các yếu tố môi trường nuôi
2.3.9.1. Đếm tế bào
- Lấy mẫu tảo: định kì lấy mẫu tảo 1 ngày 1 lần vào lúc 8h sáng. Cố định mẫu bằng dung dịch formalin 2%.
- Phương pháp xác định mật độ tế bào: sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer. Buồng đếm có 16 ô vuông lớn, mỗi ô lớn có 25 ô nhỏ, kích thước các ô lớn độ sâu 0,1mm, thể tích 0,0025m2. mật độ tảo được tính theo công thức sau:
+ Đối với mật độ tảo quá dày thì chỉ đếm 5 ô lớn Mật độ tảo (tb/mL) = số tế bào ở 5 ô x 5 x 104 + Nếu mật độ tảo quá thưa thì đếm cả 25 ô lớn Mật độ tảo (tb/mL) = số tế bào đếm được x 104
2.3.9.2. Công thức xác định tốc độ sinh trưởng hằng ngày
µ = ln(N2/N1)/(T1-T2)
Trong đó:
µ là tốc độ sinh trưởng hằng ngày N1 là mật độ tế bào ở thời điểm T1 N2 là mật độ tế bào ở thời điểm T2
2.3.9.3. Kiểm tra các yếu tố môi trường
- Nhiệt độ: dùng nhiệt kế
- Độ mặn: khúc xạ kế Refractometer cầm tay, độ chính xác 1‰ - Cường độ ánh sáng: máy đo cường độ ánh sáng cầm tay
2.3.9.4. Xử lý số liệu
Các số liệu thu được sẽ được xử lý và kiểm định bằng phần mềm excel, và
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập tảo Chlorella sp trên môi trường thạch
Sau 4-5 ngày tiến hành phân lập tảo Chlorella sp từ nguồn tảo của công ty
Toàn Hưng, quan sát trên môi trường thạch thấy xuất hiện một số ít quần lạc tảo màu vàng xanh mọc rải rác, bên cạnh đó ta còn quan sát được tảo có dạng váng rải rác trên bề mặt thạch. Ngoài ra trên một số đĩa thạch còn xuất hiện quần lạc tảo tròn.
Do agar được dùng trong quá trình phân lập là agar chuyên dùng cho nuôi cấy tảo (bacter agar) nên chất lượng rất tốt.
Quan sát trên kính hiển vi ta thấy đại đa số quần lạc tảo mọc trên bề mặt thạch là Chlorella sp.
Sau khi đã lấy được quần lạc tảo Chlorella sp đang phát triển, đem hòa tan vào trong các ống nghiệm (có nút bông để hạn chế sự xâm nhập của vi khuẩn) chứa
9mL nước biển đã được hấp tiệt trùng (có bổ sung môi trường dinh dưỡng F2). Sau 4 ngày tảo phát triển, dịch tảo có màu xanh hơi vàng. Tiến hành kiểm tra độ thuần chủng của tảo. Tuy nhiên trong quá trình phân lập còn bị nhiễm khuẩn, nhiễm tạp
do đó tôi tiến hành phân lập lại lần thứ hai với nguồn tảo lấy từ lần phân lập thứ
nhất. Kiểm tra để xác định tảo Chlorella sp trên đĩa thạch đã phân lập lần thứ nhất,
sau đó cấy lại trên đĩa thạch lần thứ hai bằng phương pháp ria.
Kết quả phân lập tảo Chlorella sp bằng phương pháp nuôi cấy trên môi
trường thạch ở môi trường dinh dưỡng F2 được thể hiện qua Bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1: Độ thuần chủng của Chlorella sp (%) bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch
Cấy lần đầu Cấy lần sau
Hình 3.1: Quần lạc tảo Chlorella sp mọc trên môi trường thạch
Qua bảng số liệu trên ta thấy độ thuần chủng của tảo Chlorela sp được phân lập đạt kết quả khá cao. Theo tôi điều đó là do chất lượng agar tốt, nguồn tảo sử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dụng trong quá trình phân lập không phải là tảo tạp nên đã đạt được độ thuần chủng nhất định. Tuy nhiên độ thuần chủng của tảo Chlorella sp trong quá trình phân lập
không đạt được 100% do môi trường dinh dưỡng ta sử dụng là F2, là môi trường
dinh dưỡng chung, phù hợp với nhiều loài tảo khác nhau nên không thu được tảo
Chlorella sp thuần chủng tuyệt đối.
Phân lập tảo trên môi trường thạch đòi hỏi kĩ thuật phức tạp hơn so với
phương pháp pha loãng, quá trình thao tác dễ bị nhiễm tạp, nhiễm khuẩn nhưng thời
gian để thu được tảo thuần chủng tương đối ngắn (khoảng 10 ngày). Hơn nữa từ
một đĩa thạch mà tảo phát triển tốt có thể sử dụng để cấy vào rất nhiều ống nghiệm và thời gian để lưu giữ tảo trên đĩa thạch lâu hơn nhiều so với việc lưu giữ dịch tảo.
Đối với tảo Chlorella sp thì phân lập thuần chủng tảo này trên đĩa thạch là rất hiệu quả. Điều này là do Chlorella sp có khả năng thích ứng rộng và môi trường thạch không phải là điều kiện lí tưởng cho vi tảo sinh trưởng và phát triển mạnh, do đó
các loài tảo khó cạnh tranh được với Chlorella sp. Hơn nữa, cấu tạo của Chlorella sp không có phần phụ nên các thao tác như cấy tảo, tách quần lạc tảo ra khỏi đĩa
3.2. Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau
3.2.1. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ và nhiệt độ khác nhau 3.2.1.1. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt 3.2.1.1. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt
độ khác nhau
Khi tiến hành so sánh sự sinh trưởng của vi tảo Chlorella sp khi đưa ra nhân
sinh khối sau khi lưu giữở điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt độ khác nhau ta thấy có sự sai khác rất lớn. Điều này được thể hiện qua Bảng 3.2 và Hình 3.2
Bảng 3.2: Sinh trưởng của Chlorella sp khi đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu
giữ trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt độ khác nhau
Ghi chú: số liệu được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Các chữ
cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Ngày Lô 1 ( 5-6˚C) Lô 2 ( 15˚C ) Lô 3 ( 24˚C )
N µ N µ N µ 1 2,00 0,00 0,00 2,00 0,00 0,00 2,00 0,00 0,00 2 2,20 0,09b 0,095 2,02 0,035a 0,009 2,00 0,02a 0,00 3 2,5 0,01a 0,147 2,22 0,212a 0,094 2,18 0,036a 0,086 4 2,74 0,06c 0,072 2,36 0,04b 0,061 2,220,017a 0,018 5 3,1 0,03c 0,136 2,58 0,01b 0,089 1,88 0,02a - 0,166 6 3,66 0,05c 0,153 2,93 0,01b 0,127 1,58 0,02a - 0,174 7 4,55 0,01 0,218 3,23 0,23 0,097 _ _ 8 5,31 0,01 0,154 3,78 0,02 0,157 _ _ 9 6,71 0,03 0,234 4,20 0,10 0,105 _ _ 10 7,23 0,03 0,075 4,73 0,03 0,119 _ _ 11 5,33 0,00 - 0,230 4,52 0,02 - 0,045 _ _ 12 4,50 0,5 - 0,169 3,34 0,04 - 0,303 _ _ 13 4,00 0,003 - 0,118 2,00 0,10 - 0,513 _ _
Hình 3.2: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ
lỏng và nhiệt độ khác nhau
3.2.1.2. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏng và nhiệt độ khác nhau nhiệt độ khác nhau
Khi tiến hành so sánh sự sinh trưởng của vi tảo Chlorella sp khi đưa ra nhân
sinh khối sau khi lưu giữ ở điều kiện dịch lưu giữ bán lỏng và nhiệt độ khác nhau ta thấy có sự sai khác rất lớn. Điều này được thể hiện qua mật độ cực đại, thời gian đạt cực đại, pha cân bằng kéo dài cũng như tốc độ sinh trưởng hằng ngày.
Sinh trưởng của Chlorella sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở điều kiện dịch nuôi bán lỏng và nhiệt độ khác nhau.
Bảng 3.3: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ
bán lỏng và nhiệt độ khác nhau
Ghi chú: số liệu trên được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Các chữ cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngày Lô 1 (5-6˚C) Lô 2 (15˚C ) Lô 3 (24˚C)
N µ N µ N µ 1 2,0 0,00 0,00 2,00 0,00 0,00 2,00 0,00 0,00 2 2,17 0,017a 0,08 2,11 0,052a 0,05 2,13 0,017a 0,06 3 2,39 0,017b 0,10 2,32 0,006a 0,09 2,37 0,017ab 0,10 4 2,76 0,080a 0,14 2,64 0,075a 0,13 3,15 0,084b 0,28 5 3,66 0,023b 0,15 3,35 0,029a 0,24 3,92 0,012c 0,22 6 4,45 0,029b 0,20 3,83 0,098a 0,13 4,63 0,017b 0,17 7 5,37 0,017b 0,19 4,56 0,035a 0,17 5,47 0,348a 0,17 8 6,84 0,023c 0,24 5,69 0,006b 0,22 3,38 0,109a - 0,48 9 9,57 0,017c 0,34 6,73 0,017b 0,17 2,19 0,006a - 0,43 10 10,57 0,017c 0,10 4,89 0,127b - 0,32 2,08 0,012a - 0,05 11 11,330,185 0,07 4,14 0,179 - 0,16 _ _ 12 9,16 0,092 - 0,21 3,11 0,006 - 0,29 _ _ 13 8,32 0,017 - 0,10 2,09 0,006 - 0,39 _ _
Ảnh hưởng của nhiệt độ lưu trữ tới tốc độ sinh trưởng của Chlorella sp 0 2 4 6 8 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ngày m ậ t đ ộ ( 1 0 6 TB /m l) ( 5-6˚C) ( 15˚C ) ( 24˚C )
Hình 3.3: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏng và nhiệt độ khác nhau
Nhìn vào bảng số liệu trên ta thấy vi tảo lưu giữ ở nhiệt độ 5-6˚C có tốc độ tăng trưởng thể hiện qua mật độ cực đại, thời gian duy trì mật độ cực đại và tốc độ tăng trưởng hàng ngày cao hơn rất nhiều so với khi lưu giữở nhiệt độ 15˚C và 24˚C.
Cụ thể, ở nhiệt độ 5-6˚C thì mật độ cực đại của Chlorella sp là 11,33 0,185 (106TB/mL) trong khi ở nhiệt độ15˚C là 6,73 0,017 (106TB/mL) và 24˚C là 5,47
0,348 (106TB/mL). Tốc độ tăng trưởng hàng ngày ở lô 5-6˚C là 0,34, cao hơn nhiều so với 0,24 và 0,28 ở nhiệt độ 15˚C và 24˚C theo thứ tự. Hơn nữa, qua bảng số liệu
và đồ thị ở trên ta thấy thời gian tàn lụi của Chlorella sp khi đưa ra nhân sinh khối
sau khi lưu giữ ở 24˚C rất ngắn, mật độ đạt cực đại sau 7 ngày nuôi và đến ngày thứ 8 đã có dấu hiệu tàn lụi, thời gian tàn lụi rất nhanh. Trong khi đó, khi lưu giữ ở
nhiệt độ 5-6˚C, khi đưa ra nhân sinh khối thì thời gian duy trì mật độ cực đại là 4
ngày, đến ngày 13 mới bắt đầu xuất hiện dấu hiệu tàn lụi nhưng mật độ còn cao (8,32 0,017 triệu TB/mL).
Như vậy, khi so sánh cùng môi trường dinh dưỡng, cùng dịch lưu giữ nhưng
nhiệt độ lưu giữ khác nhau thì sự sinh trưởng của tảo khi nuôi sinh khối cũng có sự khác nhau. Điều này là do, khi lưu giữ ở nhiệt độ thấp (5-6˚C) thì Chlorella sp bị
kìm hãm, tảo sinh trưởng rất chậm, mật độ tảo hầu như không tăng lên, thậm chí còn giảm xuống một chút so với mật độ ban đầu, nên khi đưa ra nhân sinh khối gặp
điều kiện nhiệt độ thích hợp thì tảo phát triển tốt hơn. Ngược lại, ở 2 lô thí nghiệm 15˚C và 24˚C, tảo phát triển mạnh hơn nên dễ tàn lụi hơn và khi đưa ra nhân sinh
khối tảo không còn phát triển tốt nữa, điều này thể hiện ở việc tảo nhanh chóng bị
tàn lụi và mật độ cực đại khi đưa ra nuôi sinh khối.
Mặt khác, dịch lưu giữ cũng có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng của tảo Chlorella sp. Ở cùng nhiệt độ lưu giữ nhưng dịch lưu giữ khác nhau ta thu được kết quả có sự sai khác rất lớn. Ở nhiệt độ 5-6oC, mật độ cực đại khi lưu giữ ở dịch nuôi bán lỏng là 11,33 ± 0,185 (106TB/mL), trong khi lưu giữ ở dịch nuôi lỏng là 7,23 ± 0,044 (106 TB/mL). Ở nhiệt độ 15oC, mật độ tế bào lần lượt là 6,73 ± 0,017 (106 TB/mL) và 4,73 ± 0,114 (106 TB/mL) khi lưu giữ tảo ở dạng bán lỏng và lỏng theo thứ tự.
Điều này là do khi nhân sinh khối tảo ở bình 500mL ta tiến hành sục khí nên tảo bị nhiễm tạp, nhiễm khuẩn, độ thuần chủng của tảo bị giảm. Còn ở dịch lưu giữ dạng bán lỏng thì không sục khí mà lắc bằng tay, ngày 2 lần. Kết quả thu được trong thí nghiệm này hoàn toàn phù hợp với kết quả công bố của Nguyễn Thị Xuân Thu và ctv (2004) về các phương pháp lưu giữ thích hợp cho từng loài tảo.
Kết luận, nhiệt độ và dịch lưu giữ ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của tảo
Chlorella sp khi đưa ra nuôi sinh khối. Nhiệt độ lưu giữ thích hợp để đảm bảo sự sinh trưởng của Chlorella sp khi đưa ra nuôi sinh khối là 5-6˚C. Dịch lưu giữ thích hợp là bán lỏng. Do đó, khi đưa Chlorella sp vào lưu giữ ta tiến hành lưu giữ ở
nhiệt độ 5-6oC và dịch lưu giữ bán lỏng.
3.2.2. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong khoảng thời gian khác nhau
Ngoài các yếu tố như nhiệt độ, dạng dịch lưu giữ, thì thời gian lưu giữ cũng
là yếu tố không thể bỏ qua. Thời gian lưu giữ khác nhau có thể dẫn đến sự tăng trưởng khác nhau của các loại vi tảo khi đưa ra nhân sinh khối. Do đó, để xác định thời gian lưu giữ thích hợp, tôi đã tiến hành thí nghiệm lưu giữ tảo Chlorella sp
trong thời gian 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần với môi trường dinh dưỡng F2, nhiệt độ 5-6˚C
và dịch nuôi bán lỏng.
Sau khi lưu giữ xong 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần tôi tiến hành đưa các lô tảo
Chlorella sp này ra nhân sinh khối bình 500mL. Kết quả thu được về sự tăng trưởng của Chlorella sp được thể hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4: Sinh trưởng của Chlorella sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở khoảng thời gian khác nhau (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngày Lô 7 ( 2 tuần ) Lô 8 ( 4 tuần ) Lô 9 ( 6 tuần ) N µ N µ N µ 1 2,10 0,115 0,00 1,83 0,017 0,00 1,8 0,058 0,00 2 2,31 0,029b 0,10 2,1 0,035a 0,13 2,05 0,029a 0,13 3 2,78 0,000c 0,19 2,52 0,012b 0,18 2,29 0,012a 0,11 4 3,66 0,006c 0,28 3,16 0,000b 0,23 2,67 0,023a 0,15 5 4, 96 0,023c 0,30 3,82 0,012b 0,19 3,24 0,023a 0,19 6 6,57 0,017c 0,28 4,91 0,040b 0,25 3,88 0,012a 0,18 7 9,66 0,017c 0,34 5,98 0,052b 0,20 4,35 0,029a 0,11 8 12,9 0,012c 0,29 6,74 0,012b 0,12 5,11 0,052a 0,16 9 13,60,277c 0,05 7,12 0,012b 0,05 6,05 0,029a 0,17 10 12,5 0,113c - 0,08 8,160,023b 0,14 5,53 0,231a - 0,09 11 10,3 0,133c - 0,19 7,5 0,000b - 0,08 3,32 0,012a - 0,51 12 8,46 0,087c - 0,2 5,78 0,012b - 0,26 2,19 0,109a - 0,41 13 7,36 0,052c - 0,14 4,18 0,012b - 0,32 2,01 0,006a - 0,08 14 6,11 0,000 - 0,19 3,31 0,06 - 0,23 - -
Ghi chú: số liệu được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Các chữ
Ngày nuôi cấy 0 2 4 6 8 10 12 14 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M ậ t đ ộ ( 1 0 6 TB /m l) Lô 7 ( 2 tuần ) Lô 8 ( 4 tuần ) Lô 9 ( 6 tuần )
Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian lưu giữ tới tốc độ tăng trưởng của Chlorella sp
Qua bảng số liệu trên ta thấy sự sinh trưởng của tảo Chlorella sp ở lô thí nghiệm 2 tuần có sự sinh trưởng tốt hơn so với khi lưu giữở 4 tuần và 6 tuần. Điều này thể hiện qua hình dạng đường sinh trưởng, mật độ cực đại, thời gian duy trì cực
đại và tốc độ sinh trưởng hằng ngày.
Về mật độ cực đại: Ở 2 tuần là 13,60,277 (106 tb/mL) , ở 4 tuần là 8,160,023 (106 tb/mL) ở 6 tuần là 6,05 0,029 (106 tb/mL).
Về tốc độ sinh trưởng hàng ngày ở 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần lần lượt là 0,34; 0,25; 0,19. Thời gian duy trì mật độ cực đại khi lưu giữở 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần cùng
là 3 ngày nhưng chênh lệch về mật độ cực đại là rất lớn và sự tàn lụi ở lô 4 tuần, 6 tuần diễn ra rất nhanh, mật độ tế bào tảo suy giảm nhanh chóng.
Điều này là do trong cùng điều kiện lưu giữ về môi trường, nhiệt độ, dịch lưu
giữ nhưng khác nhau về thời gian lưu giữ thì sự ức chế về sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào tảo cũng khác nhau. Thời gian lưu giữ càng dài thì sự ức chế càng