Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất lúa tại ninh hóa khánh hòa

i LỜI CẢM ƠN Sau gần tháng thực tập phòng Hóa phân tích triển khai cơng nghệ, thuộc viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, hướng dẫn TS Trần Thị Thanh Vân cán đây, tơi hồn thành luận văn Qua xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thị Thanh Vân người định hướng nghiên cứu, quan tâm tận tình bảo cho tơi suốt q trình thực tập, anh chị phòng hóa phân tích triển khai cơng nghệ, người hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, toàn thể thầy cô giáo Viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trường tận tình bảo truyền đạt kiến thức quý báu cho năm học vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn anh, chị công tác Viện nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang bạn thực tập giúp đỡ suốt thời gian thực tập Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình tồn thể bạn bè thân thiết, người động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu Nha Trang , tháng năm 2012 Sinh viên Trần Hải Minh ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Azotobacter: 1.1.1 Đặc điểm chung Azotobacter: 1.1.2 Phân loại Azotobacter 1.1.3 Ảnh hưởng nhân tố sinh thái đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn Azotobacter 1.1.4 Quá trình cố định nitơ: 1.1.5 Giới thiệu quy trình sản xuất chế phẩm cố định đạm Azotobacterin 11 1.2 Tình hình trồng lúa sử dụng phân bón Việt Nam: 12 1.2.1 Tình hình trồng lúa Việt Nam: 13 1.2.2 Tình hình sử dụng phân bón Việt Nam: 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Mẫu phân lập vi sinh .20 2.1.2 Thiết bị chuyên dụng 21 2.1.3 Hóa chất, mơi trường thuốc thử 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 23 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Azotobacter từ mẫu đất .24 2.2.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase mạnh 25 2.2.4 Phương pháp xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 28 iii 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn tuyển chọn đến khả nảy mầm hạt lúa 34 Chương : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Phân lập chủng Azotobacter từ mẫu đất 36 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính nitrogenase 37 3.2.1 Thử hoạt tính catalase 37 3.2.2 Xác định khả di động 39 3.2.3 Xác định khả cố định đạm thuốc thử Nessler 39 3.3 Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 3.3.1 Xác định pH nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 3.3.2 Xác định nhiệt độ nuôi cấy cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 42 3.3.3 Xác định nồng độ đường ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 43 3.3.4 Xác định nồng độ muối ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 3.3.5 Nghiên cứu xác định thời gian ni cấy thích hợp ảnh hưởng thời gian đến khả cố định đạm chủng vi khuẩn tuyển chọn 46 3.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dịch vi khuẩn đến khả nảy mầm hạt lúa 49 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 55 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại Azotobacter Bảng 1.2: Một số mặt hàng xuất nông sản Việt Nam 2000-2008 13 Bảng 1.3: Số lượng giá trị gạo xuất Việt Nam qua năm 14 Bảng 1.4: Lượng phân bón vơ sử dụng Việt Nam qua năm 15 Bảng 1.5: Lượng phân bón vơ hàng năm trồng chưa sử dụng 16 Bảng 2.1: Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn 20 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập 36 Bảng 3.2: Hoạt tính catalase 15 chủng phân lập 38 Bảng 3.4: Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng L8 41 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng L8 42 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả sinh trưởng chủng L8 44 Bảng 3.7: Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng chủng L8 45 Bảng 3.8: Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng hoạt tính nitrogenase chủng L8 46 Bảng 3.9: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng L8 lên khả nảy mầm hạt lúa 49 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình dạng tế bào Azotobacter sp Hình 1.2: Sơ đồ giả thuyết đường trình cố định N2 Hình 2.1: Cánh đồng nơi lấy mẫu 20 Hình 2.2: Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 23 Hình 2.3: Phương pháp phân lập vi sinh vật 25 Hình 2.4: Đường chuẩn Nessler 27 Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng L8 28 Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH ni cấy thích hợp cho chủng L8 29 Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 30 Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ đường ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 31 Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ muối ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 32 Hình 2.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 33 Hình 2.11: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ dịch vi khuẩn tuyển chọn lên khả nảy mầm hạt lúa 35 Hình 3.1 (a): Hình thái khuẩn lạc chủng L8 37 Hình 3.1 (b): hình thái tế bào chủng L8 độ phóng đại X-1000 37 Hình 3.2(a): Hoạt tính catalase (-) 38 Hình 3.2(b): Hoạt tính catalase (+) 38 Hình 3.3: Hoạt tính nitrogenase chủng phân lập 39 Hình 3.4 Hoạt tính nitrogenase chủng phân lập 40 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng L8 41 Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng L8 42 Hình 3.7: Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả sinh trưởng chủng L8 44 Hình 3.8: Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng chủng L8 45 Hình 3.9: Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng hoạt tính nitrogenase chủng L8 47 Hình 3.10: Ảnh hưởng dịch ni cấy chủng L8 lên khả nảy mầm hạt lúa 49 Hình 3.11: Sự nảy mầm hạt lúa mẫu mẫu sau ngày 50 vi BẢNG KÍ HIỆU VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic Acid FDA Food and Drug Administration Fuc Fucose Gal Galactose Man Mannose OD Optical Density (Mật độ quang) RNA Ribonucleic Acid FAO Food and Agriculture Organization ATP Adenosine triphosphat N Nitơ MỞ ĐẦU Đạm chất dinh dưỡng có vai trò hàng đầu trồng Hàm lượng chúng đất ít, dao động khoảng 4-30mg/100g đất, tùy vào loại đất Vì trồng thường thiếu đạm, để cung cấp nguồn đạm cho trồng, ngồi việc sử dụng phân đạm hóa học, phương pháp khác làm tăng cường lượng đạm đất để cung cấp cho trồng nhiều người quan tâm sử dụng loại vi sinh vật cố định đạm từ khơng khí Hiện giới nói chung Việt Nam nói riêng sử dụng phân bón hóa học nguồn cung cấp đạm chủ yếu nguồn đạm tăng nhanh năm gần Theo FAO, nhu cầu sử dụng phân bón hóa học tăng lên với tốc độ vũ bão Năm 1905, giới sử dụng 1,4 triệu NPK đến năm 1990 lượng phân bón hóa học mà giới sử dụng 138 triệu tấn, năm 2000 144 triệu tấn, năm 2005 150 triệu nhu cầu sử dụng phân bón hóa học giới lên tới 200 triệu tấn/năm Nhu cầu sử dụng phân bón hóa học tăng nhanh xu tất yếu để đảm bảo lương thực, thực phẩm cho bùng nổ dân số hành tinh Tuy nhiên, việc lạm dụng phân bón hóa học bộc lộ mặt trái gây nhiễm mơi trường, làm giảm độ phì nhiêu đất, gia tăng lượng tồn dư chất độc lên nông sản, thực phẩm Thực trạng xảy phổ biến phạm vi toàn cầu trở thành nghiêm trọng nước phát triển Để vừa đảm bảo an ninh lương thực, vừa phải trì cải thiện độ phì nhiêu đất canh tác, đồng thời không ngừng nâng cao chất lượng nông sản, tăng hiệu kinh tế an tồn bền vững mơi trường, nhà khoa học nhà sản xuất chuyển sang nghiên cứu nhiều vi khuẩn cố định đạm cộng sinh, tự hay nội sinh để làm phân đạm sinh học bón cho trồng Phân bón vi sinh có nhiều đặc điểm trội so với phân bón hóa học, tác dụng nâng cao suất chất lượng trồng, tiết kiệm phân bón vơ cơ, giảm chi phí sản xuất phân bón vi sinh góp phần bảo vệ môi trường phát triển ngành nông nghiệp bền vững Tuy nhiên tình hình sản xuất phân bón vi sinh nước ta chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất nông nghiệp quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hồn thiện ổn định Do nghiên cứu hoàn thiện nâng cao chất lượng phân bón vi sinh việc cấp thiết Trong đó, cơng tác tuyển chọn, đánh giá hoạt tính chủng vi sinh vật khâu vơ quan trọng quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh Azotobacter vi khuẩn hiếu khí, sống tự đất Chúng có khả cố định đạm cao từ N2 khơng khí khơng phụ thuộc vào chủ, Azotobacter có khả ức chế phát triển vi nấm sinh số chất có hoạt tính sinh hoc cao như: Thiamine, Riboflavin, Nicotine, Heteroauxin Indole acetic Gibberellins nhờ đặc điểm quan trọng mà vi khuẩn Azotobacter dùng rộng rãi chế phẩm phân bón vi sinh làm tăng suất trồng Thêm vào đó, Việt Nam cường quốc xuất gạo, lúa trồng chủ lực đóng góp vào phát triển xã hội, vấn đề phát triển ngành trồng lúa vấn đề quan trọng quốc gia Và địa bàn tỉnh Khánh Hòa huyện Ninh Hòa xem vựa lúa tỉnh, hàng năm sản lượng lúa huyện Ninh Hòa chiếm 1/3 sản lượng lúa tỉnh Xuất phát từ lý trên, chọn đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa huyện Ninh Hòa-tỉnh Khánh Hòa” Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa huyện Ninh Hòa-tỉnh Khánh Hòa Nghiên cứu xác định nhiệt độ nuôi cấy pH môi trường nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn tuyển chọn Nghiên cứu xác định nồng độ đường, nồng độ muối môi trường nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn tuyển chọn Nghiên cứu xác định thời gian nuôi cấy tối ưu khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả cố định đạm chủng vi khuẩn tuyển chọn Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dịch nuôi cấy vi khuẩn đến nảy mầm hạt lúa Đề tài thực phòng Hóa phân tích triển khai công nghệ thuộc Viện nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Azotobacter: 1.1.1 Đặc điểm chung Azotobacter: Azotobacter chủng vi khuẩn thường tìm thấy đất có tác dụng lớn việc làm tăng độ màu mỡ cho đất làm tăng suất trồng Azotobacter tự nhiên cố đònh nitơ từ không khí vùng rễ Mỗi chủng Azotobacter có đặc tính hóa học, sinh học riêng Tuy nhiên vài chủng có khả cố đònh nitrogen cao so với chủng khác (Islam M.Z cs, 2008) Azotobacter vi khuẩn hình cầu, Gram (-), khơng sinh nha bào, hiếu khí, sinh sản theo lối phân cắt giản đơn, lượng DNA tế bào Azotobacter thường vi khuẩn khác (Sachin D., 2009) Khi nuôi môi trường thạch, vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi tan, lúc đầu khơng màu, sau biến thành màu nâu tối, chí đến màu đen, không làm nhuộm màu môi trường khuẩn lạc Ngồi số lồi Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng Hình 1.1: Hình dạng tế bào Azotobacter sp (a) kính hiển vi điện tử (b) tiêu âm Vi khuẩn Azotobacter non có tiêm mao, có khả di động nhờ tiên mao , già tế bào khả di động, kích thước tế bào thu nhỏ lại Vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc dạng S màu trắng trong, lồi nhầy Khi già, khuẩn lạc có màu vàng lục màu nâu thẫm, tế bào bao bọc lớp vỏ dày tạo thành nang xác, gặp điều kiện thuận lợi, nang xác nứt tạo thành tế bào Vi khuẩn Azotobacter thích ứng pH= 7.2-8.2, nhiệt độ 28-300C, độ ẩm 40-60% Azotobacter đồng hóa tốt loại đường đơn kép, tiêu tốn 1g đường glucose có khả đồng hóa 8-18 mg N (Nguyễn Lân Dũng cs, 2002) Nồng độ muối 0.9% gây chết Azotobacter môi trường nuôi cấy cần thiết phải bổ sung thêm muối Azotobacter có khuynh hướng nhạy cảm với pH acid, nồng độ phosphate cao nhiệt độ cao 35oC, Azotobacter sống cộng sinh rễ vài loài thực vật có khả sản xuất hormone kích thích sinh trưởng thực vật ( Islam M.Z cs, 2008) Ngồi khả cố định nitơ, Azotobacter có khả tiết số vitamin nhóm B B1, B2, B3, B6…và số chất có hoạt tính sinh học cao như: Indole acetic, Gibberellins loại kháng sinh thuộc nhóm Anixomyxin Khi Azotobacter ứng dụng gieo hạt khả nảy mầm hạt tăng lên cách đáng kể, đồng thời Azotobacter làm tăng khả chống chòu sâu bệnh thực vật nhờ chất kích thích sinh trưởng mà tạo Vi khuẩn Azotobacter thuộc loại vi khuẩn sống theo phương thức dị dưỡng, chúng sử dụng nhiều loại hợp chất hữu khác nhau: disacarit, dextrin, tinh bột, acid hữu cơ, hợp chất thơm…Tuy nhiều tác giả cho biết khơng chủng Azotobacter khơng có khả đồng hóa lactose, manitol natribenzoat Trên mơi trường khơng chứa N khuẩn lạc Azotobacter có dạng nhầy, lồi, đơi nhăn nheo Chứng tỏ vi khuẩn Azotobacter có khả sinh trưởng mơi trường khơng có N Sở dĩ chúng tồn có khả đồng hóa muối 41 Bảng 3.4: Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng L8 Chủng pH Giá trị OD ( 60h ) L8 0,771 6,4 1,241 6,8 1,418 7,2 1,352 7,6 1,368 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng L8 Nhận xét: Chủng L8 có khả sinh trưởng dải pH từ 6-7,6 nhiên pH cao thấp dẫn đến giảm khả sinh trưởng chủng L8 Khi nuôi cấy chủng L8 pH thấp ( pH=6 ) sinh khối vi khuẩn sau 60h nuôi cấy 54% so với nuôi cấy pH tối ưu Khi nuôi cấy chủng L8 pH= 7,6 sinh khối vi khuẩn sau 60h nuôi cấy bị ảnh hưởng, cụ thể giảm 96% so với ni cấy pH tối ưu Kết cho thấy, môi trường nuôi cấy có pH= 6,8 tối ưu cho chủng L8 sinh trưởng phát triển Đồng thời, pH=6,8 giá trị pH mẫu đất mà phân lập chủng vi khuẩn trên, điểm thuận 42 lợi để ứng dụng chủng vi khuẩn tuyển chọn vào việc sản xuất phân bón vi sinh sử dụng cho vùng đất Ninh Hòa vùng lân cận Tiến hành lên men bình tam giác thể tích 500ml, xác định mật độ vi khuẩn bình 3.108 CFU/ml 3.3.2 Xác định nhiệt độ ni cấy cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Chủng L8 nuôi cấy lắc 150/phút nhiệt độ: 200C, 250C, 300C, 350C, 400C Lấy mẫu đo khả sinh trưởng (bằng phép đo OD) trước sau nuôi cấy Kết trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng L8 Chủng Nhiệt độ (0C) Giá trị OD ( 60h ) L8 20 1,584 25 1,736 30 2,065 35 1,886 40 0,477 Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng L8 43 Nhận xét: Chủng L8 sinh trưởng tốt dải nhiệt độ từ 20-350C, nuôi cấy chủng L8 400C vi khuẩn ngừng sinh trưởng, sinh khối vi khuẩn sau 60h giảm xuống 2% so với sinh khối nuôi cấy nhiệt độ tối ưu Khi ni cấy chủng L8 200C sinh khối vi khuẩn sau 60h nuôi cấy giảm đáng kể 75% so với sinh khối ni cấy nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ tối thích cho chủng L8 sinh trưởng 300C Đây nhiệt độ phòng nên thuận lợi cho việc ni cấy vi khuẩn nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn để sản xuất phân bón vi sinh 3.3.3 Xác định nồng độ đường ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Chủng L8 nuôi cấy lắc 150/phút nồng độ đường: 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125% Lấy mẫu đo khả sinh trưởng(bằng phép đo OD) trước sau nuôi cấy Kết trình bày bảng 3.6 44 Bảng 3.6: Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả sinh trưởng chủng L8 Chủng Nồng độ đường (%) Giá trị OD ( 60h ) L8 0,125 0,886 0,25 1,850 0,5 1,692 1,617 1,505 Hình 3.7: Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả sinh trưởng chủng L8 Nhận xét: Chủng L8 phát triển tốt môi trường có nồng độ đường từ 0,125-2% Tuy nhiên nồng độ đường cao thấp làm giảm khả sinh trưởng chủng L8 Khi nuôi cấy chủng L8 mơi trường có nồng độ đường thấp (0,125%) sinh khối vi khuẩn sau 60h nuôi cấy giảm 49% so với sinh khối ni cấy mơi trường có nồng độ đường tối ưu Khi ni cấy chủng L8 mơi trường có nồng độ đường 2% sinh khối vi khuẩn sau 60h nuôi cấy giảm 82% so với sinh khối ni cấy mơi trường có nồng độ đường tối ưu Kết cho thấy, nồng độ đường tối thích cho chủng L8 sinh trưởng 0,25% 45 3.3.4 Xác định nồng độ muối ni cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Chủng L8 nuôi cấy lắc 150/phút nồng độ đường: 0,0075%, 0,015%, 0,03%, 0,06%, 0,12% Lấy mẫu đo khả sinh trưởng (bằng phép đo OD) trước sau nuôi cấy Kết trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7: Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng chủng L8 Chủng Nồng độ muối (%) Giá trị OD ( 60h ) L8 0,0075 1,580 0,015 1,670 0,03 1,703 0,06 1,882 0,12 1,733 Hình 3.8: Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng chủng L8 Nhận xét: Chủng L8 phát triển tốt mơi trường có nồng độ muối từ 0,0075-0,12% Tuy nhiên nồng độ muối cao thấp làm giảm khả sinh trưởng chủng L8 Khi nuôi cấy chủng L8 mơi trường có nồng độ muối thấp (0,0075%) sinh khối vi khuẩn sau 60h nuôi cấy giảm 83% so với sinh khối ni cấy mơi trường có nồng độ muối tối ưu Khi ni cấy chủng L8 46 mơi trường có nồng độ muối 0,12% sinh khối vi khuẩn sau 60h nuôi cấy giảm 92% so với sinh khối ni cấy mơi trường có nồng độ muối tối ưu Kết cho thấy, nồng độ muối tối thích cho chủng L8 sinh trưởng 0,06% 3.3.5 Nghiên cứu xác định thời gian ni cấy thích hợp ảnh hưởng thời gian đến khả cố định đạm chủng vi khuẩn tuyển chọn Chủng L8 nuôi cấy lắc 150 vòng/phút nhiệt độ, pH, nồng độ đường, nồng độ muối thích hợp Để xác định thời gian ni cấy thích hợp, khả cố định đạm tiến hành lấy mẫu xác định hoạt tính nitrogenase đo khả sinh trưởng (bằng phép đo OD) sau: 0h; 6h;12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h Đồng thời, sau: 0h; 6h; 12h; 18h; 24h; 30h; 36h; 42; 48h; 54h lấy mẫu để tiến hành xác định hoạt tính nitrogenase thuốc thử Nessler sau đem mẫu đo OD (bước sóng 420nm), từ giá trị OD đo thay vào phương trình đường chuẩn để xác định hoạt tính nitrogenase theo thời gian Bảng 3.8: Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng hoạt tính nitrogenase chủng L8 Chủng Thời gian (giờ) Giá trị OD Hoạt tính nitrogenase L8 0,099 25,2 0,116 31,0 12 0,225 33,5 18 0,341 77,5 24 0,554 110,5 30 0,762 149,7 36 0,989 187,5 42 1,177 286,7 48 1,006 197,0 54 0,748 153,2 47 OD (630nm) Hình 3.9: Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh trưởng hoạt tính nitrogenase chủng L8 Nhận xét: Quan sát chủng q trình ni cấy, chủng L8 phát triển qua pha liên tiếp bao gồm: pha lag, pha log, pha cân pha tử vong Pha lag tính từ lúc bắt đầu cấy giống đến vi khuẩn đạt tốc độ sinh trưởng cực đại Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia, trọng lượng thể tích tế bào tăng rõ rệt thời kì vi khuẩn làm quen với môi trường chất dinh dưỡng Kết cho thấy, pha lag diễn 18 đầu q trình ni cấy Trong pha mật độ vi sinh vật môi trường nuôi cấy thấp nên 18h đầu hoạt tính cố định đạm chủng L8 mức thấp Đến pha log (từ 18h đến 36h nuôi), nồng độ tế bào tăng nhanh chóng sau pha lag mơi trường ni có số lượng lớn tế bào thích nghi Bên cạnh đó, thời gian vi sinh vật có khả tổng hợp enzyme ngoại bào lớn để phân giải chất dinh dưỡng mơi trường Vì vậy, giai đoạn tế bào vi sinh vật diễn trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ nhất, dẫn đến số lượng tế bào tăng theo lũy thừa Chính lượng đạm tạo thành tăng lên cách mạnh mẽ Kết cho thấy sau 18h nuôi, giá trị OD đo chủng L8 0,341 (đạt 29% so với giá trị OD cực đại) Ở pha OD630 tăng liên tục, 48 sau 6h nuôi cấy giá trị OD630 tăng khoảng 18÷ 20% (so với giá trị cực đại) chủng phát triển chậm lại sau 36h nuôi cấy Ở cuối pha này, số lượng tế bào chưa đạt lớn quần thể tế bào có trạng thái sinh hóa, sinh lý tế bào vi sinh vật hoàn thiện việc nuôi cấy giai đoạn thường sử dụng để nghiên cứu sinh hóa sinh lý vi sinh vật Bước sang pha cân (từ 36h đến 48h ni) tốc độ sinh trưởng khả trao đổi chất giảm Số lượng tế bào chết cân với số tế bào sinh Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, chất độc tích lũy, pH giảm Mặc dù giai đoạn tốc độ tăng trưởng tế bào vi sinh vật chậm lại lại giai đoạn số lượng tế bào vi sinh vật lớn đồng thời hoạt tính nitrogenase đạt cực đại nên thường chọn thời điểm đầu pha cân để thu sinh khối vi sinh vật Pha suy vong (sau 48h) nồng độ tế bào chủng L8 bắt đầu giảm xuống Sau 54h ni mật độ tế bào chủng giảm nhanh, nồng độ tế bào chủng L8 đạt 64% (so với giá trị cực đại) Đồng thời hoạt tính nitrogenase giảm đáng kể, đến 54h hoạt tính nitrogenase 53% so với giá trị cực đại Trong pha hoạt tính nitrogenase giảm số lượng vi sinh vật môi trường nuôi cấy giảm cách nhanh chóng, đồng thời vi sinh vật lại môi trường lại sử dụng lượng đạm cố định để làm nguồn dinh dưỡng cho sinh trưởng phát triển chúng Kết bảng 3.8 hình 3.9 cho thấy từ sau 48h vi sinh vật đến giai đoạn suy vong chất dinh dưỡng môi trường giảm xuống, sản phẩm tiết nhiều, vi khuẩn chết tự phân nhờ enzyme thân Vì trình ni cấy tránh để vi sinh vật đạt đến giai đoạn Từ kết thí nghiệm ta thấy khả sinh trưởng hoạt tính enzyme chủng L8 tăng mạnh sau 18h nuôi cấy, bắt đầu pha ổn định sau 36h nuôi cấy Sinh khối tế bào hoạt tính nitrogenase đạt giá trị cực đại sau 42 nuôi cấy lắc Pha suy vong sau 48h, lúc sinh khối tế bào hoạt tính nitrogenase giảm nhanh chóng Như vậy, thời gian thích hợp để thu sinh khối chủng L8 sau 42h nuôi cấy 49 3.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dịch vi khuẩn đến khả nảy mầm hạt lúa Ảnh hưởng nồng độ dịch nuôi cấy chủng L8 đến khả nảy mầm hạt lúa trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng L8 lên khả nảy mầm hạt lúa STT Tỷ lệ dịch vi khuẩn : nước cất Tỷ lệ nảy mầm (%) 0 : 10 81 1:9 84 : 19 95 : 29 90 1: 39 86 : 49 84 Hình 3.10: Ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng L8 lên khả nảy mầm hạt lúa 50 Nhận xét: Từ bảng 3.9 hình 3.10 cho thấy, cho hạt lúa giống ngâm dung dịch có bổ sung dịch vi khuẩn chủng L8 tỉ lệ nảy mầm hạt lúa cao mẫu đối chứng Tuy nhiên ngâm hạt lúa dung dịch có tỷ lệ dịch vi khuẩn: nước cất 1:9 1:49 tỷ lệ nảy mầm hạt lúa tăng không đáng kể ( tăng 3% so với mẫu đối chứng) Khi ngâm hạt lúa dung dịch có tỷ lệ dịch vi khuẩn: nước cất 1:29 1:39 tỷ lệ nảy mầm hạt lúa có tăng so với tỷ lệ 1:9 1:49 thấp so với tỷ lệ 1:19 Ở đĩa nồng độ vi sinh vật cao nhiên tỷ lệ nảy mầm khơng đạt hiệu suất cao điều nồng độ sản phẩm trao đổi chất tạo thành gây ức chế lên trình nảy mầm hạt, đĩa 3,4,5 mật độ vi sinh vật giảm nồng độ sản phẩm trao đổi chất vi sinh vật lại mức độ phù hợp, điều kích thích nảy mầm hạt.Tỷ lệ nảy mầm hạt lúa tăng mạnh ngâm hạt lúa dung dịch có tỷ lệ dịch vi khuẩn: nước cất 1:19 ( tăng 14% so với mẫu đối chứng ) Như thực tế sản xuất tiến hành ngâm hạt lúa giống vào dung dịch có tỷ lệ dịch ni cấy chủng vi khuẩn L8: nước cất 1:19 để tăng khả nảy mầm hạt giống Hình 3.11: Sự nảy mầm hạt lúa mẫu mẫu sau ngày 51 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau trình phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa chúng tơi thu số kết sau: Đã phân lập 15 chủng vi khuẩn từ đất trồng lúa huyện Ninh hòa, tỉnh Khánh Hòa Trong đó, chủng vi khuẩn Azotobacter (bao gồm: L1, L2, L3, L4, L8, L10, L12, L14) có hoạt tính nitrogenase Chủng L8 chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase cao tất chủng tuyển chọn Điều kiện lên men thích hợp cho chủng L8 là: - pH môi trường nuôi cấy 6,8 - Nhiệt độ ni cấy thích hợp 300C - Nồng độ đường mơi trường ni cấy thích hợp 0,25% - Nồng độ muối mơi trường ni cấy thích hợp 0,06% - Thời gian ni cấy thích hợp 42h Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn L8 có khả kích thích nảy mầm hạt lúa, ngâm hạt lúa dung dịch có tỷ lệ dịch vi khuẩn: nước cất 1:19 tỷ lệ nảy mầm hạt lúa đạt cao nhất, tăng 14% so với mẫu đối chứng 4.2 Kiến nghị Qua q trình nghiên cứu chúng tơi đề nghị số ý kiến sau: Định danh chủng L8 Khảo sát sâu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng L8 công nghiệp Tiếp tục nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh từ chủng L8 52 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Gia Huy, Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng, Nhà xuất Giáo Dục Lê Văn Tiềm, Trần Công Tàu (1999), Phân tích đất trồng, Nhà xuất Nơng nghiệp Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2000), Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ vi sinh vật ( tập 1), Nhà xuất Đại học quốc gia Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, Nhà xuất Khoa hoc kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (2002), Công Nghệ Enzym, Nhà xuất Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh Aquilanti L., Favilli F., Clemanti F (2004), “Comperison of different strategies for isolation and preliminaru identification of Azotobacter from soil sampes”, Soil Biology and Biochemistry, 36, 1475-1483 Bhatia R., Ruppel S (2008), “Diversity studies of Azotobacter spp from wheat cropping systems of India”, Joural of Basic Microbiology, 48 (4), 455-463 10 Bretrand H., Nalin H., Bally R (2001), “Isolation and identification of the most efficient plant growth promoting bacterio associated with canola”, Biology and Fertility of Soil, 33, 152-156 11 Chaway C.P, Hynes R.K, Nelson L.M (1989), “Plant growth-promoting rhizobacteria effects on growth and nitrogen fixation of lentils and pea”, Soil Biology and Biochemistry, 21, 511-517 53 12 Damir O., Mladen D (2011), “Cultivation of the Bacterium Azotobacter chroococcum for preparation of biofertilizers”, African Journal of Biotechnology, Vol 10(16), 3104-3111 13 Duff J.T, Wyss O (1961), “Isolation and classification of a new series of Azotobacter bacteriophage”, J.gen.Microbial, 24, 273-289 14 Gatierrez I., Torres A.B, Moreno N (2011), “Optimising carbon and nitrogen sources for Azotobacter chroococcum growth”, African Journal of Biotechnology, 10 (15), 2951-2958 15 Glick B.R (1995), “The enhancement og plant growth by free-living bacteria”, Canadian Journal of Microbiology, 41, 109-117 16 Islam M.Z, Sharif D.I, Hossain M.A (2008), “A comparative study of Azotobacter spp from diffirent soil samples”, J.Soil.Nature, (3), 16-19 17 Jones I.W, Greaves J.E (1993), “Azotobacter chroococcum and its relationship to accessory growth factory”, African Journal of Biotechnology, (2), 751-763 18 Kizilkaya R (2008), “Nitrogen fixation capacity of Azotobacter spp strain isolated from soils in different ecosystems and relationship between them and the microbiologycal properties of soils”, J.Environ Biol, 30 (1), 73-82 19 Kloepper J.W, Hume D.J, Scher F.M (1988), “Plant growth-promoting rhizobacteria on canola”, Plant Disease, 72, 42-45 20 Sachin D (2009), “Effect of Azotobacter chroococcum (PGPR) on the Growth of Bamboo (Bambusa bamboo) and Maize ( Zea mays) Plants”, Biofrontiers, 1, 24-31 21 Sandeep C., Rushmi S.N, Shurmila V , Surekha R., Tejuswini R., Suresh C.K (2011), “Growth Response of Amaranthus Gangeticus Azotobacter chroococcum isolated from different Agroclimatic Zones Kamalaka”, Journal of Phytology, 65 (3), 56-73 22 Sarwar K., Macrac I.C (1992), “Determination of bacterially derived auxins using a microplate method” Lett Appl Microbiol, (20), 282-586 23 Shaukat et al (2006), “Growth response of triticum aestivum to plant growth promoting rhizobacteria used as a biofertilizers”, Reseach Journal of Microbiology, 4, 330-338 54 24 Suliasih, Widawati S (2005), “Isolation and identification of Phosphate solubilizing and nitrogen fixing Bacteria from soil in Wamena Biogical Garden, Jayawijaya, Papua”, Biodiversitas, 6, 157-177 25 Vigyan K., Sirohi K (2010), “Methodology of nitrogen Biofertilizer production”, Journal of Advances in Developmental Research, (1), 3-6 * TRANG WEB 26 http://www.agroviet.gov.vn 55 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường phân lập Sucrose 20g CaCO3 5g K2HPO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,2g NaCl 0,2g K2SO4 0,1g Agar 15g pH ( 250C) 6,8  Phụ lục 2: Thành phần môi trường lên men KH2PO4 0,5g MgSO4.7H20 0,3g NaCl 0,3g FeSO4 0,005g MnSO4 0,005g (NH4)6Mo7O24 0,005g CaCO3 3,5g Propynol 380 ml Sucrose 20g pH (ở 250C) 6,8  ... tài: Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase từ đất trồng lúa huyện Ninh Hòa-tỉnh Khánh Hòa” Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính nitrogenase. .. sinh Mẫu đất để phân lập vi khuẩn lấy từ đất trồng lúa thuộc hai xã Ninh Xuân Ninh Lộc, huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa Bảng 2.1: Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn STT Ngày phân lập Nơi phân lập 6.2.2012... chủng vi khuẩn tuyển chọn đến khả nảy mầm hạt lúa 34 Chương : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Phân lập chủng Azotobacter từ mẫu đất 36 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt