phân lập và lưu giữ tảo giống thuần chủng chlorella sp nước mặn làm thức ăn cho các đối tượng nuôi thủy sản

i Lời cảm ơn Với lòng biết ơn chân thành sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn tới:  Ban Chủ Nhiệm Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản – Trường Đại Học Nha Trang  Bộ môn Môi Trường Và Nguồn Lợi Thủy Sản, Bộ môn C ơ Sở Sinh Học Nghề Cá - Trường Đại Học Nha Trang.  Phòng thư viện Trường Đại Học Nha Trang.  Phòng vật tư và thiết bị - Trường Đại Học Nha Trang Đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi ho àn thành đề tài tốt nghiệp này. Đặc biệt cho tôi gửi lời cám ơn trực tiếp tới:  TS Hoàng Thị Bích Mai.  Ths. Bùi Bá Trung.  KS. Nguyễn Thị Thúy. Đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề t ài. Để Có được những thành công này, cho tôi g ửi lời cám ơn tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã ủng hộ, động viên giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn để ho àn thành tốt những mục tiêu đã đề ra. Một lần nữa tôi xin chân th ành cảm ơn Nha trang, tháng 11 năm 2008. SV: Mai Đức Thao ii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG v CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi Chương 1: MỞ ĐẦU 1 Chương 2: TỔNG LUẬN 4 2.1. Hệ thống phân loại v à đặc điểm sinh học Chlorella sp .4 2.1.1. Hệ thống phân loại 4 2.1.2. Một số đặc điểm sinh học chủ y ếu của tảo lục Chlorella sp (theo Đặng Đình Kim,1998) [2] 4 2.1.2.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Chlorella sp 4 2.1.2.2. Đặc điểm sinh trưởng 5 2.1.2.3. Đặc điểm sinh sản 6 2.1.2.4. Phân bố 7 2.1.3. Thành phần sinh hoá của vi tảo lục Chlorella sp 7 2.1.4. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của vi tảo 8 2.1.4.1. Ánh sáng 8 2.1.4.2. Nhiệt độ 10 2.1.4.3. Độ mặn 11 2.1.4.4. Ảnh hưởng của pH 11 2.1.4.5. Ảnh hưởng của hàm lượng khí Cacbonic (CO 2 ) 12 2.1.4.6. Ảnh hưởng của khuấy sục 13 2.1.4.7. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh d ưỡng 13 2.2. Vài nét về tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo 16 2.2.1. Phương pháp phân l ập tảo giống thuần chủng 16 2.2.2. Về vấn đề lưu giữ tảo giống thuần chủng 19 2.2.3. Môi trường dinh dưỡng sử dụng cho nuôi trồng Chlorella 21 2.3. Ứng dụng của vi tảo trong ng ành nuôi trồng thủy sản .22 2.3.1 Vai trò làm th ức ăn tươi sống 22 2.3.2. Xử lý môi trường nước và làm cân bằng hệ sinh thái 24 Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 27 3.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 27 3.1.1. Đối tượng 27 3.1.2. Thời gian 27 3.1.3. Địa điểm nghiên cứu 27 iii 3.2. Phương pháp nghiên c ứu 27 3.2.1. Sơ đồ khối nội dung nghi ên cứu 27 3.2.2. Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, n ước và môi trường thí nghiệm 30 3.2.3. Nguồn Tảo 32 3.2.4. Bố trí thí nghiệm 34 3.2.4.1. Thí nghiệm phân lập thuần chủng Chlorella sp 34 3.2.4.2. Thí nghiệm xác định điều kiện l ưu giữ thích hợp 38 3.2.2. Các phương pháp xác đ ịnh mật độ tế bào, tỷ lệ thuần chủng, tốc độ sinh trưởng hàng ngày và các yếu tố môi trường nuôi 41 3.2.5.1. Đếm tế bào 41 3.2.5.2. Phương pháp xác đ ịnh tỷ lệ thuần chủng trong các thí nghiệm phân lập Chlorella sp 42 3.2.5.3. Công thức xác định tốc độ sinh tr ưởng hàng ngày 43 3.2.5.4. Kiểm tra các yếu tố môi trường 43 Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44 4.1. Phân lập Chlorella sp thuần chủng bằng các ph ương pháp khác nhau 44 4.1.1. Phân lập bằng phương pháp pha loãng 44 4.1.2. Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc (thạch) 47 4.2. Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Đường cong sinh trưởng quần thể vi tảo. 6 Hình 3.1: Sơ đồ khối nội dung phân lập tảo giống thuần chủng Chlorella sp. 28 Hình 3.2: Sơ đồ khối nội dung lưu giữ tảo giống thuần chủng Chlorella sp. 29 Hình 3.3 Hình ảnh cân điện tử (trái) v à kính hiển vi (phải) phục 30 Hình 3.4: Cách pha độ mặn. 31 Hình 3.5 Hóa chất pha môi trường và môi trường 33 Hình 3.6: Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng. 36 Hình 3.7: Kỹ thuật phân lập Chlorella sp bằng phương 37 Hình 3.8: Lưu giữ Chlorella sp 38 Hình 3.9: Buồng đếm hồng cầu Neubauer. 42 Hình 4.1: Hình Chlorella sp trước và sau khi phân lập. 47 Hình 4.2: Quần lạc tảo mọc trên các đĩa thạch. 48 Hình 4.3: Kết quả phân lập Chorella sp thuần chủng bằng ph ương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc (ảnh được chụp dưới độ phóng đại 40×10 l ần). 49 Hình 4.4. Diễn biến mật độ tế b ào tảo Chlorella sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở các điều kiện khác nhau. 55 v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần sinh hoá của Chlorella sp. 8 Bảng 2.2: Môi trường tối ưu để nuôi một số lo ài tảo (Nguyễn Thị Xuân Thu v à ctv, 2004) [6] 9 Bảng 2.3: Các lớp v à các chi tảo được nuôi trồng để l àm thức ăn cho động vật thuỷ sinh (Đặng Đình Kim, 1998) [2]. 26 Bảng 3.1 Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch nuôi dạng lỏng với nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khác nhau 39 Bảng 3.2 Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch nuôi dạng bán lỏng với nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khác nhau. ……………39 Bảng 4.1: Mức độ thuần chủng (%) của tảo giống Chlorella sp nước mặn bằng phương pháp pha loãng: ……………44 Bảng 4.2. Độ thuần chủng của Chlorella sp (%) bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau. 49 Bảng 4. 3 Sinh trưởng của Chlorella sp (N×106 tb/mL) được đưa ra nuôi dinh khối sau khi lưu giữ ở các điều kiện khác nhau 53 vi CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ctv: cộng tác viên NTTS: nuôi trồng thủy sản tb/mL: tế bào/mL r: hệ số tương quan TN: thí nghiệm 1 Chương 1: MỞ ĐẦU Thập niên đầu tiên của thế kỷ 21 đã đánh dấu sự phát triển v ượt bậc của ngành thuỷ sản trong nước cũng như trên thế giới. Nó dần trở thành nền kinh tế mũi nhọn và được huy động mọi tiềm năng để phát triển , nhằm đóng góp có hiệu quả vào nền kinh tế quốc dân cũng nh ư nâng cao đời sống cho cộng đồng dân c ư. Song một điều dễ nhận thấy l à nguồn lợi tự nhiên về hải sản cũng như thuỷ sản nước ngọt không phải là vô hạn. Ngược lại, nó lại luôn có chiều h ướng suy giảm do khai thác quá mức và môi trường thì ngày càng ô nhiễm. Chính vì vậy nuôi trồng thuỷ sản sẽ nắm giữ một vai tr ò chủ đạo đưa ngành thuỷ sản tiếp tục phát triển bền vững trong tương lai. Song bên cạnh đó, ngành nuôi trồng thuỷ sản ở nước ta cũng như một số nước khác trong khu vực vẫn còn nhiều tồn tại cần sớm khắc phục nh ư: vấn đề con giống, môi trường, dịch bệnh …chỉ có khắc phục được những tồn tại đó mới có thể khai thác triệt để và hiệu quả những lợi ích kinh tế m à nuôi trồng thuỷ sản đem lại . Chung quy lại những tồn tại đó sẽ được khắc phục một phần rất đáng kể nếu giải quyết tốt vấn đề thức ăn . Sử dụng thức ăn tươi sống và đặc biệt là vi tảo hiện nay đang được coi là một trong những hướng ứng dụng có triển vọng nhất . Bởi lẽ, vi tảo nắm giữ nhiều lợi thế trong vai tr ò làm nguồn thức ăn cho các đối tượng nuôi thuỷ sản. Vi tảo không gây ô nhiễm môi trường nước, về khía cạch dinh dưỡng thì nó cung cấp đầy đủ các vitamin,chất khoáng, vi lượng, bên cạnh đó chúng còn chứa nhiều các acid béo không no. Từ đó sẽ cung cấp đầy đủ dưỡng chất, tăng sức đề kháng cho vật nuôi thuỷ sản. Ngoài ra, vi tảo còn có phổ kích thước rộng, phù hợp với cỡ mồi của nhiều đối tượng ở nhiều giai đoạn phát triển. Cũng chính vì vậy vi tảo (và đặc biệt là tảo đơn bào) đã càng khẳng định là thức ăn tươi sống tốt nhất cho nhiều động vật nuôi thuỷ sản, đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng và các động vật phù du. Đã có hàng trăm loài tảo được sử thử nghiệm làm thức ăn, nhưng cho đến nay chỉ có khoảng 20 loài tảo đơn bào được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản (Brown, 2002) [13], bởi lẽ tảo đơn bào có giá trị trong nuôi trồng thủy sản phải 2 có kích thước phù hợp (1 – 15 m cho những loài ăn lọc và 10 – 100 m cho những loài khác) và phải được tiêu hóa dễ dàng, không chứa các độc tố, cũng như dễ nuôi trồng… Và trong các loài tảo đó thì Chlorella là đại diện tiêu biểu nhất (trích theo Nguyễn Thị Xuân Thu và ctv, 2004) [6]. Cho đến nay, nguồn thức ăn là vi tảo còn gặp những khó khăn nhất định . Đại đa số các chủng vi tảo phải nhập nội , không phải những loài có nguồn gốc bản địa Việt Nam, hạn chế của các chủng này nằm ở chỗ điều kiện khí hậu ở n ước ta có nhiều điểm khác biệt so với điều kiện khí hậu ở một số n ước đồng thời không ho àn toàn chủ động về nguồn cung cấp, giá thành lại cao, dẫn tới hiệu quả của sản xuất kinh doanh giảm sút. Ngược lại, hầu hết những chủng vi tảo có nguồn gốc bản địa đang được sử dụng đều không thuần khiết , tạp và nhiễm khuẩn nhiều, kèm theo đó là ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta chưa có sự thống nhất chỉ đạo về các nguồn giống vi tảo, chưa có các bộ phận quản lý v à cung cấp giống chuẩn. Bên cạnh đó, các công trình nghiên c ứu trên tảo trong nước chủ yếu thiên về các kỹ thuật nuôi thu sinh khối mà các nghiên cứu, phân lập và lưu giữ các giống tảo thuần chủng c òn hạn chế cả về số lượng lẫn chất lượng. Để phần nào giải quyết những tồn tại trên, cũng như tạo thêm cơ sở cho nhiệm vụ điều tra, phân lập và lựa chọn những chủng vi tảo có giá trị , làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sả n và đồng thời là cơ sở giữ giống, cung cấp giống thuần cho các trại sản xuất, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Phân lập và lưu giữ tảo giống thuần chủng Chlorella sp nước mặn làm thức ăn cho các đối t ượng nuôi thủy sản ” Để góp phần hoàn thiện quy trình phân lập và lưu giữ thuần chủng Chlorella sp nước mặn chúng tôi tiến hành thực hiện 2 nội dung chính nh ư sau:  Phân lập Chlorella sp nước mặn bằng 2 ph ương pháp khác nhau (phương pháp pha loãng và phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch), trên 2 môi trường dinh dưỡng (F/2 và TH.04). 3  Lưu giữ Chlorella sp thuần chủng bằng 2 phương pháp (phương pháp lưu gi ữ trong môi trường lỏng và trong môi trường bán lỏng), trên 2 môi trường dinh dưỡng (là F/2 và TH.04), và ở 2 nhiệt độ khác nhau (nhiệt độ 7 – 8 0 C và 30 0 C. Đề tài có những mục tiêu sau:  Phân lập Chlorella sp nước mặn thuần chủng.  Xác định các điều kiện lưu giữ thích hợp nhất đối với lo ài. Đề tài có các ý nghĩa:  Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu các thông số khoa học ph ù hợp làm cơ sở khoa học xây dựng quy trình phân lập và lưu giữ tảo thuần chủng Chlorella sp nước mặn.  Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Góp phần vào việc tạo ra dòng tảo thuần chủng cung cấp giống cho các trại sản xuất , đồng thời lưu giữ giống Chlorella sp hiệu quả hơn. 4 Chương 2: TỔNG LUẬN 2.1. Hệ thống phân loại v à đặc điểm sinh học Chlorella sp 2.1.1. Hệ thống phân loại Theo Komapoenko và Vasilieva (người Nga), năm 1978 (trích theo Vũ Thị Thùy Minh, 2006) [12] thì vị trí phân loại của Chlorella sp được xác định như sau: Ngành: Chlorophyta Lớp: Protococcophyceae Bộ: Chlorococcales Họ: Oocystaceae Chi: Chlorella Loài: Chlorella sp 2.1.2. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo lục Chlorella sp (theo Đặng Đình Kim,1998) [2] 2.1.2.1. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Chlorella sp Tảo lục Chlorella sp hay được gọi là rong tiểu cầu, có cấu trúc cơ thể dạng monas đơn bào hình trứng, hình tròn hay hình ôvan. Đường kính tế bào không vượt quá 15m trung bình khoảng 5 – 10 m. Tế bào không có roi nên không có kh ả năng di động. Đa số tế bào có một nhân, nhân gồm có màng dịch nhân, hạch nhân và mạng lưới nhiễm sắc. Sắc tố quang hợp chỉ có một thể sắc tố chloroplast v à có dạng hình chén. Lục lạp được bao phủ bởi một lớp m àng mỏng kép, bên trong chứa dịch protein gọi là chất nền (matrix) và những cấu trúc dạng bản mỏng hay l à lamen. Lạp lục là nơi duy nhất trong tế bào tích lũy tinh bột, tinh bột tập trung xung quanh c ơ quan chuyên hóa đư ợc gọi là pyreoit hay hạt tạo bột. Chất dự trữ của vi tảo Chlorella sp là tinh bột. [...]... khối Phân lập Phân lập bằng phương pháp pha loãng Phân lập bằng phương pháp cấy trên môi trường đặc (thạch) Môi trường dinh dưỡng TH.04 Môi trường dinh dưỡng F/2 Tảo giống thuần chủng Phương pháp và môi trường dinh dưỡng thích hợp cho phân lập Chlorella sp Hình 3.1: Sơ đồ khối nội dung phân lập tảo giống thuần chủng Chlorella sp 29 Tảo thuần chủng Lưu giữ trong điều kiện dịch nuôi dạng lỏng Lưu giữ. .. lập và lưu giữ giống tảo 2.2.1 Phương pháp phân lập tảo giống thuần chủng Theo Hans R và Robert A, 2005 [16] thì môi trường nuôi và phương pháp nuôi được nghiên cứu và mô tả từ rất sớm, từ những năm 1800 – 1900 Và trong số đó thì Chlorella sp là một đại diện tiêu biểu nhất Nhìn chung, các công trình nghiên cứu vi tảo chủ yếu tập trung vào mô tả thu nuôi sinh khối mà ít đề cập đến phân lập thuần chủng. .. lịch sử phân lập giống tảo thuần chủng trên đối tượng Chlorella sp bởi Beijenck Ông đã giới thiệu kỹ thuật nuôi tảo trong môi tr ường hỗn hợp (nước muối, muối dinh dưỡng và gelatin) Sau đó 3 năm, (tức năm 1893) cùng với phương pháp đó của mình ông đã 17 phân lập thành công được 2 loài tảo lục (Chlorella và Scenedesmus) và một số loài tảo khác như tảo vàng Trebauxia, tảo lam Anabana… Nhà vi tảo học... – 6 0C khi tảo đạt gần mật độ tối đa Đây l à phương pháp tối ưu nhất cho hầu hết các loài tảo thời gian lưu giữ rất dài, 6- 8 tháng đối với các loài tảo Heterogloea sp, Chlorella sp, Nannochlorepsis oculata và 2 – 4 tháng với các loài trong giống tảo Chaetoceros Phương pháp lưu giữ tảo trong điều kiện môi tr ường bán lỏng, đặt ở điều kiện phòng thí nghiệm: Giống tảo thuần được nuôi trong các ống nghiệm... cứu phân lập tảo giống ở việt nam Kế đó phải kể đến công trình tương đối hoàn thiện của Nguyễn Thị Xuân Thu, Nguyễn Thị Bích Ngọc và Nguyễn Thị Hương (2004) [6] Trong công trình này, các tác giả đã mô tả khá đầy đủ và hoàn thiện quy trình sản xuất các vi tảo từ phân lập, lưu giữ và gây nuôi thu sinh khối Trong đó phương pháp pha loãng được sử dụng nhiều nhất cho phân lập và trên nhiều đối tượng như Chlorella. .. yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến kết quả l ưu giữ các giống tảo Và mỗi loài tảo khác nhau thì 20 thích hợp ở một điều kiện lưu giữ khác nhau Ở Việt Nam và trên đối tượng là Chlorella sp thì cũng chưa thấy công trình nào mô tả, cũng như rút ra kết luận một cách chi tiết vấn đề lưu giữ đối tượng này Phương pháp lưu giữ trên môi trường thạch: Lấy tảo giống thuần cấy trên bề mặt thạch Để trong điều kiện... nghề nuôi trồng thuỷ sản xét ở khía cạnh vi tảo là cần tạo ra các giống tảo thuần chủng có nguồn gốc bả n địa, chỉ có như vậy 11 mới đảm bảo được tính lâu dài và nâng cao hiệu quả sử dụng vi tảo cho nghề nuôi trồng thuỷ sản ở nước ta 2.1.4.3 Độ mặn Phổ chịu muối của tảo biển là rất lớn Tuy vậy, các loài tảo khác nhau thì khả năng thích nghi của chúng với các độ mặn cũng khác nhau Có những loài tảo. .. đặt vào tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 6 0C Phương pháp này thích hợp cho hầu hết các loài tảo đơn bào Thời gian lưu giữ ngắn, thường là chỉ vài ngày (với Skeletonema, Isochrysis), 2 – 3 tháng (với các loài tảo xanh), và 1 – 2 tháng đối với các loài tảo khuê Phương pháp lưu giữ tảo ở môi trường bán lỏng, nhiệt độ 5 – 6 0C, trong tối: Lấy tảo giống thuần đem nuôi trong ống nghiệm có đáy sạch Sau đem cất vào... hay phương pháp làm giàu Song, cho đến nay vẫn chưa thấy có công trình nào đạt kết quả cao công bố ở trong nước cũng như trên thế giới Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều loài tảo (300 – 400 loài) được phân lập, lưu giữ và nuôi thu sinh khối nhằm phục vụ nhiều lợi ích khác nhau, nh ưng chỉ có khoảng 40 – 50 loài vi tảo trong số đó được sử dụng làm thức ăn cho các đối tượng nuôi thủy sản (trích theo... và lưu giữ 2 loài tảo silic lông chim sống đáy là Navicula sp và Nizschia sp Với 2 phương pháp phân lập là pha loãng và nuôi cấy trên môi 18 trường đặc Kết quả cho thấy phân lập pha lo ãng 2 loài vi tảo này là đạt hiệu quả cao hơn so với phương pháp cấy trên môi trường đặc Riêng Chlorella sp vài năm trở lại đây đã có nhiều công trình nghiên cứu có đề cập đến công tác phân lập thuần chủng lo ài tảo này . sản xuất, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Phân lập và lưu giữ tảo giống thuần chủng Chlorella sp nước mặn làm thức ăn cho các đối t ượng nuôi thủy sản ” Để góp phần hoàn thiện quy trình phân lập. sở cho nhiệm vụ điều tra, phân lập và lựa chọn những chủng vi tảo có giá trị , làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sả n và đồng thời là cơ sở giữ giống, cung cấp giống thuần cho các. tố dinh d ưỡng 13 2.2. Vài nét về tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo 16 2.2.1. Phương pháp phân l ập tảo giống thuần chủng 16 2.2.2. Về vấn đề lưu giữ tảo giống thuần chủng 19 2.2.3. Môi trường