2.3.1. Chuẩn bị dụng cụ
- Dụng cụ thu mẫu: lưới lọc.
- Dụng cụ chứa: Chai, lọ, can thủy tinh, nhựa có dung tích từ 0.5- 20L. - Các dụng cụ trong phân lập: Đĩa petri, ống nghiệm 30mL, lọ thủy tinh, bình nón. - Dụng cụ trong lưu giữ: các lọ thủy tinh có dung tích 150mL.
- Ngoài ra còn có các dụng cụ khác như: hệ thống kính hiển vi quang học, buồng đếm hồng cầu Neubauer, cân điện tử, lam, lamen, giá để ống nghiệm, pipet 0,5mL, 1mL, 5mL, 10mL, ống đong 250mL, que cấy, đũa khuấy thủy tinh.
2.3.2. Thiết bị phục vụ
- Toàn bộ các thí nghiệm được tiến hành trong phòng thí nghiệm nuôi cấy tảo của trại ương nuôi giống cá biển Gành Son– Tuy Phong– Bình Thuận. Nhiệt độ
phòng được duy trì ở khoảng 24-27ºC bằng hệ thống máy điều hòa. - Cường độ ánh sáng điều chỉnh bằng hệ thống đèn neon.
- Thiết bị phục vụ cho phân lập và lưu giữ còn có: Tủ nuôi cấy là tủ kính khung kim loại, bên trong có chia các ngăn và được bố trí hệ thống đèn neon và đèn
cựu tím. Có hệ thống giá kim loại phục vụ cho việc nhân sinh khối, ngoài ra còn có hệ thống tủ lạnh.
2.3.3. Nguồn nước
- Nước ngọt: nước ngọt đun sôi để nguội dùng để pha môi trường và nước giếng khoan dùng để pha độ mặn.
- Nước mặn: Nước biển được bơm lên bể chứa, để lắng, sau đó xử lý bằng chlorine nồng độ 25ppm, sục khí liên tục và phơi nắng, lọc qua tầng lọc cát, lưới lọc
25µm, túi lọc 1µm và cấp vào các lô thí nghiệm nuôi sinh khối ngoài trời.
Độ mặn môi trường nuôi: sử dụng nước có độ mặn 25‰. Nước mặn được pha theo quy tắc sau:
Công thức pha độ mặn: S1xV1=S2xV2
Trong đó: S1 là độ mặn của nước ban đầu V1 là thể tích của nước ban đầu
S2 là độ mặn của nước muốn có V2 là thể tích của nước muốn có
Nước đưa vào phòng thí nghiệm dùng trong việc lưu giữ giống và các thí nghiệm dùng các lọ thủy tinh có dung tích 500mL được tiệt trùng bằng máy hấp tiệt trùng (autoclave) ở 121ºC/ 30 phút.
2.3.4. Vô trùng các dụng cụ thí nghiệm
Các dụng cụ được sử dụng trong phòng thí nghiệm được vô trùng bằng máy hấp tiệt trùng (autoclave) ở 121ºC/ 30 phút.
Các bình nhựa, dây sục khí, đá bọt, sứđược tẩy trùng bằng chlorine 25ppm, rửa lại bằng nước cất, tráng qua cồn 90º.
2.3.5. Nguồn tảo
- Lấy từ tảo của công ty Toàn Hưng (Tp Nha Trang – Khánh Hòa), Viện Nghiên Cứu Nuôi trồng thủy sản III.
- Nhân sinh khối: cho tảo tạp vào bình nón 500mL với môi trường dinh
dưỡng F2 (Guillard, 1975), đặt nơi có điều kiện chiếu sáng tốt, nhiệt độ phòng thí nghiệm khoảng 24-27ºC, kiểm tra tảo hằng ngày, sau khoảng 4-5 ngày thấy tảo phát triển xanh màu thì tiến hành lấy tảo phân lập.
2.3.6. Môi trường dinh dưỡng trong các thí nghiệm
Sử dụng môi trường F2 (Guillard, 1975) [5]. Dung dịch 1: Các thành phần đa lượng.
Hóa chất Nồng độ (mg/L) KNO3 89,6 KH2PO4 5,6 Dung dịch 2: Các thành phần vi lượng. Hóa chất Nồng độ (mg/L) Na2EDTA 4,36 FeCl3.6H2O 3,15 CuSO4.5H2O 0,01 ZnSO4.7H2O 0,022 CoCl2.6H2O 0,01 MnCl2.4H2O 0,18
NaMoO4.2H2O 0,06 Dung dịch 3: Vitamin. Loại vitamin Nồng độ (mg/L) Thiamin (B) 0,1 Biotin (B6) 0,0005 Riboflavin (B12) 0,0005
Ghi chú: - Mỗi loại hóa chất trong dung dịch gốc, hàm lượng được tăng lên 1000 lần. - Sử dụng nước cất để nguội, pha riêng mỗi loại hóa chât.
- Cách dùng: lấy 1mL dung dịch 1 + 1mL dung dịch 2 + 1mL dung dịch 3 cho 1L nước nuôi tảo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.7. Bố trí thí nghiệm
2.3.7.1. Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch
- Chuẩn bị môi trường thạch : pha 15g agar với 1L nước biển 25‰ (đun sôi nước biển rồi thả agar vào, lắc cho agar tan đều rồi đưa đi hấp, sau đó để nguội agar
đến nhiệt độ khoảng 40-50ºC rồi cho môi trường dinh dưỡng vào theo tỉ lệ 1mL/1L. Lắc đều cho môi trường hòa tan vào agar rồi để khoảng 2-3 phút cho tan hết bọt rồi
đổ vào đĩa petri đã được khử trùng (10mL/đĩa).
- Khi thạch đông, nguội thì tiến hành cấy tảo. Cấy tảo theo 2 phương pháp là
ria hoặc trải.
- Băng kín đĩa petri bằng parafin rồi để trong tủ lạnh với nhiệt độ khoảng 22-23oC. - Sau 7-10 ngày thấy xuất hiện khuẩn lạc tảo màu xanh và nhiều khuẩn lạc khác trên bề mặt thạch. Dùng que cấy lấy các khuẩn lạc tảo màu xanh đem soi dưới kính hiển vi để xác định quần lạc tảo mình cần phân lập, dùng que cấy lấy các khuẩn lạc tảo đó ra rồi chuyển vào ống nghiệm đã có sẵn 9mL nước nuôi tảo.
- Lắc ống nghiệm ngày 2 lần, kiểm tra ống nghiệm hằng ngày. Khoảng 3-4 ngày, tảo trong ống nghiệm phát triển và có màu xanh, lấy mẫu tảo đem soi dưới kính hiển vi để xác định độ thuần chủng của tảo. Nếu tảo đạt độ thuần chủng từ 90- 95% thì tiến hành đưa tảo ra nhân sinh khối. Nếu độ thuần chủng thấp hơn thì tiến hành lặp lại thí nghiệm này.
- Xác định độ thuần chủng của tảo: đếm số tế bào tảo Chlorella sp trong tổng số các tế bào tảo có trong mẫu. Việc thu và đếm các tế bào tảo được tiến hành vào thời gian khoảng 5 ngày kể từ ngày lấy khuẩn lạc tảo trong đĩa petri đưa vào môi trường nuôi. - Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. - Điều kiện thí nghiệm : + Độ mặn: 25‰ + Nhiệt độ: 25-27ºC + Cường độ ánh sáng: 3000-4000lux
+ Thời gian chiếu sáng: 18h/ngày
2.3.7.2. Thí nghiệm xác định điều kiện lưu giữ tảo giống thích hợp
Bảng 2.1: Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ dạng
lỏng với nhiệt độ khác nhau
Lô thí nghiệm
Điều kiện lưu giữ
Lô 1 Lô 2 Lô 3
Nhiệt độ (ºC) 5-6 15 24
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Điều kiện lưu giữ:
- Mật độ lưu giữ: 2.0 x 106 (tb/mL) - Thời gian: 2 tuần
- Độ mặn: 25‰
- Môi trường dinh dưỡng: F2 - Dịch lưu giữ: bán lỏng
Bảng 2.2: Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ dạng
bán lỏng với nhiệt độ khác nhau
Lô thí nghiệm
Điều kiện lưu giữ
Lô 4 Lô 5 Lô 6
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Điều kiện lưu giữ: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mật độ lưu giữ: 2.0 x 106 (tb/mL) - Thời gian: 2 tuần
- Độ mặn: 25‰
- Môi trường dinh dưỡng: F2 - Dịch lưu giữ: lỏng
Bảng 2.3: Thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp
Lô thí nghiệm
Điều kiện lưu giữ
Lô 7 Lô 8 Lô 9
Thời gian (tuần) 2 4 6
Điều kiện lưu giữ: - Độ mặn: 25‰
- Môi trường dinh dưỡng: F2 - Dịch lưu giữ: bán lỏng - Nhiệt độ: 5-6ºC
2.3.8. Phương pháp nhân tảo giống
Tảo sau khi phân lập được nhân dần lên bằng những ống nghiệm 30mL đã
được khử trùng với môi trường nuôi phù hợp. Các ống nghiệm được đậy nút bông, chiếu sáng bằng đèn neon, nhiệt độ 24-25oC, lắc đảo hằng ngày. Sau 4-5 ngày khi tảo đã đậm màu, dịch tảo được nhân dần qua các lọ hình tam giác 125mL, 250mL, 500mL. Ở lọ 500mL tảo bắt đầu được suc khí (sục khí không được tiến hành ở các
giai đoạn sớm hơn để tảo hoàn toàn không bị nhiễm tạp). Ở mỗi bước tiến hành tảo
đều được kiểm tra sự phát triển và mức độ nhiễm tạp. Sau đó tảo được tiến hành nhân sinh khối ở các bình có thể tích 500mL, 5L, 20L để kiểm tra sự phát triển của tảo.
2.3.9. Phương pháp xác định mật độ tế bào, tốc độ sinh trưởng hằng ngày và các yếu tố môi trường nuôi các yếu tố môi trường nuôi
2.3.9.1. Đếm tế bào
- Lấy mẫu tảo: định kì lấy mẫu tảo 1 ngày 1 lần vào lúc 8h sáng. Cố định mẫu bằng dung dịch formalin 2%.
- Phương pháp xác định mật độ tế bào: sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer. Buồng đếm có 16 ô vuông lớn, mỗi ô lớn có 25 ô nhỏ, kích thước các ô lớn độ sâu 0,1mm, thể tích 0,0025m2. mật độ tảo được tính theo công thức sau:
+ Đối với mật độ tảo quá dày thì chỉ đếm 5 ô lớn Mật độ tảo (tb/mL) = số tế bào ở 5 ô x 5 x 104 + Nếu mật độ tảo quá thưa thì đếm cả 25 ô lớn Mật độ tảo (tb/mL) = số tế bào đếm được x 104
2.3.9.2. Công thức xác định tốc độ sinh trưởng hằng ngày
µ = ln(N2/N1)/(T1-T2)
Trong đó:
µ là tốc độ sinh trưởng hằng ngày N1 là mật độ tế bào ở thời điểm T1 N2 là mật độ tế bào ở thời điểm T2
2.3.9.3. Kiểm tra các yếu tố môi trường
- Nhiệt độ: dùng nhiệt kế
- Độ mặn: khúc xạ kế Refractometer cầm tay, độ chính xác 1‰ - Cường độ ánh sáng: máy đo cường độ ánh sáng cầm tay
2.3.9.4. Xử lý số liệu
Các số liệu thu được sẽ được xử lý và kiểm định bằng phần mềm excel, và (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập tảo Chlorella sp trên môi trường thạch
Sau 4-5 ngày tiến hành phân lập tảo Chlorella sp từ nguồn tảo của công ty
Toàn Hưng, quan sát trên môi trường thạch thấy xuất hiện một số ít quần lạc tảo màu vàng xanh mọc rải rác, bên cạnh đó ta còn quan sát được tảo có dạng váng rải rác trên bề mặt thạch. Ngoài ra trên một số đĩa thạch còn xuất hiện quần lạc tảo tròn.
Do agar được dùng trong quá trình phân lập là agar chuyên dùng cho nuôi cấy tảo (bacter agar) nên chất lượng rất tốt.
Quan sát trên kính hiển vi ta thấy đại đa số quần lạc tảo mọc trên bề mặt thạch là Chlorella sp.
Sau khi đã lấy được quần lạc tảo Chlorella sp đang phát triển, đem hòa tan vào trong các ống nghiệm (có nút bông để hạn chế sự xâm nhập của vi khuẩn) chứa
9mL nước biển đã được hấp tiệt trùng (có bổ sung môi trường dinh dưỡng F2). Sau 4 ngày tảo phát triển, dịch tảo có màu xanh hơi vàng. Tiến hành kiểm tra độ thuần chủng của tảo. Tuy nhiên trong quá trình phân lập còn bị nhiễm khuẩn, nhiễm tạp
do đó tôi tiến hành phân lập lại lần thứ hai với nguồn tảo lấy từ lần phân lập thứ
nhất. Kiểm tra để xác định tảo Chlorella sp trên đĩa thạch đã phân lập lần thứ nhất,
sau đó cấy lại trên đĩa thạch lần thứ hai bằng phương pháp ria.
Kết quả phân lập tảo Chlorella sp bằng phương pháp nuôi cấy trên môi
trường thạch ở môi trường dinh dưỡng F2 được thể hiện qua Bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1: Độ thuần chủng của Chlorella sp (%) bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch
Cấy lần đầu Cấy lần sau
Hình 3.1: Quần lạc tảo Chlorella sp mọc trên môi trường thạch
Qua bảng số liệu trên ta thấy độ thuần chủng của tảo Chlorela sp được phân lập đạt kết quả khá cao. Theo tôi điều đó là do chất lượng agar tốt, nguồn tảo sử
dụng trong quá trình phân lập không phải là tảo tạp nên đã đạt được độ thuần chủng nhất định. Tuy nhiên độ thuần chủng của tảo Chlorella sp trong quá trình phân lập
không đạt được 100% do môi trường dinh dưỡng ta sử dụng là F2, là môi trường
dinh dưỡng chung, phù hợp với nhiều loài tảo khác nhau nên không thu được tảo
Chlorella sp thuần chủng tuyệt đối.
Phân lập tảo trên môi trường thạch đòi hỏi kĩ thuật phức tạp hơn so với
phương pháp pha loãng, quá trình thao tác dễ bị nhiễm tạp, nhiễm khuẩn nhưng thời
gian để thu được tảo thuần chủng tương đối ngắn (khoảng 10 ngày). Hơn nữa từ
một đĩa thạch mà tảo phát triển tốt có thể sử dụng để cấy vào rất nhiều ống nghiệm và thời gian để lưu giữ tảo trên đĩa thạch lâu hơn nhiều so với việc lưu giữ dịch tảo.
Đối với tảo Chlorella sp thì phân lập thuần chủng tảo này trên đĩa thạch là rất hiệu quả. Điều này là do Chlorella sp có khả năng thích ứng rộng và môi trường thạch không phải là điều kiện lí tưởng cho vi tảo sinh trưởng và phát triển mạnh, do đó
các loài tảo khó cạnh tranh được với Chlorella sp. Hơn nữa, cấu tạo của Chlorella sp không có phần phụ nên các thao tác như cấy tảo, tách quần lạc tảo ra khỏi đĩa
3.2. Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau
3.2.1. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ và nhiệt độ khác nhau 3.2.1.1. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt 3.2.1.1. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt
độ khác nhau (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi tiến hành so sánh sự sinh trưởng của vi tảo Chlorella sp khi đưa ra nhân
sinh khối sau khi lưu giữở điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt độ khác nhau ta thấy có sự sai khác rất lớn. Điều này được thể hiện qua Bảng 3.2 và Hình 3.2
Bảng 3.2: Sinh trưởng của Chlorella sp khi đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu
giữ trong điều kiện dịch lưu giữ lỏng và nhiệt độ khác nhau
Ghi chú: số liệu được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Các chữ
cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Ngày Lô 1 ( 5-6˚C) Lô 2 ( 15˚C ) Lô 3 ( 24˚C )
N µ N µ N µ 1 2,00 0,00 0,00 2,00 0,00 0,00 2,00 0,00 0,00 2 2,20 0,09b 0,095 2,02 0,035a 0,009 2,00 0,02a 0,00 3 2,5 0,01a 0,147 2,22 0,212a 0,094 2,18 0,036a 0,086 4 2,74 0,06c 0,072 2,36 0,04b 0,061 2,220,017a 0,018 5 3,1 0,03c 0,136 2,58 0,01b 0,089 1,88 0,02a - 0,166 6 3,66 0,05c 0,153 2,93 0,01b 0,127 1,58 0,02a - 0,174 7 4,55 0,01 0,218 3,23 0,23 0,097 _ _ 8 5,31 0,01 0,154 3,78 0,02 0,157 _ _ 9 6,71 0,03 0,234 4,20 0,10 0,105 _ _ 10 7,23 0,03 0,075 4,73 0,03 0,119 _ _ 11 5,33 0,00 - 0,230 4,52 0,02 - 0,045 _ _ 12 4,50 0,5 - 0,169 3,34 0,04 - 0,303 _ _ 13 4,00 0,003 - 0,118 2,00 0,10 - 0,513 _ _
Hình 3.2: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ
lỏng và nhiệt độ khác nhau
3.2.1.2. Lưu giữ tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ bán lỏng và nhiệt độ khác nhau nhiệt độ khác nhau
Khi tiến hành so sánh sự sinh trưởng của vi tảo Chlorella sp khi đưa ra nhân
sinh khối sau khi lưu giữ ở điều kiện dịch lưu giữ bán lỏng và nhiệt độ khác nhau ta thấy có sự sai khác rất lớn. Điều này được thể hiện qua mật độ cực đại, thời gian đạt cực đại, pha cân bằng kéo dài cũng như tốc độ sinh trưởng hằng ngày.
Sinh trưởng của Chlorella sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở điều kiện dịch nuôi bán lỏng và nhiệt độ khác nhau.
Bảng 3.3: Sự tăng trưởng của tảo Chlorella sp trong điều kiện dịch lưu giữ
bán lỏng và nhiệt độ khác nhau
Ghi chú: số liệu trên được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Các chữ cái viết kèm bên trên thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
Ngày Lô 1 (5-6˚C) Lô 2 (15˚C ) Lô 3 (24˚C)
N µ N µ N µ 1 2,0 0,00 0,00 2,00 0,00 0,00 2,00 0,00 0,00 2 2,17 0,017a 0,08 2,11 0,052a 0,05 2,13 0,017a 0,06 3 2,39 0,017b 0,10 2,32 0,006a 0,09 2,37 0,017ab 0,10 4 2,76 0,080a 0,14 2,64 0,075a 0,13 3,15 0,084b 0,28 5 3,66 0,023b 0,15 3,35 0,029a 0,24 3,92 0,012c 0,22 6 4,45 0,029b 0,20 3,83 0,098a 0,13 4,63 0,017b 0,17 7 5,37 0,017b 0,19 4,56 0,035a 0,17 5,47 0,348a 0,17 8 6,84 0,023c 0,24 5,69 0,006b 0,22 3,38 0,109a - 0,48 9 9,57 0,017c 0,34 6,73 0,017b 0,17 2,19 0,006a - 0,43