phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm

Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Văn Duy, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo môi trường thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của cô Nguyễn Thị Hải Thanh, chị Nguyễn Minh Nhật và một số bạn sinh viên lớp 49, 50 SH. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Nha Trang, tháng 07 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Tâm Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii LỜI NÓI ĐẦU 1 Chƣơng I. TỔNG QUAN 2 1.1. Tình hình bảo quản nguyên liệu thực phẩm 2 1.1.1. Trên thế giới 2 1.1.2. Ở Việt Nam 6 1.2. Tổng quan về bacteriocin 8 1.2.1. Đặc điểm chung về bacteriocin 8 1.2.2. Phân loại bacteriocin 9 1.2.3. Một số tính chất của bacteriocin 11 1.2.3.1. Độ bền nhiệt 11 1.2.3.2. Độ bền pH 11 1.2.3.3. Độ bền với các enzyme 11 1.3. Tổng quan về vi khuẩn lactic 13 1.3.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 13 1.3.2. Phân loại vi khuẩn lactic 13 1.3.3. Đặc điểm sinh trưởng 15 1.3.4. Ứng dụng 16 1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 18 1.4.1. Trên thế giới 18 1.4.2. Ở Việt Nam 21 Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Vật liệu 23 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang iii 2.1.1. Mẫu 23 2.1.2. Chủng vi khuẩn chỉ thị 23 2.1.3. Thiết bị chuyên dụng 24 2.1.4. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 24 2.2. Phƣơng pháp nguyên cứu 28 2.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ mẫu nƣớc dƣa lên men truyền thống có khả năng sinh bacteriocin 29 2.3.1. Phân lập vi khuẩn 29 2.3.2. Nuôi cấy và bảo quản chủng vi khuẩn 31 2.3.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 32 2.3.4. Thử với enzym proteinase K và α-chymotrypsin 34 2.3.5. Xác định độ bền nhiệt của dịch bacteriocin 35 2.3.6. Xác định độ bền pH đối với dịch bacteriocin thô 36 2.3.7. Xác định đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 36 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1.Phân lập vi khuẩn lactic từ nƣớc dƣa muối lên men truyền thống 38 3.2.Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 38 3.2.1. Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic 38 3.2.2. Kết quả kiểm tra với enzym proteinase K và α-chymotrypsin 41 3.3. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô 42 3.3.1. Độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô 43 3.3.2. Độ bền pH của dịch bacteriocin thô 44 3.4. Một số đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 45 3.5. Đặc điểm của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin đƣợc phân lập bổ sung từ ruột cá giò 47 3.5.1. Phân lập chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ ruột cá giò 47 3.5.2. Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn từ mẫu ruột cá giò 48 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang iv 3.5.3. Kết quả kiểm tra với enzym proteinase K và α-chymotrypsin 50 3.5.4. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô của chủng CT 1.1 51 3.5.5. Một số đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn phân lập từ mẫu ruột cá giò sinh bacteriocin 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang v DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT TT Kí hiệu viết tắt Nghĩa 1 LAB Lactic Acid Bacteria 2 MRS de Man, Rogosa and Sharpe 3 APW Alkaline Peptone Water 4 TSB Tryptone Soya Broth 5 TSA Tryptone Soya Agar 6 RV Rappaport - Vassiliadis 7 XLD Xylose Lysine Desoxycholate Agar 8 B 1.1 Bacillus B 1.1 9 C1 Vibrio C1 10 Sal 1 Salmonella Sal 1 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Bảng phân loại bacteriocin 10 Bảng 2. Tính chất hóa lý của một số bacteriocin của vi khuẩn Gram dương 12 Bảng 3. Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn lactic 23 Bảng 4. Số chủng vi khuẩn phân lập được từ nước dưa, ruột cá giò 38 Bảng 5. Bảng khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào từ vi khuẩn lactic 39 Bảng 6. Đường kính vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ các chủng T8 và T13 sau khi xử lý nhiệt và pH……………………………………………… 43 Bảng 7. Bảng khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào của các chủng vi khuẩn được phân lập từ ruột cá giò………………………………… 46 Bảng 8. Đường kính vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng CT 1.1 sau khi xử lý nhiệt và pH …………………………………………………….49 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang vii DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc của nisin 8 Hình 2. Cấu trúc của colicin 9 Hình 3. Kiểu hoạt động của bacteriocin của vi khuẩn lactic (LAB) 11 Hình 4. Một số chủng vi khuẩn lactic 15 Hình 5. Pho mát chứa loại vi khuẩn có thể làm ra loại thuốc kháng sinh có khả năng chống nhờn thuốc 21 Hình 6. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 29 Hình 7. Sơ đồ pha loãng mẫu 30 Hình 8. Quy trình thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô với các chủng chỉ thị…. 33 Hình 9. Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với chủng chỉ thị Salmonella Sal 1 trên môi trường XLD 40 Hình 10. Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nước dưa thể hiện tính kháng với chủng chỉ thị Bacillus B1.1 trên môi trường TSA…………… 40 Hình 11. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn T13 (A) và T8 (B) với enzym proteinase K trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1. 41 Hình 12. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của chủng vi khuẩn T8 (A) và T13 (B) với enzym α-chymotrypsin trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Bacillus B1.1 42 Hình 13. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T13 sau khi xử lý các nhiệt độ khác nhau. 43 Hình 14. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T8 sau khi xử lý ở pH 2-12 ………………………………………………………………………….44 Hình 15. Vòng kháng Bacillus B1.1 của dịch bacteriocin từ chủng T13 sau khi xử lý ở pH 2-12 45 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang viii Hình 16. Khuẩn lạc chủng T8 sau 24 giờ nuôi trên môi trường thạch MRS ở pH 6,5 và nhiệt độ 40 O C 46 Hình 17. Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T8 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 46 Hình 18. Tế bào của chủng vi khuẩn lactic T13 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 47 Hình 19. Khuẩn lạc chủng CT 1.1 được nuôi cấy trên môi trường thạch TSA, pH 7,5 và ở nhiệt độ 40 0 C. 48 Hình 20. Các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá giò thể hiện hoạt tính kháng với chủng Vibrio C1 trên môi trường thạch TSA ở 40 0 C…………………………….49 Hình 21. Các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá giò thể hiện tính kháng với chủng Bacillus B 1.1 trên môi trường thạch TSA, ở 40 0 C. 50 Hình 22. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của vi khuẩn CT 1.1 với enzym proteinase K trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Vibrio C1 50 Hình 23. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin thô của vi khuẩn CT 1.1 với enzym α- chymotrypsin trên môi trường TSA với chủng chỉ thị Vibrio C1 51 Hình 24. Vòng kháng Vibrio C1 của dịch bacteriocin từ chủng CT 1.1 sau khi xử lý các nhiệt độ khác nhau. 52 Hình 25. Vòng kháng Vibrio C1 của dịch bacteriocin từ chủng CT 1.1 sau khi xử lý ở pH 2-12 53 Hình 26. Khuẩn lạc chủng CT 1.1 phân lập từ ruột cá giò được nuôi cấy trên môi trường thạch TSA sau 7 ngày nuôi ở 40 0 C 53 Hình 27. Tế bào của chủng vi khuẩn CT 1.1 sau khi nhuộm Gram được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại X-100 54 Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 1 LỜI NÓI ĐẦU Thực phẩm là một trong những nhu yếu phẩm không thể thiếu trong đời sống hằng ngày của mỗi người. Thực phẩm phải tươi, ngon theo đúng nghĩa của nó mà không bị mất đi giá trị dinh dưỡng ban đầu, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Những yêu cầu trên cũng chính là đòi hỏi hàng đầu của các phương pháp bảo quản thực phẩm. Vì hầu hết các loại nông sản thực phẩm tươi sống ở nước ta thường được bảo quản bằng các chất hóa học. Tuy nhiên, phương pháp này chưa đáp ứng được yêu cầu về an toàn thực phẩm. Hiện nay trên thế giới, các nhà khoa học đã tìm được một phương pháp bảo quản thực phẩm bằng sinh học nhưng còn khá mới mẻ ở nước ta – chính là sử dụng bacteriocin làm chất bảo quản sinh học an toàn. Mặc dù có một vài phương pháp khác bacteriocin, nó có thời gian bảo quản lâu hơn nhưng ngày nay con người càng ý thức nhiều về sức khỏe nên họ tránh dùng những thực phẩm được bảo quản bằng chất hóa học. Chính vì vậy, việc thực hiện đề tài: ―Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm‖ là rất cấp thiết. Đề tài này được tiến hành với các mục tiêu sau: + Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa muối lên men truyền thống + Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn được + Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin Đồ án tốt nghiệp Tháng 7/2011 Nguyễn Thị Thanh Tâm Trang 2 Chƣơng I. TỔNG QUAN 1.1. Tình hình bảo quản nguyên liệu thực phẩm 1.1.1. Trên thế giới Trong suốt chiều dài lịch sử, con người đã thích ăn thực phẩm còn tươi hơn là các dạng thực phẩm khác như bị ươn, thực phẩm dạng sấy khô…. Tuy nhiên, do thực phẩm hư hỏng rất nhanh nên từ lâu loài người đã phải phát triển những phương pháp để bảo quản nguyên liệu thực phẩm. Có rất nhiều phương pháp bảo quản thực phẩm trên thế giới, song nhìn chung các phương pháp đều tuân thủ theo ba nguyên tắc Bioza, Abiosis và Anabioza. Thực chất các nguyên tắc này như sau: Theo nguyên tắc Bioza (Bios = sự sống) thì thực phẩm được cất giữ ở điều kiện vệ sinh tốt, với môi trường vô trùng tuyệt đối để luôn luôn giữ nguyên trạng thái tươi sống ban đầu của nguyên liệu. Ví dụ, thịt lợn, thịt bò tươi trong phòng mát, vô trùng luôn được giữ ở nhiệt độ 0 0 C – 10 0 C. Tuy nhiên, các phương pháp này không thích hợp ở điều kiện nhiệt đới, lại đòi hỏi thiết bị đắt tiền, do vậy ở Việt Nam rất ít ứng dụng. Còn theo nguyên tắc Abioza (Abiosis = không sống), người ta dùng những biện pháp đình chỉ hoàn toàn sự sống của vi sinh vật gây nhiễm. Dưới tác dụng của các yếu tố diệt khuẩn như vậy thì bản thân khối nguyên liệu được bảo quản cũng thay đổi trạng thái, không còn tươi sống nữa. Thuộc nguyên tắc này có ba phương pháp được sử dụng như thanh trùng ở nhiệt độ cao, chiếu xạ và siêu âm, dùng hóa chất bảo quản. Thanh trùng ở nhiệt độ cao còn gọi là sử dụng quá trình nhiệt nóng. Vì là dưới tác dụng của nhiệt, hoặc do chính các tế bào vi sinh vật bị tiêu diệt, hay do chính các enzym quan trọng của chúng bị bất hoạt, do vậy không gây nhiễm được. Cũng tùy vào loại thực phẩm người ta có thể thực hiện việc khử trùng nguyên liệu ở ba khoảng nhiệt độ khác nhau, kéo dài trong những khoảng thời gian nhất định. Ví dụ như đối với loại thực phẩm có nhiều đường bột dễ cháy cần duy trì ở 80 0 C–90 0 C trong 30–45 phút, những nguyên liệu dạng đạm duy trì ở 90 0 C–100 0 C [...]... số protein có ở vi khuẩn cụ thể là bacteriocin được sản xuất và phân lập từ nhiều nguồn khác nhau cụ thể là vi khuẩn lactic với khả năng ức chế và tiêu diệt những loại vi khuẩn gây bệnh có trong thực phẩm 1.1.2 Ở Vi t Nam Ở nước ta hiện nay ngoài các phương pháp bảo quản thông thường như vận chuyển thực phẩm tươi, làm lạnh, lên men thực phẩm nhưng vẫn nổi trội hơn cả là phương pháp bảo quản bằng hóa... là Streptococcus lactic) Từ đó đến nay nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập và nghiên cứu Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hầu hết không di động, có khả năng lên men đường để tạo axit lactic Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydrocacbon và tiết ra axit lactic Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriace và được xếp vào bốn chi: Streptococcus,... màu trắng đục hoặc màu vàng kem hay khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắng đục Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid, khuẩn lạc dạng S 1.3.2 Phân loại vi khuẩn lactic Người ta thường dựa vào quá trình lên men chia vi khuẩn lactic thành hai loại: vi khuẩn lactic lên men đồng hình và dị hình Vi khuẩn lactic lên men đồng hình bao gồm: Lactobacterium casei là những trực khuẩn rất ngắn, gây chua... cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan có nhiều ưu vi t hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên Có được ưu điểm này là do ngoài những tính chất ưu vi t vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, một chất bảo quản thực phẩm Bên cạnh đó, ở nước ta đã sử dụng bacteriocin trong quá trình làm nem chua Kết quả đã kéo thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp... Mẫu phân lập vi khuẩn từ ruột cá giò lấy từ cá giò tươi được thu mua ở đìa nuôi Lương Sơn – Nha Trang – Khánh Hòa Bảng 3 Bảng lấy mẫu phân lập vi khuẩn lactic STT Ngày lấy mẫu Nguồn phân lập 1 5.8.2010 Nước dưa 2 25.8.2010 Nước dưa 3 6.12.2010 Nước dưa 4 20.12.2010 Nem chua 5 4.1.2011 Nem chua 6 19.3.2011 Ruột cá giò 2.1.2 Chủng vi khuẩn chỉ thị Các chủng Chủng Salmonella Sal 1, Bacillus B1.1 và Vibrio... điểm sinh trƣởng Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau, đặc biệt nhu cầu về vitamin và nitơ Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon từ các loại hexose, các đường đôi cho đến các polysaccharide Một vài loại vi khuẩn lên men dị hình, phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm, trong quá trình trao đổi chất chúng tạo ra CO2, axit acetic và axit lactic Do chủ yếu các vi khuẩn. .. trong quá trình bảo quản thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh Trong số đó, sự sản xuất bacteriocin từ vi khuẩn lactic đã thu hút nhiều sự cố ý Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó... góp phần vào vi c nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại Bacteriocin là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà vi c ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú hơn Năm 1970, nhóm tác giả Kekessy và Piguet thuộc vi n Vệ sinh và An toàn thực phẩm – Thụy Sĩ đã nghiên cứu một phương pháp mới trong vi c phát hiện ra bacteriocin Chủng vi sinh vật... độ và pH có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loại môi trường mà vi c sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất Các nhà nghiên cứu Csiro để tìm ra một vài bacteriocin và sử dụng chúng để tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh giống trong gà và lợn Bộ gen cho phân tử bacteriocin sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh hoặc vi rút mà có thể sinh sản và tiết ra bacteriocin. .. tốt nghiệp Tháng 7/2011 Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan-tsai của Đài Loan Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Năm 2006, Marcinowski, giám đốc điều hành nghiên cứu tại BASF cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn có lợi Lactobacillus do công ty . hóa học. Chính vì vậy, vi c thực hiện đề tài: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm là rất cấp thiết. . tiêu sau: + Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa muối lên men truyền thống + Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin thô từ các chủng tuyển chọn được +. khuẩn lactic sinh bacteriocin 36 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 .Phân lập vi khuẩn lactic từ nƣớc dƣa muối lên men truyền thống 38 3.2 .Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin