phân lập và lưu giữ giống tảo lục chlorella sp

33 Hình 3.2: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt độ khác nhau Hình 3.3: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏ

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới:

 Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô trong khoa Nuôi trồng thủy sản – Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học và thực hiện công tác tốt nghiệp

 TS Phạm Quốc Hùng đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập

 ThS Nguyễn Văn Đảm cùng các cô chú, anh chị trong Trại cá Gành Son– Tuy Phong– Bình Thuận đã tạo điều kiện và tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 20 tháng 6 năm 2012

Sinh viên

Trần Thị Thúy Phương

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 HỆ THỐNG PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC Chlorella sp 3

1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo lục Chlorella sp ( theo Đặng Đình Kim, 1998) 3

1.1.2.1 Phân bố 3

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Chlorella sp 4

1.1.2.3 Sinh trưởng 4

1.1.2.4 Sinh sản 5

1.1.3 Thành phần hóa sinh của vi tảo 6

1.1.3.1 Lipid 6

1.1.3.2 Protein 7

1.1.3.3 Carbohydrat 7

1.1.3.4 Sắc tố 8

1.1.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng của tảo 8

1.1.4.1 Ánh sáng 8

1.1.4.2 Nhiệt độ 9

1.1.4.3 Độ mặn 10

1.1.4.4 pH 10

1.1.4.5 Chế độ sục khí 10

1.1.4.6 Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng 11

1.2 Vài nét về tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo 13

1.2.1 Tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo trên thế giới 13

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 14

1.3 Vai trò của vi tảo trong nuôi trồng thủy sản 15

1.3.1 Vai trò của thực vật phù du trong ao nuôi trồng thủy sản 15

1.3.2 Vai trò của vi tảo trong sản xuất giống nhân tạo các đối tượng thủy sản 16

1.3.3 Tác hại do vi tảo gây ra 20

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 22

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 23

2.3 Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, môi trường dinh dưỡng 23

2.3.1 Chuẩn bị dụng cụ 24

2.3.2 Thiết bị phục vụ 24

2.3.3 Nguồn nước 24

2.3.4 Vô trùng các dụng cụ thí nghiệm 25

2.3.5 Nguồn tảo 25

2.3.6 Môi trường dinh dưỡng trong các thí nghiệm 25

2.3.7 Bố trí thí nghiệm 26

2.3.7.1 Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch 26

2.3.7.2 Thí nghiệm xác định điều kiện lưu giữ tảo giống thích hợp 27

2.3.8 Phương pháp nhân tảo giống 28

2.3.9 Phương pháp xác định mật độ tế bào, tốc độ sinh trưởng hằng ngày và các yếu tố môi trường nuôi 29

2.3.9.1 Đếm tế bào 29

2.3.9.2 Công thức xác định tốc độ sinh trưởng hằng ngày 30

2.3.9.3 Kiểm tra các yếu tố môi trường 31

2.3.9.4 Xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Phân lập tảo Chlorella sp trên môi trường thạch 32

3.2 Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau 34

3.2.1 Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ và nhiệt độ khác nhau34 3.2.1.1 Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ lỏngvà nhiệt độ khác nhau 34

3.2.1.2 Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏngvà nhiệt độ khác nhau 35

3.2.2 Lưu giữ tảo Chlorella sp trong khoảng thời gian khác nhau 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 42

KẾT LUẬN 42

Thí nghiệm về phân lập Chlorella sp 42

Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp 42

ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Chlorella sp………3

Hình 1.2: Đường cong sinh trưởng của quần thể vi tảo 5

Hình 2.1: Cách đếm tế bào tảo bằng buồng đếm hồng cầu 29

Hình 2.2: Cấu tạo buồng đếm hồng cầu 30

Hình 3.1: Quần lạc tảo Chlorella sp mọc trên môi trường thạch 33

Hình 3.2: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt độ khác nhau Hình 3.3: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏng và nhiệt độ khác nhau Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ tới tốc độ tăng trưởng của Chlorella sp 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần của vi tảo (tính theo khối lượng khô tế bào) 6

Bảng 1.2: Thành phần sinh hóa của Chlorella sp (theo Đặng Đình Kim, 1998): 6

Bảng 1.3: Môi trường tối ưu để nuôi một số loài tảo 9

Bảng 1.4: Các loại vitamin có trong vi tảo biển 17

Bảng 1.5: Các lớp và chi tảo được nuôi trồng để làm thức ăn cho động vật thủy sinh18 Bảng 1.6: Ước tính sản lượng sinh khối tảo theo khối lượng khô cho nhu cầu nuôi ấu trùng và hậu ấu trùng của NTTS thế giới năm 1999……… 25

Bảng 2.1: Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ dạng lỏng với nhiệt độ khác nhau 27

Bảng 2.2: Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ dạng bán lỏng với nhiệt độ khác nhau 27

Bảng 2.3: Thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp 28

Bảng 3.1: Độ thuần chủng của Chlorella sp (%) bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch 32

Bảng 3.2: Sinh trưởng của Chlorella sp khi đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt độ khác nhau 34

Bảng 3.3: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏng và nhiệt độ khác nhau 36

Bảng 3.4: Sinh trưởng của Chlorella sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở khoảng thời gian khác nhau 39

MỞ ĐẦU

Vai trò của vi tảo đã được giáo sư Winberg (1965) đúc kết trong câu nói:

“không có tảo sẽ không có nghề cá” Thật vậy, vi tảo là thức ăn trực tiếp của rotifer,

copepoda, những loài này là thức ăn của ấu trùng các loài tôm, cá biển Đối với các

loài cá, giáp xác thì nhu cầu về thức ăn là vi tảo chỉ giới hạn trong thời gian đầu của vòng đời nhưng đối với các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ thì vi tảo là thức ăn trong suốt vòng đời của chúng [15]

Vi tảo có hàm lượng dinh dưỡng cao, đặc biệt là vi tảo biển với hàm lượng Protein 29-57%, lipid 7-25%, cacbonhydrat 2-32%, khoáng và các vitamin 6-39%[20] Ngoài ra vi tảo còn chứa các acid béo không no cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của các đối tượng nuôi Vì vậy chúng được sử dụng làm thức ăn trong sản xuất giống các đối tượng nuôi trồng thủy sản từ những năm 40

Nuôi trồng thủy sản ở nước ta những năm gần đây có những bước chuyển mình đáng kể, nhất là sự chuyển đổi đối tượng nuôi Các đối tượng nuôi mới như nhuyễn thể hai mảnh vỏ, cá biển đang ngày càng được chú trọng Do đó nhu cầu con giống của các đối tượng này đang rất được quan tâm Và trong sản xuất giống thân mềm, cá biển thì nhu cầu về vi tảo là không thể thiếu [10]

Vi tảo có rất nhiều loài nhưng được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản thì

hiện nay là khoảng 32 loài bao gồm tảo Lục, tảo Khuê, trong đó có vi tảo Chlorella

Các loài này phải có hàm lượng dinh dưỡng cao, kích thước phù hợp, không có độc

tố, tốc độ tăng trưởng nhanh để có thể nuôi sinh khối với số lượng lớn [5]

Tuy nhiên đa số các loài tảo đang được nuôi ở nước ta hiện nay là các loài nhập nội Điều này gây nên một số khó khăn như sự khác nhau về điều kiện khí hậu, không chủ động về nguồn giống cung cấp, các loài tảo bản địa thì không thuần khiết, nhiễm tạp và nhiễm khuẩn nhiều [16] Bên cạnh đó các công trình nghiên cứu về vi tảo ở nước ta hiện nay chủ yếu thiên về nuôi sinh khối, các công trình nghiên cứu về phân lập, lưu giữ các giống tảo thuần còn chưa được chú trọng

Với mong muốn được góp phần tạo ra các giống tảo thuần chủng có giá trị trong nuôi trồng thủy sản và xác định được một số điều kiện lưu giữ tảo thuần, được

sự cho phép của Trường Đại học Nha Trang, khoa Nuôi trồng thủy sản, bộ môn Sinh học nghề cá tôi đã tiến hành đề tài:

“Phân lập và lưu giữ giống tảo Lục Chlorella sp”

 Mục tiêu:

- Phân lập được tảo Lục nước mặn Chlorella sp

- Xác định một số điều kiện lưu giữ thích hợp

 Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập Chlorella sp nước mặn trên môi trường thạch sử dụng môi trường

dinh dưỡng F2

- Lưu giữ Chlorella sp trong các điều kiện khác nhau

 Ý nghĩa của đề tài:

- Góp phần tạo ra giống tảo thuần chủng Chlorrella sp

- Lưu giữ giống tảo Chlorella sp hiệu quả hơn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 HỆ THỐNG PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC Chlorella sp

1.1.1 Hệ thống phân loại

Theo Komapoenko và Vasilieva, năm 1978 [15]thì vị trí phân loại của Chlorella

sp được xác định như sau:

1.1.2.1 Phân bố

Tảo lục chủ yếu phân bố ở các thủy vực nước ngọt, chỉ có khoảng 10% phân

bố ở các thủy vực nước lợ, mặn Chlorella sp sinh sản bằng bào tử và không đòi hỏi điều kiện sống nên Chlorella sp phân bố rộng khắp mọi thủy vực nước ngọt Theo

chiều dọc thì tảo lục phân bố từ vùng núi cao đến vùng biển sâu Theo chiều ngang thì nó phân bố từ vùng xích đạo đến vùng ôn đới và hàn đới Tảo lục phát triển

mạnh ở những nơi có ánh sáng mạnh

Chlorella sp phân bố ở khắp nơi trên thế giới, ở những thủy vực giàu dinh

dưỡng Pauw và ctv (1983 trích theo Vũ Thị Thùy Minh, 2005) cho rằng tảo lục

Chlorella sp là loài rộng nhiệt Ở Việt Nam Chlorella sp sống tốt trong khoảng

nhiệt độ 15-350C, độ mặn 5- 30‰, pH 7,5- 8,5

1.1.2.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Chlorella sp

Tảo lục Chlorella hay còn được gọi là rong tiểu cầu, có cấu trúc cơ thể dạng

monas đơn bào hình trứng, hình tròn hay hình ovan Đường kính tế bào trung bình khoảng 5µm - 10µm, không vượt quá 15µm [2] Tế bào không có roi nên không có khả năng di động

Đa số tế bào có một nhân Nhân gồm có màng dịch nhân, hạch nhân và mạng lưới nhiễm sắc Sắc tố quang hợp chỉ có một thể sắc tố chloroplast và có dạng hình chén Lục lạp được bao phủ bởi một màng mỏng kép, bên trong chứa dịch protein gọi là chất nền (matrix) và những cấu trúc dạng bản mỏng hay là lamen Lục lạp là nơi duy nhất trong tế bào tích lũy tinh bột, tinh bột tập trung xung quanh cơ quan chuyên hóa gọi là pyreoit hay hạt tạo bột

Chất dự trữ của vi tảo Chlorella sp là tinh bột

1.1.2.3 Sinh trưởng

Chu trình sinh trưởng gồm 5 giai đoạn:

- Pha gia tốc dương: trong giai đoạn này vi tảo bắt đầu có sự tiếp xúc và dần thích nghi với môi trường sống Cơ thể tiến hành hấp thu các chất dinh dưỡng và phân cắt tế bào Ở môi trường thuận lợi và có dinh dưỡng phong phú thì quần thể có tốc độ sinh trưởng nhanh Do số lượng tảo giống ít nên số lượng vi tảo tăng trong một đơn vị thời gian là không lớn, nên sinh trưởng quần thể chậm

- Pha logarit: sau pha gia tốc dương, quần thể vi tảo đã đạt đến một mật độ nhất định, môi trường dinh dưỡng còn thuận lợi, vi tảo đẩy mạnh quá trình hấp thu

dưỡng chất, đẩy nhanh tốc độ tăng trưởng Mật độ và sinh khối tế bào ở giai đoạn này tăng lên với tốc độ nhanh nhất

- Pha gia tốc âm: số lượng vi tảo lớn, môi trường đã bắt đầu bất lợi cho cho tảo phát triển nhất là yếu tố dinh dưỡng nên tốc độ sinh trưởng của quần thể chậm hơn nhiều so với pha logarit

- Pha cân bằng: số lượng quần thể đạt đến cực đại, số lượng vi tảo sinh ra và chết đi gần bằng nhau

- Pha tàn lụi: số lượng vi tảo giảm đi một cách rõ rệt do khả năng sinh sản của vi tảo mất dần sau khi đạt giá trị cực đại

Đường cong sinh trưởng của vi tảo được thể hiện ở Hình 1.1:

Hình 1.2: Đường cong sinh trưởng của quần thể vi tảo 1.1.2.4 Sinh sản

Chlorella là chi sinh sản vô tính, không có sinh sản hữu tính Quá trình sinh

sản nhờ tạo từ cơ thể mẹ các tự bào tử Tế bào mẹ phân chia ra 2, 4, 8, 16, 32 thậm chí có trường hợp tạo thành 64 tự bào tử Sau khi kết thúc sự phân chia, tự bào tử tách ra khỏi tế bào bằng cách hủy hoại màng tế bào mẹ Các tế bào trẻ này lớn lên cho đến giai đoạn chín sinh dục rồi toàn bộ chu trình lập lại từ đầu

Để tăng sinh khối tảo Chlorella sp lên gấp đôi trong điều kiện tối ưu thì cần

từ 4-6 giờ Điều chú ý là với những thời kì phát triển nhất định của tế bào thì tảo cần ở ngoài ánh sáng hoặc trong tối Ví dụ như ở pha sinh trưởng tảo cần đến ánh sáng nhưng quá trình phóng thích bào tử ra ngoài môi trường lại tiến hành trong tối

N

t N: Mật độ tế bào

t : Thời gian

1.1.3 Thành phần hóa sinh của vi tảo

Thành phần dinh dưỡng của các loài vi tảo khác nhau có sự khác nhau rõ rệt giữa các loài, ngay cả giữa các dòng trong cùng một loài cũng có sự khác nhau [3] Ngoài ra còn khác nhau ở các giai đoạn khác nhau trong chu kì sinh trưởng, phát triển của chúng [17] Nhưng nói chung dinh dưỡng của vi tảo đã được Brown và ctv, (1991) [18] trình bày ở Bảng 1.1:

Bảng 1.1: Thành phần của vi tảo (tính theo khối lượng khô tế bào) [12]

Cacbohydrate 10-30% Chủ yết là polysaccharide

Lipid 10-25% Các acid béo: 20-40% lipid tổng số

phosphorlipid : 10% lipid tổng số Protein 30-55% Thành phần amino acid tương tự protein trứng gà (albumin) Khoáng 10-40% Phosphor, silic (tảo khuê), canxi, natri

Bảng1.2: Thành phần sinh hóa của Chlorella sp [17]

Vitamine B1 Vitamine C Vitamine K Vitamine B6 Vitamine B2 Vitamine B12 Niacin Acid nicotinic

1800 30-60

600 2,3 3,5 700-900

2500

10000

Kết quả nghiên cứu của Renaud, Thinh & Parry (1999) đã chỉ ra rằng vi tảo phát triển đến cuối pha logarit thường chứa 30-40% protein, 10-20% lipid, 5-10% carbohydrate Khi qua pha cân bằng thì hàm lượng này bị biến đổi rất lớn Mối liên

quan giữa thành phần dinh dưỡng với hàm lượng lipid tổng số, carbohydrate và protein không được thể hiện rõ (Web & Chu, 1981; Brown, 2000 Trích theo Nguyễn Thị Xuân Thu và ctv, 2004)

1.1.3.1 Lipid

Số lượng và chất lượng lipid trong vi tảo được xem là có giá trị cao trong nuôi trồng thủy sản nhưng hàm lượng lipid ở các loài không cao lắm và chịu nhiều tác động của môi trường nuôi Khi nghiên cứu thành phần sinh hóa của 40 loài tảo được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản cho thấy hàm lượng lipid biến động từ 7-25% khối lượng khô [9] Theo tổng kết này thì Bacillariophyceae có hàm

lượng lipid đạt cao nhất, trung bình là 18%, Tetraselmis suecica (thuộc lớp

Prasionphyceae) có hàm lượng lipid thấp nhất

Riêng Chlorella sp hàm lượng lipid chiếm từ 10-15% trọng lượng khô của tế

bào và có thành phần acid béo khá cao (C18:1, C18:2, C18:3) đạt khoảng 55-60% tổng acid béo [15]

Đối với Chlorella sp hàm lượng protein tổng số chiếm 40-60% khối lượng khô [17]

1.1.3.3 Carbohydrat

Theo Parsons và ctv (1961) (trích Phạm Thị Lam Hồng, 1999) hàm lượng cacbohydrat của tảo biến động 5-32% khối lượng khô Các loài tảo thuộc ngành tảo Chlorophyta có hàm lượng cacbohydrat cao nhất, chiếm 32% khối lượng khô Hàm

lượng cacbohydrat trong Chlorella sp chiếm 15-35% khối lượng khô [17]

1.1.3.4 Sắc tố

Màu của mỗi ngành tảo có sự liên quan đặc biệt đến sắc tố của nó Chlorophylla là sắc tố quang hợp đầu tiên ở mỗi loài tảo Ngoài ra còn có Carotenid (chủ yếu là sắc tố vàng, vàng cam), Phycoerythin, phycocyanin Các sắc tố này biến động ở các loài tảo và chiếm một lượng nhỏ hơn 1% khối lượng khô Đối với

Chlorella sp thì thành phần sắc tố gồm: Β- caroten 0,16% khối lượng khô,

xanthophyll 3,6-6,6% khối lượng khô, Chlorephylla 2,2% khối lượng khô, Chlorophyll 0,58% khối lượng khô

1.1.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự sinh trưởng của tảo

1.1.4.1 Ánh sáng

Ánh sáng là yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của vi tảo, là nguồn năng lượng chính cho quá trình quang hợp của chúng Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng của chúng được thể hiện ở khía cạnh chất lượng ánh sáng (phổ màu), cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng [8] Cường độ ánh sáng tối ưu là từ 2500-4000lux Cường độ ánh sáng quá lớn hay quá nhỏ đều có thể ức chế sự quang hợp của tảo Trong điều kiện phòng thí nghiệm ta có thể điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng hệ thống đèn neon, còn khi nuôi ngoài trời do cường độ ánh sáng mặt trời quá lớn nên cần có mái che Một số loài tảo không tăng trưởng trong điều kiện chiếu sáng liên tục [18] Ánh sáng liên tục không làm tăng năng suất của tảo mà còn làm giảm hàm lượng protein, cacbohydrat và các acid béo không no HUFA [5] Theo Guillard (1975) thì những loài tảo được nuôi làm thức ăn mới thích ứng trong điều kiện chiếu sáng liên tục và sử dụng ánh sáng khuyếch tán chứ không phải ánh sáng mặt trời trực tiếp

Ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng đến chất lượng tảo Theo Kowallik (1987), (trích Hà Lê Thị Lộc, 2000) thì ánh sáng màu xanh làm tăng lượng protein của tảo trong khi ánh sáng màu đỏ làm tăng lượng cacbohydrat

Cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, chất lượng ánh sáng còn phụ thuộc vào loài, mật độ nuôi khác nhau

Bảng 1.3: Môi trường tối ưu để nuôi một số loài tảo [13]

sáng (lux)

Nhiệt độ (ºC)

25-28 25-28 25-30 25-28 25-35 25-30 25-30

30-35 30-40 30-32 30-32 20-25 20-25 28-30

7,5-8,5 7,5-8,5 7,5-8,5 6,0-8,0 8,0-9,0 8,0-9,0 7,5-8,0

1.1.4.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của tất cả các sinh vật trên trái đất nói chung và đối với vi tảo nói riêng Đối với vi tảo nhiệt độ ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào, tốc độ phản ứng trao đổi chất, quang hợp, mật độ phân

bố, cường độ hô hấp, kích thước tế bào và sự thích nghi của loài Hầu hết vi tảo có thể sống trong khoảng 16-30ºC, nhiệt độ cao quá 35ºC hay thấp hơn 16ºC vi tảo kém phát triển và có thể gây chết một số loài nếu ngưỡng nhiệt độ này kéo dài Nhiệt độ thích hợp cho vi tảo sinh trưởng và phát triển nằm trong khoảng 20-25ºC [9] Nhiệt độ này có thể thay đổi theo thành phần môi trường nuôi và theo loài

Đối với Chlorella sp nhiệt độ dưới 15ºC và trên 35ºC tảo sinh trưởng kém Ở

nhiệt độ 25-30ºC với điều kiện dinh dưỡng tốt, cường độ ánh sáng và sự khuấy đảo

thích hợp vi tảo Chlorella sp phát triển nhanh [17]

Trong sản xuất đại trà vi tảo ở các trại nuôi trồng thủy sản thì nhiệt độ quyết định rất lớn đến năng suất và chất lượng vi tảo Hơn nữa, Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, sự biến đông nhiệt độ trong năm rất lớn Mùa đông nhiệt độ

có thể xuống tới 5-7ºC, mùa hè nhiệt độ có thể lên tới 38ºC Do đó để đảm bảo được tính ổn định và lâu dài trong sản xuất thì giải pháp tạo ra các giống thuần chủng có nguồn gốc bản địa được xem là rất hiệu quả

1.1.4.3 Độ mặn

Mỗi loài vi tảo có khả năng thích nghi với các độ mặn khác nhau nhưng đa

số các loài vi tảo có khả năng chịu đựng rất lớn những thay đổi về độ mặn Tảo

Chaetoceros sp thích hợp ở độ mặn 20-35‰, tốt nhất ở 30‰,, Skeletonema costatum lại thích hợp với độ mặn 15-25‰ [5] Theo Tôn Nữ Mỹ Nga tảo Chaetoceros glacilis có thể phát triển ở độ mặn từ 15-35‰ Chlorella sp là loài

rộng muối, có thể sinh trưởng ở độ mặn 5-30‰ nhưng tốt nhất là khoảng 25-30‰ [12]Độ mặn thay đổi làm biến đổi áp suất thẩm thấu, hạn chế quá trình quang hợp,

hô hấp, tốc độ sinh trưởng và làm giảm sự tích lũy glucogen

1.1.4.4 pH

Sự biến đổi của nhiệt độ và ánh sáng đều ảnh hưởng đến pH thông qua quá trình quang hợp của tảo, do đó pH được xem là yếu tố biến đổi nội tại pH của môi trường nuôi quá cao hoặc quá thấp đều làm chậm tốc độ tăng trưởng của vi tảo, có thể dẫn đến tàn lụi Đặc biệt pH ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo thông qua sự ảnh hưởng gián tiếp đến một số yếu tố như độ kiềm, khí độc (chủ yếu là H2S) Biên độ pH đối với hầu hết các loài tảo nuôi là từ 7-9, biên độ tối

ưu là 8,2-8,7 [1] pH thích hợp cho Chlorella sp phát triển là từ 7,5-8,5.

1.1.4.5 Chế độ sục khí

Năng suất của tảo phụ thuộc nhiều vào khuấy đảo huyền phù trong bể nuôi Nhờ có khuấy đảo các chất dinh dưỡng phân bố đều trong môi trường, tảo tiếp xúc nhiều với ánh sáng và làm tảo không bị lắng Người ta thường dùng các động cơ để tạo dòng chảy hoặc dùng bàn trang khuấy sục trong bể nuôi Cũng có thể dùng biện pháp thổi khí để khuấy đảo dịch tảo cũng mang lại hiệu quả cao Khi khuấy đảo dịch tảo bằng máy bơm có công suất khác nhau thì cũng cho những hiệu quả rất khác nhau

Tuy nhiên, sục khí quá mạnh cũng không tốt cho vi tảo Sục khí quá mạnh sẽ làm vỡ tế bào tảo, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi tảo, đôi khi có thể làm tảo chết

1.1.4.6 Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng

Các yếu tố dinh dưỡng là một trong những yếu tố quan trọng nhất, có tính chất quyết định đến sinh trưởng và phát triển của vi tảo cả về số lượng và chất lượng Việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi giúp tăng năng suất tảo lên rất nhiều so với ngoài tự nhiên Thành phần dinh dưỡng thiết yếu cho vi tảo bao gồm thành phần đa lượng (nito, photphat, silic), thành phần vi lượng (giúp cho quá trình trao đổi, hấp thu các chất dinh dưỡng) và một số vitamin nhằm năng cao chất lượng

vi tảo

Mỗi loài vi tảo khác nhau có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Đối với

Chlorella sp thì việc tăng gấp 20 lần hàm lượng muối KNO3, KH2PO4, MgSO4 (từ 0,001 đến 0,002M) cũng không ảnh hưởng đến sinh trưởng của chúng (Myers, 1935 trích theo Vũ Thùy Minh, 2005) Thậm chí người ta cho rằng đã thu được sản lượng

cao Chlorella sp khi tăng nồng độ muối trong dung dịch lên 0,063M (theo Speckis,

Milner, 1949) (trích Vũ Thị Thùy Minh, 2005) Thực tế có sự khác nhau về thành phần dinh dưỡng trong các môi trường nuôi đối với cùng một đối tượng ở các nơi khác nhau Sự khác nhau đó xuất phát từ nguồn dinh dưỡng sẵn có trong các thủy

vực tự nhiên mà chúng sinh sống Đối với Chlorella sp thì hai yếu tố dinh dưỡng

đóng vai trò quan trọng nhất là N, P nhưng cũng không thể xem nhẹ các yếu tố khác

 Ni- tơ

Ni- tơ đóng vai trò quan trọng đối với thực vật nói chung và vi tảo nói riêng

vì ni- tơ là thành phần cơ bản tạo nên các loại protein cấu trúc Ngoài ra ni- tơ còn tham gia vào cấu tạo của nhiều vitamin B1, B6, B12, PP, là thành phần của hệ enzyme xúc tác nhiều phản ứng quan trọng của cơ thể

Nhu cầu ni- tơ ở tảo có thể dao động từ 1-10% và có sự khác nhau ở các nhóm tảo Nhu cầu ni- tơ cao nhất ở tảo lục, kế đến là tảo lam và thấp nhất là tảo silic Theo Mudresop(1995) (trích theo Hoàng Thị Bích Mai, 1995) ở tảo lục với cường độ ánh sáng là 2000lux thì phát triển tốt ở hàm lượng đạm là 57mg/L Nhu cầu ni- tơ còn thay đổi trong nội bộ loài tùy thuộc vào nguồn cung cấp và hàm lượng ni- tơ có sẵn trong nước nuôi, các phản ứng đặc trưng đối với sự giảm ni- tơ

là sự mất màu của tế bào (giảm và teo Chlorophyll và Cartenoid) và sự tích lũy các hợp chất hữu cơ như các loại lipid (Hầu hết các loại tảo có khả năng sử dụng nguồn ni- tơ dưới 3 dạng là amonium (NH4+), nitrate (NO-3), nitrite (NO-2) nhưng đạm amonia dễ hấp thu hơn cả (Muzapharow, Taybaer, 1975) Ni- tơ muốn vào tế bào tảo cần chuyển hóa đạm amonia theo sơ đồ sau:

NO-3 => NO-2 + H2O => NH4OH => NH4+

 Photpho

Tuy nhu cầu của photpho ít hơn rất nhiều so với ni- tơ nhưng nó đóng một vai trò rất quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển của tảo Photpho tham gia vào việc hình thành nên nhiều hợp chất hữu cơ có vai trò cấu trúc hoặc trao đổi chất,

là chất không thể thiếu trong các khâu chuyển hóa trung gian và có ý nghĩa then chốt trong trao đổi năng lượng Ngoài ra photpho còn ảnh hưởng đến tỉ lệ thành phần các acid béo không no Theo Hari Son và cộng sự, 1990, khi giảm hàm lượng

photpho trong môi trường nuôi Nannochloropsis oculata gây ra giảm thành phần

acid béo mạch dài đa nối đôi như 20:5ω và 26:3ω Tảo lục có nhu cầu photpho cao,

khoảng 0,1-0,3mg/L, ở hàm lượng 0,005mg/L tảo phát triển rất yếu

[17] Ngưỡng cacbonic trong môi trường nuôi từ 5-10% không làm tăng năng suất của tảo nuôi nữa (Muzapharov và Taybarv, 1974)

 Các yếu tố dinh dưỡng khác

Có khoảng 30 nguyên tố và nhiều hợp chất hữu cơ có thể làm chất dinh dưỡng cho

tảo

Ngoài các nguyên tố quan trọng như C,N, P còn có các nguyên tố khác như S,

K, Na, Fe, Mg, Ca và các nguyên tố vi lượng như Mn, Zn, Mo, Co, V, Se Những nguyên tố này nằm trong thành phần cơ bản của tảo Trong đó Fe là thành phần nguyên tố vi lượng bổ sung nhiều nhất so với các loại khác Là tác nhân hỗ trợ hoặc

là thành phần xây dựng hệ enzym, tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử, quá trình phân ly nước và phosphoril hóa tổng hợp Bổ sung các loại vitamin làm tăng khả năng phát triển của tảo Các loại vitamin chủ yếu là B1, B6, B12, vitamin C

Ngoài ra, quá trình sinh trưởng của tảo còn phụ thuộc vào thể tích nuôi và mật độ nuôi Mật độ nuôi thấp quá thì tảo sinh trưởng chậm và có thể chết Ngược lại, nếu mật độ nuôi lớn thì thời gian đạt cực đại sẽ nhanh và thời gian tàn lụi cũng rất nhanh

1.2 Vài nét về tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo

1.2.1 Tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo trên thế giới

Theo Hans R và Robert A (2005), môi trường và phương pháp nuôi cấy tảo được ngiên cứu từ những năm 1800-1900 Vào thế kỉ 19-20 có khá nhiều công trình nghiên cứu vi tảo được công bố trên thế giới, song các công trình này chủ yếu chỉ

đề cập đến phương pháp nuôi cấy vi tảo mà chưa đề cập đến phương pháp phân lập

và lưu giữ giống tảo như thế nào, đặc biệt là các loài tảo sống ở đáy Mặc dù vậy, có thể đề cập đến một số công trình nghiên cứu sau:

Người đầu tiên tiến hành phân lập tảo thành công phải kể đến Beijerinck

(1890) với công trình phân lập tảo Chlorella, Scenedesmus và một số loài tảo vùng Trebauxia Ngoài ra Beijerinck còn nuôi thuần chủng tảo lam Anabana

Năm 1890 Miquel đã pha loãng tảo tạp trong các môi trường khác nhau để phân lập tảo silic

Ferdinnard Cohn tuy không thành công trong việc phân lập tảo lục đơn bào

Hamatococcus nhưng cũng đã lưu giữ thành công loài tảo này

Năm 1894, Krijger đã phân lập thành công quần lạc tảo lục gồm Prototheca,

Chlorella trên bề mặt thạch

Zumstein (1900) cũng đã phân lập được loài tảo mắt Euglena gracillis bằng

pipet, phương pháp này được nghiên cứu và cải tiến dần trong quá trình phát triển của lịch sử

Năm 1997, Comtois đã phân lập và nuôi thuần chủng được một số loài tảo silic bằng phương pháp nhặt tế bào bằng micropopipette

Năm 1896-1898, Klebs đã phân lập được tảo trong đĩa petri có agar hay gelatin cho dù tảo còn bị nhiễn khuẩn

Năm 1900, Winkler đã tiến hành thu mẫu tảo nước ngọt xung quanh nhà ông

và đã thuần chủng được một số loài nước ngọt bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch Đồng thời, ông cũng tìm ra được môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của chúng và nuôi ở các thể tích khác nhau (1-5L)

Tại Trung Quốc, nghiên cứu tảo nuôi được bắt đầu từ năm 1940 Guo và ctv

đã phân lập và nuôi 2 loài tảo đơn bào Tetraselmis sp và Dunaliella sp [16].

Năm 2007, trường đại học Murdoch (Úc) đã sử dụng 4 phương pháp phân lập tảo (phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường thạch, dùng micropipet

và phương pháp làm giàu)

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 300-400 loài vi tảo được phân lập, lưu giữ

và nuôi sinh khối nhằm nhiều mục đích khác nhau như y học, công nghiệp thực phẩm, nuôi trồng thủy sản và một số ngành khác

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, lịch sử phát triển của quá trình nuôi tảo song hành cùng với quá

trình phát triển của nghề nuôi trồng thủy sản Tảo Chlorella sp ở Việt Nam cũng

được nghiên cứu tương đối sớm tuy nhiên những công trình này chủ yếu về nuôi

sinh khối, về phân lập và lưu giữ còn ít Đầu những năm Chlorella sp được nhập nội

nghiên cứu và bắt đầu được ứng dụng Cố GS Nguyễn Hữu Thước cùng các cộng

sự đã tiến hành nhiều thí nghiệm nuôi tảo và sử dụng sinh khối Chlorella sp bổ sung

vào thức ăn cho một số loài gia cầm và kính thích sinh trưởng của con tằm

Năm 1974, khoa Nuôi trồng thủy sản– Đại học Nha Trang đã nghiên cứu và

nuôi sinh khối ngoài trời một số tảo Lục (Chlorella), tảo Silic (Skeletonema) làm

thức ăn cho động vật nổi, thức ăn cho ấu trùng tôm, cá biển

Theo Lê Viễn Chí và cộng sự 1994, Viện nghiên cứu Hải Sản Hải Phòng đã

lưu giữ và nuôi trồng đại trà một số loài tảo Silic trung tâm Chaetoceros calcitrans

và tảo Lục Chlamydomonas sp làm thức ăn cho ấu trùng điệp quạt

Năm 1995, Hoàng Thị Bích Mai đã thiết lập môi trường dinh dưỡng THO4

dùng để phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối một số tảo lục đơn bào như Chlorella sp,

Scensemus sp, Chlamydomonas sp

Riêng Chlorella sp vài năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu có đề

cập đến việc phân lập và lưu giữ giống tảo như của Trần Thị Thanh Nga (2005), Vũ Thị Thùy Minh (2006) Đặc biệt là công trình nghiên cứu của Trần Thị Thanh Nga

đã mô tả khá chi tiết về các thao tác cũng như kết quả của hai phương pháp pha loãng và cấy trên môi trường đặc Cả 2 tác giả đã đi đến kết luận chung là phân lập

Chlorella sp bằng môi trường pha loãng cho kết quả kém hơn so với nuôi cấy trên

môi trường đặc

Ở Việt Nam, các loài tảo dùng làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản chủ yếu được nhập giống thuần chủng từ nước ngoài và được lưu giữ trong phòng thí nghiệm Hiện nay, một số loài đã bị nhiễm tạp, nhiễm khuẩn hoặc thoái hóa do đó việc phân lập và lưu giữ các giống tảo thuần chủng để chủ động trong sản xuất là rất cần thiết

1.3 Vai trò của vi tảo trong nuôi trồng thủy sản

1.3.1 Vai trò của thực vật phù du trong ao nuôi trồng thủy sản

- Cung cấp thức ăn tự nhiên: trong các ao nuôi trồng thủy sản quảng canh thì thực vật phù du là cơ sở thức ăn để tạo ra sinh khối vật nuôi

- Tạo sinh cảnh thích hợp cho sự tồn tại và phát triển của tôm cá nuôi Vi tảo che sự chiếu sáng trực tiếp của ánh sáng mặt trời lên tôm cá nuôi giúp chúng

giảm stress, ngăn cản sự phát triển của tảo đáy, làm giảm sự thay đổi nhiệt độ nước trong ao nuôi theo biến động nhiệt của môi trường không khí

- Cung cấp oxi: là nguồn chính cung cấp oxi cho tôm cá nuôi Hơn 80% lượng oxi cung cấp cho ao nuôi là từ sự quang hợp của thực vật phù du

- Làm thay đổi hàm lượng CO2 trong nước ao nuôi từ đó làm thay đổi giá trị

pH theo thời gian trong ngày

tỉ lệ sống của ấu trùng cũng như con giống động vật thủy sản Phân tích 40 loài tảo thuộc 7 lớp (Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, Eustigmatophyceae, Rhodophyceae, Prasinophyceae) Brown & ctv (1997) đã xác định được thành phần protein rất cao trong tảo đơn bào, có thể chiếm tới 52% khối lượng cơ thể Các acid béo không no mạch dài (PUFA và HUFA) có trong tảo như docosahecxanoic (DHA), eicosapentanoic (EPA), arachidonic (AA) rất cần thiết cho

sự sinh trưởng, phát triển và nâng cao sức đề kháng của động vật nuôi thủy sản Theo Nguyễn Thị Xuân Thu (2004) thì hầu hết các loài tảo đều chứa các loại acid béo không no EPA ở mức độ trung bình đến cao (7- 34%) Lớp tảo

Eustisgmatophyceae (Nannochloropsis) rất giàu một hoặc cả hai loại acid béo

không no DHA và EPA Những loại vitamine chính trong vi tảo bao gồm : thiamin (B1), riboflavin (B2), pyridoxine (B6), cyanocobalamin (B12), vitamin C, pyridoxyl

phosphat và các loại vitamin tan trong dầu như A, D, E, K Các loại vi tảo đang được nuôi chứa hầu hết các loại vitamin với liều lượng đáp ứng được yêu cầu của đối tượng nuôi

Bảng 1.4: Các loại vitamin có trong vi tảo biển [16]

Nhu cầu của đối tượng nuôi

Bảng 1.5: Các lớp và chi tảo được nuôi trồng để làm thức ăn cho động vật

thủy sinh [17]

Bacillariophyceae

Skeletonema Thalassiosira Phaeodactylum Chaetoceros Nitzchia và cyclotella

Dunaliella Chlammydomonas Chlorella

Scendesmus Nannochloris

Ghi chú: PL- ấu trùng tôm, BL- ấu trùng nhuyễn thể hai mảnh vỏ, ML- ấu

trùng tôm nước ngọt, PB- hậu ấu trùng hai mảnh vỏ, AL- ấu trùng bào ngư, MR- Brachionus, BS- Artemia, SC- Saltwater copepoda, FZ- phù du động vật nước ngọt

Đối với cá biển, ngoài yêu cầu về vi tảo để nuôi hoặc làm giàu các sinh vật

nuôi sống như artemia và luân trùng, tảo thường được sử dụng trực tiếp trong các

bể ương nuôi ấu trùng cá biển “Kĩ thuật nước xanh” là một phần kĩ thuật được áp

dụng phổ biến để nuôi ấu trùng cá tráp đầu vàng Sparus aurata (50000 tế bào/ mL tảo Isochrysis sp + 400000 tb/mL tảo Chlorella sp mỗi ngày)

Theo Coutteau (1996), ảnh hưởng của vi tảo trong bể nuôi ấu trùng cá biển hiện nay vẫn chưa được hiểu đầy đủ, tuy nhiên người ta cũng đã tìm thấy một số ảnh hưởng:

- Ổn định chất lượng nước trong các hệ thống nuôi tĩnh (lấy đi các sản phẩm chuyển hóa phụ, sản sinh oxi)

- Là nguồn thức ăn trực tiếp thông qua sự hấp thụ tích cực của ấu trùng cùng với các polysacarit có ở các vách tế bào làm kích thích hệ thống miễn dịch không đặc trưng ở các ấu trùng

- Là nguồn dinh dưỡng gián tiếp cho ấu trùng cá thông qua thức ăn sống (bằng cách duy trì giá trị dinh dưỡng của các sinh vật sống trong bể)

- Làm tăng số lần ăn bằng việc tăng cường sự tương phản thị giác và sự tán

Bảng 1.6: Ước tính sản lượng sinh khối tảo theo khối lượng khô cho nhu cầu nuôi ấu trùng và hậu ấu trùng của NTTS thế giới năm 1999 [9]

Thân mềm

ăn lọc

Tôm nước trong

Tôm nước xanh

Nhu cầu vi tảo (kg

khối lượng khô/106

hậu AT)

Nhu cầu vi tảo (kg

Sản lượng tảo (tấn

sản lượng

Tăng mạnh

1.3.3 Tác hại do vi tảo gây ra

Bên cạnh những mặt có lợi thì vi tảo cũng gây ra một số tác hại Khi tảo phát triển quá mạnh làm tăng lượng có mặt của chúng trong nước dẫn đến hiên tượng

“nở hoa” trong ao, lúc này nguồn nước trong ao sẽ bị ô nhiễm nặng gây hại cho các đối tượng nuôi Sự phát triển của tảo quá mức còn dẫn đến sự thiếu hụt oxy vào ban đêm do sự hô hấp của chúng và sự biến động pH của chúng dẫn đến tăng tác động độc hại của NH3 và H2S Điều này có thể dẫn đến làm chết hàng loạt các đối tượng nuôi nếu chúng ta không có biện pháp khắc phục kịp thời

Để đánh giá tác hại do chúng gây ra chúng ta không thể không kể đến những loài tảo độc và sản phẩm của chúng Theo Goooorrynova và Demina (1974) (trích

Trần Văn Vĩ, 1995) đã thống kê ra 24 loài tảo độc thuộc 4 ngành tảo Đại diện trong

số đó là các loài thuộc ngành tảo Lam và tảo Giáp Khi chết độc tố của chúng sẽ thải ra ngoài môi trường làm chết đối tượng nuôi Ngoài ra một số tảo có đời sống

bám như tảo Silic: Odontella, Rhizosolenia đã sống bám trên mang tôm gây bệnh

đen mang

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Tảo lục nước mặn Chlorella sp

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Từ 16/2/2012 – 16/4/2012

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Trại sản xuất giống cá biển Gành Son- Tuy Phong- Bình Thuận

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Lưu giữ trong điều kiện dịch nuôi dạng lỏng

Điều kiện lưu giữ thích hợp

Nhân sinh khối, kiểm tra các chỉ tiêu để đánh giá các điều kiện

lưu giữ

Lưu giữ trong điều kiện dịch nuôi dạng bán lỏng

Kết luận và đề xuất ý kiến

Nhân sinh khối Tảo giống

Phân lập bằng phương pháp trên môi trường đặc

(thạch)