nồng độ đường: 0,125%; 0,25%; 0,5%; 1%; 2% Thời gian: 0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h, 54h
Chọn điều kiện nuơi cấy thích hợp
29
2.2.4.1. Phương pháp xác định pH nuơi cấy thích hợp *Nguyên tắc:
pH mơi trường cĩ ý nghĩa quyết định đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, một biến đổi nhỏ của pH cũng ảnh hưởng rất mạnh đến tế bào vi sinh vật. Do đĩ, việc xác định pH nuơi cấy thích hợp là rất cần thiết.
*Tiến hành:
Vi khuẩn được nuơi cấy lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ thích hợp. Để xác định pH nuơi cấy thích hợp, tiến hành nuơi cấy ở pH lần lượt là 6,0; 6,4; 6,8; 7,2; 7,6. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) trước và sau nuơi cấy, mẫu nào cĩ giá trị OD cao nhất chính là mẫu cĩ giá trị pH thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuơi cấy thích hợp cho chủng L8 Sau khi đã khảo sát được pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng L8 ta tiến hành lên men chủng vi khuẩn tuyển chọn trong bình tam giác thể tích 500ml, sau 48h tiến hành cấy trang đếm khuẩn lạc để xác định mật độ vi khuẩn trong bình lên men.
Nuơi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các pH
Xác định khả năng sinh trưởng bằng giá trị OD
Chọn pH thích hợp
30
2.2.4.2. Phương pháp xác định nhiệt độ nuơi cấy thích hợp *Nguyên tắc:
Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật cĩ thể coi là kết quả của các phản ứng hĩa học. Các phản ứng hĩa học lại phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ vì thế yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào. Mỗi lồi vi sinh vật chỉ cĩ thể tồn tại trong giới hạn nhiệt độ nhất định. Để nuơi cấy vi sinh vật thì việc nghiên cứu tìm ra nhiệt độ thích hợp cĩ ý nghĩa quan trọng.
*Tiến hành:
Vi khuẩn nuơi cấy lắc 150/phút ở các nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C, 400C. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) trước và sau nuơi cấy, mẫu nào cĩ giá trị OD cao nhất chính là mẫu cĩ giá trị nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nuơi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các nhiệt độ
200C
Xác định khả năng sinh trưởng bằng giá trị OD
Chọn nhiệt độ thích hợp
31
2.2.4.3. Phương pháp xác định nồng độ đường nuơi cấy thích hợp *Nguyên tắc:
Trong nuơi cấy vi sinh vật đường thường được sử dụng để làm nguồn cacbon cho sinh trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên để nuơi cấy các loại vi sinh vật khác nhau thì nồng độ đường sử dụng trong mơi trường nuơi cấy là khơng giống nhau. Vì vậy việc nghiên cứu để tìm ra nồng độ đường nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn cĩ ý nghĩa quan trọng.
*Tiến hành:
Vi khuẩn nuơi cấy lắc 150/phút ở các nồng độ đường: 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) trước và sau nuơi cấy, mẫu nào cĩ giá trị OD cao nhất chính là mẫu cĩ nồng độ đường thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ đường nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nuơi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các nồng độ đường
Xác định khả năng sinh trưởng giá trị OD
Chọn nồng độ đường thích hợp
32
2.2.4.4. Phương pháp xác định nồng độ muối nuơi cấy thích hợp *Nguyên tắc:
Trong quá trình nuơi cấy vi sinh vật, nguyên tố Na và Cl cũng là các nguyên tố mà nhiều vi sinh vật địi hỏi với lượng khơng nhỏ trong mơi trường nuơi cấy. Tuy nhiên, ở những lồi vi sinh vật khác nhau thì nồng độ muối bổ sung vào mơi trường nuơi cấy cũng khác nhau, vì vậy cần nghiên cứu để tìm ra nồng độ muối thích hợp đối với việc nuơi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn.
*Tiến hành:
Vi khuẩn nuơi cấy lắc 150/phút ở các nồng độ muối : 0,0075%, 0,015%, 0,03%, 0,06%, 0,12%. Lấy mẫu đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) trước và sau nuơi cấy, mẫu nào cĩ giá trị OD cao nhất chính là mẫu cĩ nồng độ muối thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ muối nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chọn nồng độ muối thích hợp Nuơi cấy vi khuẩn được tuyển chọn
ở các nồng độ muối
Xác định khả năng sinh trưởng bằng giá trị OD
33
2.2.4.5. Phương pháp xác định thời gian nuơi cấy thích hợp và ảnh hưởng của thời gian đến khả năng cố định đạm của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
*Nguyên tắc:
Thời gian nuơi cấy vi khuẩn cĩ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng thu sinh khối. Thời gian nuơi cấy thích hợp là thời gian tại đĩ thu được sinh khối vi khuẩn nhiều nhất và hoạt tính nitrogenase mạnh nhất.
*Tiến hành:
Vi khuẩn được nuơi cấy lắc 150 vịng/phút ở nhiệt độ, pH, nồng độ đường, nồng độ muối thích hợp. Để xác định thời gian nuơi cấy thích hợp tiến hành đo khả năng sinh trưởng bằng phép đo OD (bước sĩng 630 nm) sau: 0h; 6h;12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h. Đồng thời, sau: 0h; 6h;12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h lấy mẫu để tiến hành xác định hoạt tính nitrogenase bằng thuốc thử Nessler sau đĩ đem mẫu đi đo OD (bước sĩng 420nm), từ giá trị OD đo được thay vào phương trình đường chuẩn để xác định hoạt tính nitrogenase theo thời gian. Thời gian nuơi cấy thích hợp là thời gian mà tại đĩ khả năng sinh trưởng (xác định bằng phép đo OD ở bước sĩng 630nm) và hoạt tính nitrogenase đạt giá trị cao nhất.
Hình 2.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuơi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nuơi cấy vi khuẩn được tuyển chọn ở các thời gian
Xác định hoạt tính nitrogenase và xây dựng đường cong sinh trưởng
Chọn thời gian thích hợp
34
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuơi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn đến khả năng nảy mầm của hạt lúa
*Nguyên tắc:
Vi khuẩn Azotobacter cĩ khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt nhờ những chất kích thích sinh trưởng mà nó tạo ra, đây là một đặc tính rất cĩ ý nghĩa của các
chủng Azotobacter đối với thực tế sản xuất. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra nồng độ
dịch vi khuẩn tối ưu cho sự nảy mầm của hạt là một thí nghiệm cĩ ý nghĩa lớn trong
sản xuất nơng nghiệp. Do chủng Azotobacter đã được tuyển chọn được phân lập từ
đất trồng lúa nên chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuơi cấy vi khuẩn đến khả năng nảy mầm của hạt lúa.
*Tiến hành:
Tiến hành nuơi cấy vi khuẩn đã được tuyển chọn trong mơi trường nuơi cấy thích hợp. Thu dịch vi khuẩn tại thời điểm sinh khối vi khuẩn đạt cao nhất. Đồng thời hạt lúa giống cũng được chuẩn bị trước bằng cách cân 6g hạt lúa rồi chia vào 6 cốc thủy tinh, mỗi cốc 1g rồi thêm nước cất vào mỗi cốc thủy tinh để các hạt lúa được ngâm trong dung dịch nước cất trong 24h.
Dịch vi khuẩn sau khi nuơi cấy và hạt lúa giống sau khi ngâm được sử dụng cho thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuơi cấy vi khuẩn đến khả năng nảy mầm của hạt lúa.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch nuơi cấy vi khuẩn đến khả năng nảy mầm của hạt lúa bằng cách cho 1g hạt lúa sau khi ngâm vào đĩa peptri. Đĩa 0 (đối chứng) sẽ được ngâm trong dung dịch nước cất, các đĩa cịn lại sẽ được ngâm trong dung dịch nước cất cĩ bổ sung dịch vi khuẩn với tỷ lệ dịch vi khuẩn : nước cất như sau:
+ Đĩa 1: tỷ lệ 1:9 + Đĩa 2: tỷ lệ 1:19 + Đĩa 3: tỷ lệ 1:29 + Đĩa 4: tỷ lệ 1:39 + Đĩa 5: tỷ lệ 1:49
Ủ các đĩa trên ở 400C trong 48h, sau đĩ quan sát và đếm tỷ lệ nảy mầm của hạt lúa.
35
Hình 2.11: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn đã tuyển chọn lên khả năng nảy mầm của hạt lúa
Hạt lúa và dịch vi khuẩn đã được chuẩn bị
Mẫu 0:hạt lúa được ngâm trong dung dịch nước cất Ủ ở 400C trong 48h Mẫu 1:hạt lúa được ngâm trong dung dịch tỷ lệ 1:9 Mẫu 1:hạt lúa được ngâm trong dung dịch tỷ lệ 1:19 Mẫu 1:hạt lúa được ngâm trong dung dịch tỷ lệ 1:29 Mẫu 1:hạt lúa được ngâm trong dung dịch tỷ lệ 1:39 Mẫu 1:hạt lúa được ngâm trong dung dịch tỷ lệ 1:49 Quan sát tỷ lệ nảy mầm
36
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN