phân lập và lưu giữ tảo giống thuần chủng chlorella sp nước mặn làm thức ăn cho các đối tượng nuôi thủy sản

Độ thuần chủng của Chlorella sp % bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau.. Bên cạnh đó,các công trình nghiên c ứu trên tảo trong nước chủ y

TỔNG LUẬN

Hệ thống phân loại và đặc điểm sinh học Chlorella sp

Theo Komapoenko và Vasilieva (người Nga),năm 1978 (trích theo Vũ Thị Thùy Minh, 2006) [12] thì vị trí phân loại củaChlorella sp được xác định như sau:

2.1.2 Một số đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo lục Chlorella sp (theo Đặng Đình Kim,1998) [2]

2.1.2.1.Đặc điểm hình thái cấu tạo của Chlorella sp

Tảo lục Chlorella sp, hay còn gọi là rong tiểu cầu, có cấu trúc đơn bào hình trứng, hình tròn hoặc hình ôvan, với đường kính tế bào trung bình khoảng 5 – 10 m, không vượt quá 15 m Tế bào không có roi, do đó không có khả năng di động Hầu hết tế bào có một nhân, bao gồm màng dịch nhân, hạch nhân và mạng lưới nhiễm sắc Sắc tố quang hợp của tảo chỉ có một thể sắc tố chloroplast hình chén, được bao phủ bởi lớp màng mỏng kép, bên trong chứa dịch protein gọi là chất nền (matrix) và các cấu trúc dạng bản mỏng (lamen) Lạp lục là nơi duy nhất trong tế bào tích lũy tinh bột, với tinh bột tập trung xung quanh cơ quan chuyên hóa gọi là pyreoit hay hạt tạo bột.

Chấtdự trữ của vi tảoChlorella sp là tinh bột.

Cũng giống như đại đa số các loài tảo đơn bào khác, Chlorella sp cũng có 5 pha trong chu trình sinh trưởng,đó là:

Trong giai đoạn pha gia tốc dương, vi tảo bắt đầu thích nghi với môi trường sống và hấp thu dinh dưỡng, đồng thời phân cắt tế bào Khi sống trong điều kiện thuận lợi với nguồn dinh dưỡng phong phú, quần thể tảo có khả năng sinh trưởng nhanh Tuy nhiên, do số lượng tảo giống còn ít, tốc độ tăng trưởng của vi tảo trong một đơn vị thời gian không lớn, dẫn đến sự phát triển của quần thể diễn ra chậm.

Pha logarit là giai đoạn mà mật độ vi tảo gia tăng mạnh mẽ sau pha gia tốc dương Trong điều kiện môi trường thuận lợi, vi tảo hấp thu chất dinh dưỡng hiệu quả, dẫn đến sự tăng trưởng nhanh chóng cả về mật độ và sinh khối tế bào.

Trong pha gia tốc âm, số lượng vi tảo đã đạt đến một mức độ nhất định, dẫn đến môi trường trở nên bất lợi cho sự phát triển của chúng, đặc biệt là do yếu tố dinh dưỡng Kết quả là, tốc độ sinh trưởng của vi tảo đã chậm lại so với pha logarit trước đó.

Pha cân bằng là giai đoạn mà sinh khối tảo đạt đến mức tối đa, trong đó quá trình quang hợp và phân chia tế bào vẫn tiếp tục diễn ra Tuy nhiên, số lượng tế bào mới sinh ra và tế bào chết đi gần như bằng nhau, dẫn đến việc sinh khối của quần thể vi tảo không tăng lên.

Sau khi đạt cực đại, sinh khối tảo bắt đầu tàn lụi do các yếu tố môi trường trở nên bất lợi Khả năng hấp thu chất dinh dưỡng và sinh sản của vi tảo giảm rõ rệt, dẫn đến sự suy giảm dần dần của sinh khối tảo sau giai đoạn cực đại.

Hình 2.1:Đường cong sinh trưởng quần thể vi tảo.

Trong điều kiện nuôi trồng, mật độ tảo gia tăng, môi trường thiếu hụt dinh dưỡng và sự tích tụ chất thải trong quá trình sống đã làm chậm quá trình phân chia tế bào và tích lũy sinh khối Tóm lại, tốc độ sinh trưởng của vi tảo Chlorella sp phụ thuộc vào các yếu tố như mật độ tảo, chất dinh dưỡng và chất thải môi trường.

- Yếutố bên trong: Trạngthái sinh lý,giai đoạn phát triển của tế bào.

Môi trường bên ngoài, bao gồm dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, khả năng khuấy đảo và hàm lượng CO2, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu sinh học Các yếu tố này đã được Muzapharov, Taybaev (1974) và Dovorakova (1963) đề cập trong các công trình của họ, như được trích dẫn bởi Trần Thị Tho (1999).

Chlorella sp sinh sản vô tính thông qua quá trình tế bào mẹ tạo ra các tự bào tử (autospore) Tế bào mẹ có khả năng phân chia thành 2 hoặc 4 bào tử, góp phần vào sự phát triển và sinh sản của loài tảo này.

Tự bào tử có thể được tạo ra với số lượng từ 8, 16, 32, thậm chí lên đến 64 Khi quá trình phân chia kết thúc, tự bào tử tách ra khỏi tế bào mẹ bằng cách phá hủy màng tế bào Các tế bào con sau đó phát triển đến giai đoạn chín sinh dục, và quy trình này sẽ được lặp lại.

Theo tính toán, để tăng sinh khối lên gấp đôi trong điều kiện tối ưu, Chlorella sp cần khoảng 4 – 6 giờ Điều này đặc biệt quan trọng trong các giai đoạn phát triển.

N: Mật độ tế bào t: Thời gian t

Tế bào vi tảo phát triển theo các chế độ sáng và tối khác nhau, với ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong pha sinh trưởng Ngược lại, quá trình phóng tự bào tử ra môi trường thường diễn ra trong bóng tối Hiện tượng này hỗ trợ việc đồng bộ hóa tế bào tảo, giúp nâng cao hiệu quả trong nuôi trồng trên diện rộng (Trần Văn Vỹ, 1995) [10].

Chlorella là một loài tảo phân bố rộng rãi trên toàn cầu, có khả năng sống trong nhiều môi trường khác nhau, bao gồm nước mặn, nước lợ và nước ngọt Loài tảo này thường xuất hiện nhiều ở những thủy vực giàu dinh dưỡng, cho thấy sự thích nghi và phát triển mạnh mẽ của chúng trong các điều kiện sinh thái khác nhau.

2.1.3 Thành phầnsinh hoá của vi tảo lục Chlorella sp

Thành phần sinh hóa của các loài vi tảo có sự khác biệt rõ rệt, không chỉ giữa các loài mà còn ở các giai đoạn phát triển khác nhau của cùng một loài Điều này cho thấy sự đa dạng và phức tạp trong chu kỳ sinh trưởng và phát triển của vi tảo (Trần Thị Thovà và cộng sự).

Thành phần sinh hoá của vi tảo phụ thuộc vào tốc độ sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường sống và các điều kiện nuôi cụ thể Nghiên cứu của Renaud, Thinh & Parry (1999) cho thấy vi tảo ở cuối pha logarit chứa 30-40% protein, 10-20% lipid và 5-10% carbohydrate Tuy nhiên, khi qua pha cân bằng, hàm lượng này có sự thay đổi lớn và mối liên quan giữa các thành phần dinh dưỡng như lipid, carbohydrate và protein không rõ ràng.

Vài nét về tình hình phân l ập và lưu giữ giống tảo

2.2.1.Phươngpháp phân lập tảo giống thuần chủng

Theo nghiên cứu của Hans R và Robert A (2005), môi trường và phương pháp nuôi vi tảo đã được khám phá từ thế kỷ 19, với Chlorella sp là một trong những đại diện tiêu biểu Mặc dù nhiều nghiên cứu vi tảo chủ yếu tập trung vào việc mô tả thu hoạch sinh khối, Chlorella sp lại nhận được sự chú ý đặc biệt từ các nhà khoa học trong và ngoài nước Đáng chú ý, dòng thuần chủng Chlorella sp đã được phân lập lần đầu tiên vào những năm 1890 bởi Beijerinck.

Mặc dù Chlorella sp là một trong những vi tảo nổi bật, nhưng hầu hết các loài vi tảo khác vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ về phương pháp và môi trường phân lập Điều này đặc biệt đúng đối với công nghệ vi tảo tại Việt Nam, nơi cần có sự phát triển và hoàn thiện hơn nữa.

Trong những năm gần đây, trường đại học Murdoch tại Úc đã phát triển bốn phương pháp phân lập giống tảo, bao gồm phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường đặc, nhặt tế bào bằng micropipette và phương pháp làm giàu Tại Việt Nam, TS vi tảo Hoàng Thị Bích Mai cũng đã đề xuất thêm phương pháp lọc sử dụng các màng lọc với kích cỡ lỗ khác nhau để hỗ trợ trong việc phân lập giống tảo.

 Về phương pháp pha loãng:

Phương pháp nuôi tảo trong môi trường hỗn hợp, được giới thiệu bởi Beijenck, đánh dấu thành công đầu tiên trong lịch sử phân lập giống tảo thuần chủng, đặc biệt là Chlorella sp Chỉ sau ba năm, vào năm 1893, ông đã thành công trong việc phân lập hai loài tảo lục là Chlorella và Scenedesmus, cùng với một số loài tảo khác như Trebauxia và Anabana.

Nhà vi tảo học người Pháp Miquel đã có nhiều đóng góp cho công nghệ vi tảo, thông qua các thí nghiệm pha loãng tảo tạp trong môi trường chứa các nguyên tố khoáng khác nhau để phân lập một số loài tảo silic trung tâm, mặc dù độ thuần chủng còn thấp Từ năm 1926 đến 1960, nhà nghiên cứu người Đức Richter cũng đã thành công trong việc phân lập một số loài tảo thuộc các bộ Vovocales, Euglenales, Cryptomonadales Tại Trung Quốc, Guo và cộng sự vào năm 1959 đã phân lập thành công hai loài tảo đơn bào Tetraselmis sp và Dunaliella sp.

Phương pháp pha loãng là một kỹ thuật truyền thống phổ biến trong các nghiên cứu tại Việt Nam Một ví dụ điển hình là công trình phân lập và nuôi đại trà tảo silic Skeletonema costatum, được sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm tại trại giống non nước Đà Nẵng.

1989) Thành công của công trình nghiên cứunày cũng đã mở ra nhiều hướng trong nghiên cứu phân lập tảo giống ở việt nam.

Công trình của Nguyễn Thị Xuân Thu, Nguyễn Thị Bích Ngọc và Nguyễn Thị Hương (2004) đã trình bày quy trình sản xuất vi tảo một cách đầy đủ và chi tiết, bao gồm các bước phân lập, lưu giữ và gây nuôi thu sinh khối Phương pháp pha loãng được áp dụng phổ biến trong phân lập vi tảo, đặc biệt là đối với các loài như Chlorella sp.

Platymonas và Chaetoceros muelleri cho hiệu quả tương đối cao trong nghiên cứu Tuy nhiên, các tác giả không cung cấp chi tiết về kết quả phân lập, và hầu hết các giống tảo được sử dụng đều có nguồn gốc nhập nội từ các quốc gia như Trung Quốc, Philippines, Đan Mạch và Úc, mà không phải là giống bản địa của Việt Nam.

Năm 2007, Bùi Thị Vân công bố quy trình và kết quả phân lập hai loài tảo silic lông chim sống đáy, gồm Navicula sp và Nitzschia sp Hai phương pháp được sử dụng là phân lập pha loãng và nuôi cấy trên môi trường đặc Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp phân lập pha loãng mang lại hiệu quả cao hơn so với phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc.

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về việc phân lập loài tảo Chlorella sp, nổi bật là công trình của Trần Thị Thanh Nga (2005) và Vũ Thị Thùy Minh (2006) Trần Thị Thanh Nga đã mô tả chi tiết các thao tác và kết quả của hai phương pháp phân lập, bao gồm phương pháp pha loãng và nuôi cấy trên môi trường đặc Kết quả của nghiên cứu cho thấy, tương tự như Bùi Thị Vân, cả hai tác giả đều kết luận rằng phương pháp phân lập Chlorella sp bằng cách pha loãng kém hiệu quả hơn so với nuôi cấy trên môi trường đặc.

 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc.

Ward, một nhà nghiên cứu người Mỹ (1899 - 1942), được công nhận là người đầu tiên thành công trong việc phân lập tảo thuần chủng bằng phương pháp trộn agar và acid axetic loãng với môi trường dinh dưỡng, sau đó đổ vào đĩa Petri và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, phương pháp này chỉ mang lại thành công cho một số ít loài tảo.

Năm 1900, sau Ward, Winkler tiến hành thu mẫu tảo nước ngọt xung quanh nhà và đã thuần chủng thành công một số loài tảo bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch Ông cũng phát hiện ra môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sự phát triển của tảo và tiến hành nuôi chúng ở các thể tích khác nhau.

Ở Việt Nam, phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch đã trở nên phổ biến bên cạnh phương pháp pha loãng Tuy nhiên, hiệu quả của phương pháp này khác nhau tùy thuộc vào từng đối tượng cụ thể Đặc biệt, đối với Chlorella sp, phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc mang lại hiệu quả cao nhất, như được chứng minh trong nghiên cứu của Trần Thị Thanh Nga năm 2005.

Vũ Thị Thùy Minh, năm 2006).

Trong phương pháp phân lập vi tảo, việc sử dụng hỗn hợp kháng sinh là rất quan trọng để làm sạch vi tảo khỏi nhiễm khuẩn Cụ thể, hỗn hợp bao gồm 100 g peniciline và 25 g dihydrostreptomysin sulphate được áp dụng để tăng cường hiệu quả phân lập (theo Tôn Nữ Mỹ Nga, 2007, trích theo Bùi Thị Vân, 2007).

Vào năm 1997, Comtois đã thành công trong việc phân lập và nuôi thuần chủng một số loài tảo silic bằng phương pháp nhặt tế bào bằng Micropipette, một kỹ thuật đòi hỏi tay nghề cao và chỉ phù hợp với các loài có kích thước lớn hơn và cấu trúc cơ thể đơn giản Tại Việt Nam, vào năm 2000, Vũ Dũng và các cộng sự cũng áp dụng thành công phương pháp này trên loài Skeketonema costatum Trong thí nghiệm, họ đã pha loãng mẫu tảo tự nhiên để có từ 5 – 10 chuỗi tế bào trên kính hiển vi, sau đó sử dụng ống hút mao quản để chuyển từng chuỗi tế bào S.costatum vào dung dịch môi trường nhân giống.

Ứng dụng của vi tảo trong ng ành nuôi trồng thủy sản

Trong những năm gần đây, nghề nuôi thuỷ hải sản tại Việt Nam đã có nhiều tiến triển tích cực với thành công từ các nghiên cứu về sản xuất giống và nuôi lớn các đối tượng thân mềm, giáp xác và một số loài cá biển Vi tảo đã đóng góp quan trọng vào sự phát triển này, không chỉ cung cấp nguồn thức ăn tươi sống cho các đối tượng nuôi mà còn giúp xử lý môi trường nước và duy trì cân bằng sinh thái.

2.3.1 Vai trò làm thức ăn tươi sống

Vi tảo (Micro algae) là các sinh vật tự dưỡng có kích thước hiển vi, chủ yếu sống trong môi trường nước và đóng vai trò quan trọng trong sự sống của các thuỷ vực Qua quá trình quang hợp, vi tảo hấp thụ muối vô cơ và chuyển hóa chúng thành chất hữu cơ, tạo thành mắt xích đầu tiên trong hệ sinh thái nước, góp phần vào năng suất sinh học sơ cấp và tuần hoàn vật chất Các môi trường sống chính của vi tảo bao gồm biển, sông ngòi và hồ ao, nơi chứa đựng tiềm năng lớn về thực phẩm và nguyên liệu cho đời sống con người.

Trên toàn cầu, khoảng 200 tỷ tấn chất hữu cơ được sản xuất, trong đó tảo đóng góp từ 170 đến 180 tỷ tấn chất hữu cơ (Tambiep, 1974).

Vũ Thị Thùy Minh (2006) cho rằng vi tảo là nguồn thức ăn bổ dưỡng cho vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản, hơn là chỉ xem xét khối lượng lớn chất hữu cơ mà chúng sản sinh ra.

Vi tảo trong nuôi trồng thuỷ sản là nguồn thức ăn tươi sống giàu giá trị dinh dưỡng, đặc biệt nổi bật với hàm lượng protein cao Nghiên cứu đã phân tích 40 loài tảo thuộc 7 lớp khác nhau, bao gồm Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, Eustigmatophyceae, Rhodophyceae và Prasinophyceae, cho thấy sự đa dạng và tiềm năng của vi tảo trong ngành nuôi trồng thuỷ sản.

Năm 1997, nghiên cứu đã chỉ ra rằng tảo đơn bào có thành phần protein cao, chiếm tới 52% khối lượng cơ thể Ngoài ra, các acid béo không no mạch dài (PUFA và HUFA) như DHA, EPA và AA rất quan trọng cho sự sinh trưởng, phát triển và sức đề kháng của động vật nuôi thủy sản Theo Nguyễn Thi Xuân Thu (2004), hầu hết các loài tảo chứa acid béo không no EPA với tỷ lệ từ 7% đến 34% Các lớp tảo như Bacilariophyceae (Chaetoceros, Thalassiosia, Nizschia, Skeletonema), Prymnesiophyceae (Isochrysis, Paplova), Cryptophyceae (Rhodosorus) và Eustigmatophyceae (Nannochloropsis) rất giàu DHA và EPA.

Vi tảo là nguồn cung cấp nhiều vitamin thiết yếu cho thủy sản, bao gồm thiamin (B1), riboflavin (B2), pyridoxine (B6), cyanocobalamin (B12) và biotin Bên cạnh đó, các khoáng chất và sắc tố trong tảo như chlorophyll, carotenoid, phycoerythin, phycocyanin và β-carotene cũng đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao giá trị dinh dưỡng của nhiều loài tảo.

Về cách thức sử dụng vi tảo làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản thì được chia làm 2 nhóm:

 Dùng vi tảo làm thức ăn tươi sống trực tiếp: Bao gồm các loài vi tảo thuộc các chi như Chaetoceros, Thallassiosira, Tetraselmis, Isochrysis, Chlorell, Nannochloropsis.

 Dùng vi tảo gián tiếp qua zooplankton nh ư Artemia, Brachionus, Moina, Daphnia.

2.3.2 Xử lý môi trường nước và làm cân bằng hệ sinh thái

Sự phát triển mạnh mẽ của nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến sự suy giảm tài nguyên nước và ô nhiễm môi trường Việc khai thác tài nguyên nước quá mức gây khó khăn trong công tác quản lý môi trường Giải pháp hiệu quả được đề xuất là xây dựng hệ sinh thái ổn định trong ao nuôi, tập trung vào các quần thể sinh vật tự nhiên, đặc biệt là vi tảo Hướng đi này đã chứng minh tính hiệu quả và toàn diện qua nhiều nghiên cứu về thu nuôi sinh khối vi tảo.

Chlorella)để xử lý và cải tạo môi trường nước giữ cân bằng sinh thái.

Nhờ khả năng tự quang hợp dưới ánh sáng mặt trời, vi tảo có khả năng hấp thu mạnh các muối dinh dưỡng như amonia và muối PO4, góp phần làm sạch môi trường nước Các muối dinh dưỡng này thường là sản phẩm từ quá trình phân giải chất hữu cơ, sản phẩm bài tiết của động vật nuôi, thức ăn thừa và xác chết của sinh vật.

CO 2 + NO 3 - + PO 4 3- + H 2 O [CH 2 ONP] + O 2

Trong quá trình phát triển, vi tảo hấp thu một lượng lớn khí CO2 trong nước, giúp ổn định hệ cân bằng cacbonat Điều này duy trì độ kiềm và pH trong ao nuôi, tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của động vật nuôi.

Vi t ảo không chỉ sản sinh ra lượng lớn khí Oxy, mà còn đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại của vật nuôi thuỷ sản và các sinh vật khác Oxy Ánh sáng có tác dụng tích cực trong việc phân giải mùn bã hữu cơ tích tụ dưới đáy ao, từ đó gián tiếp giảm độc tính của các khí độc như NH3, H2S và NO2.

Tập đoàn tảo có vai trò quan trọng trong việc giảm hàm lượng kim loại nặng trong nước, ổn định nhiệt độ và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Trong ao nuôi tôm công nghiệp, sự phát triển của tảo không chỉ tạo cảm giác an toàn cho vật nuôi mà còn ngăn chặn sự phát triển của tảo đáy.

Trong hệ sinh thái ao nuôi trồng thủy sản, vi tảo đóng vai trò quan trọng như các tác nhân sinh học, góp phần vào quá trình tự làm sạch môi trường, tương tự như một nhà máy lọc sinh học (Dương Đức Tiến, 1988; trích theo Vũ Thị Thùy Minh, 2006).

Bảng 2.3: Các lớp và các chi tảo được nuôi trồng để làm thức ăn cho động vật thuỷ sinh (Đặng Đình Kim, 1998) [2].

Lớp Chi Đối tượng dung vi tảo

Thalassiosira Phaeodactylum Chaetoceros Nitzchia và cyclotella

PL, BL, BP, ML, BS

PL, BL, BP, BS BS

PL, BL, BP, ML, BS

PL, BL, BP, AL, BS, MR

Chrysophyceae Monochrysis BL, BP, BS, MR

BL, BP, FZ, MR, BS

BL, ML, BS, MR, FZ

Cyanophyceae Spirulina BP, MR, SC, PL, BS, PP

PL - Ấu trùng tôm, BL - Ấu trùng nhuyễn thể hai mảnh vỏ, ML - Ấu trùng tôm nước ngọt, BP - Hậu ấu trùng hai mảnh vỏ, AL - Ấu trùng bào ngư, MR - Brachionus là các loại ấu trùng quan trọng trong hệ sinh thái thủy sản, đóng vai trò thiết yếu trong chuỗi thức ăn và sự phát triển của nhiều loài thủy sản Việc hiểu rõ về các loại ấu trùng này giúp nâng cao hiệu quả nuôi trồng thủy sản và bảo tồn nguồn lợi thủy sản.

BS–Artermia, SC– Saltwater copepoda, FZ– Phù du động vật nước ngọt.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU

Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Sinh lý – Sinh hóa, Bộ Môn Cơ Sở Sinh Học Nghề Cá,Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản,Trường Đại Học Nha Trang.

Phương pháp nghiên c ứu

3.2.1.Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Hình 3.1:Sơ đồkhối nội dung phân lập tảo giống thuần chủng Chlorella sp

Phân lập bằng phương pháp pha loãng

Phân lập bằng phương pháp cấy trên môi trường đặc (thạch)

Phương pháp và môi trường dinh dưỡng thích hợp cho phân lậpChlorella sp

Hình 3.2:Sơ đồ khối nội dung lưu giữ tảo giống thuần chủng Chlorella sp

Lưu giữ trongđiều kiện dịch nuôi dạng lỏng

Lưu giữ trong điều kiện dịch nuôi dạng bán lỏng

Nhân sinh khối, kiểm tra các chỉ tiêuđể đánh giá cácđiều kiện lưu giữ

Nhiệt độ 7– 8 0 C Nhiệt độ 30 0 C Điều kiện lưu giữ thích hợp

3.2.2 Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, n ước và môi trường thí nghiệm a, Dụng cụ thí nghiệm

 Dụng cụ thu mẫu: Lưới vớt động vật, thực vật nổi

 Dụng cụ chứa: Chai, lọ, can nhựa có dung tích từ 0.5 – 10 lít

 Các dụng cụ trong phân lập: Đĩa pertri, ống nghiệm 30 mL, lọ thuỷ tinh có dung tích 50 mL, các bình nón có dung tích 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1 l.

 Dụng cụ trong lưu giữ: Các lọ thuỷ tinh có dung tích 150 mL.

Hình 3.3 Hìnhảnh cân điện tử (trái) và kính hiển vi (phải) phục vụ cho nghiên cứu.

Ngoài các dụng cụ thí nghiệm cơ bản như hệ thống kính hiển vi quang học và buồng đếm hồng cầu, còn có nhiều thiết bị khác như cân điện tử, lam, lam men, giá để ống nghiệm, pipet các kích thước từ 0.5mL đến 10mL, ống đong 50mL, que cấy, đũa khuấy thủy tinh và nồi nấu aga Để đảm bảo chất lượng thí nghiệm, các dụng cụ này cần được rửa sạch bằng xà phòng và nước máy, sau đó để khô, sử dụng nút bông và quấn báo, cuối cùng là sấy ở nhiệt độ 105°C trong 12 giờ.

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh lý - Sinh thái thuộc Bộ môn Cơ sở sinh học nghề cá, Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại học Nha Trang Nhiệt độ trong phòng được duy trì ổn định ở mức 20-22 độ C nhờ vào hệ thống điều hòa không khí.

 Cường độ ánh sáng được điều chỉnh nhờ hệ thống đèn neon.

Thiết bị phục vụ cho việc phân lập và lưu giữ bao gồm tủ nuôi cấy với khung kim loại, bên trong chia thành các ngăn và được trang bị hệ thống đèn neon cùng đèn cực tím Tủ nuôi cấy còn có giá kim loại hỗ trợ nhân sinh khối, bên cạnh đó là các thiết bị như tủ lạnh và tủ sấy dụng cụ Nguồn nước cũng là yếu tố quan trọng trong quá trình này.

 Nước ngọt: Nước cất, tại phòng thí nghiệm môi trường, khoa Nuôi Trồng Đại Học Nha Trang.

 Nước mặn: Nước biển lọc sạch, đã qua xử lý hóa chất tại Trại Sản xuất giống nuôi trồng thủy sản – Trường Đại Học Nha Trang.

 Độ mặn môi trường nuôi: Sử dụng nước có độ mặn 20 0 / 00 Nước mặn được pha theo quy tắc sau (Quy tắc đường chéo).

Hình 3.4: Cách pha độ mặn.

Trong đó: a ppt (c-b)V a ppt b ppt (a-c)V b ppt c a, b, c tương ứng với độ mặn của nước mặn, nước ngọt và nước sau khi pha.

V a , V b thể tích nước ngọt và nước mặn cần sử dụng.

Tảo giống được thu mẫu tại Trung Tâm Khuyến Ngư, địa chỉ Linh Lộc, Tp Nha Trang, Tỉnh Khánh Hòa Quá trình thu mẫu diễn ra tại ao nuôi cá Chẽm theo hình thức mương nổi, với độ mặn trong ao dao động khoảng 20 0/00 Màu nước trong ao có sắc xanh lá cây nhạt.

Để thu mẫu nước môi trường, bạn cần múc nước vào bình thu mẫu và sử dụng lưới để vớt thực vật nổi cách mặt nước khoảng 20 cm, sau đó cho vào bình Quá trình thu mẫu nên được thực hiện nhiều lần Sau khi thu thập, mẫu cần được đưa về phòng thí nghiệm để lọc qua lưới vớt động vật nổi, nhằm loại bỏ các chất cạn bẩn và động vật phù du.

Nhân sinh khối được thực hiện từ nguồn tảo giống bằng các bình nón 0.5 lít và 1 lít, sử dụng môi trường dinh dưỡng F2 Điều kiện nuôi trồng bao gồm nhiệt độ 20-22°C, độ mặn 20 0/00, chiếu sáng 12 giờ/ngày với cường độ khoảng 3000 lux, và sục khí liên tục 24/24 Sau một tuần, dung dịch tảo chuyển sang màu xanh đậm, và dưới kính hiển vi, tảo lục Chlorella sp được quan sát với mật độ dày để tiến hành phân lập.

 Môi trường F2.(Guillard, 1975 Trích theo Bùi Thị Vân, 2007) [1].

Dung dịch 1: Các thành phần đa lượng.

Dung dịch 2: Các thành phần vi lượng.

Hình 3.5 Hóa chất pha môi trường và môi trường dinh dưỡng cho nuôi tảo.

 Môi trường TH.04 cải tiến.

Dung dịch 1: Thành phần đa lượng.

1.8 22.9 100 33.5 Dung dịch 2: Thành phần vi lượng

Hóa chất Nồng độ (mg/l)

3.2.4.1 Thí nghiệm phân lập thuần chủng Chlorella sp

Quá trình phân lập Chlorella sp được thực hiện trên hai loại môi trường dinh dưỡng, bao gồm môi trường F/2 và môi trường TH.04, sử dụng hai phương pháp là pha loãng và nuôi cấy trên môi trường đặc (thạch) Các lô thí nghiệm được tiến hành đồng thời để đảm bảo tính chính xác và so sánh hiệu quả của từng phương pháp.

 Thí nghiệm 1: Thí nghiệm phân lập tảo lục Chlorella sp bằng phương pháp pha loãng

Chuẩn bị 10 lọ thuỷ tinh 50 mL, được đậy kín bằng bông gòn và bọc giấy bạc Mỗi lọ chứa 9 mL môi trường nuôi tảo đã pha dinh dưỡng, được đánh dấu từ 10^-1 đến 10^-10 để chỉ số lần pha loãng.

 Dùng pipet có dung tích chứa 1 mL, hút 1 mL dung dịch tảo mẫu ngoài tự nhiên đã nhân sinh khối đưa sang lọ đầu tiên 10 -1 và lắc nhẹ.

 Sau đó lấy 1 mL từ lọ 10 -1 đưa sang lọ 10 -2 , cứ làm tương tự như vậy với các lọ thí nghiệm tiếp sau.

 Các lọ thí nghiệm được nút lại và đặt trong tủ nhân sinh khối dưới ánh sáng đèn neon.

Thí nghiệm được thực hiện với hai nghiệm thức, tương ứng với hai loại môi trường dinh dưỡng là F/2 và TH.04, với tổng số lần lặp lại là ba lần.

 Độ mặn của dung dịch môi trường nuôi là 20 0 / 00

 Nhiệt độ: ở điều kiện phòng thí nghiệm nuôi tảo.

 Cường độ ánh sáng: 3000-4000 lux

 Thời gian chiếu sáng 12 h/ngày.

Các chỉ tiêu đánh giá mức độ thuần chủng của Chlorella sp được xác định qua tỷ lệ phần trăm tế bào Chlorella sp trong tổng số tế bào trong mẫu Sự phù hợp của Chlorella sp trên các môi trường dinh dưỡng cũng được đánh giá thông qua việc thu mẫu và xác định mật độ tế bào Quá trình thu mẫu và đếm tế bào diễn ra ngay trước khi tiến hành phân lập lần kế tiếp.

Hình 3.6: Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng.

 Thí nghiệm 2: Thí nghiệm phân lập tảo lục Chlorella sp bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch

 Chuẩn bị môi trường thạch: Pha môi tr ường thạch với tỷ lệ 2 gram agar với

100 mL dung dịch nuôi tảo và khuấy đều.

 Đun sôi cho đến khi tan hết agar.

 Đưa ra ngoài để nguội tự nhiên, khi thạch sắp đông thì cho vào đĩa Petri (10 mL/đĩa).

 Đậy nắp lại và chờ cho đến khi thạch đông, dùng que cấy đã hơ nóng đỏ tạo các đường ziczac trên bề mặt thạch (hình 3.10).

 Nhỏ 1 mL mẫu tảo hỗn hợp vào bề mặt thạch và tráng đều.

Đậy nắp lại và để dưới đèn cực tím trong khoảng 15 phút, sau đó chuyển vào tủ nhân sinh khối có ánh sáng từ đèn huỳnh quang, với thời gian chiếu sáng là 12 giờ mỗi ngày.

Sau 4-5 ngày, khi trên bề mặt thạch xuất hiện các quần lạc màu xanh vàng, tiến hành soi dưới kính hiển vi để xác định chính xác quần lạc của Chlorella sp Sau đó, sử dụng que cấy đã được hơ nóng đỏ để tách các khuẩn lạc và đưa vào các lọ thủy tinh.

Kỹ thuật phân lập Chlorella sp được thực hiện bằng cách cấy trên môi trường đặc với dung tích 50 mL, trong đó chứa 9 mL dung dịch nuôi Môi trường dinh dưỡng này tương tự như môi trường dinh dưỡng sử dụng trong các đĩa Petri.

Để thuần chủng tảo và tránh tảo bị tạp, sau khi nuôi trong các lọ thủy tinh 50 mL khoảng 5 ngày, ta cần lọc lấy dung dịch nước tảo và cấy lại trên môi trường thạch Phương pháp này giúp thu được tảo với độ thuần chủng cao hơn.

Thí nghiệm được thực hiện với hai nghiệm thức tương ứng với hai loại môi trường dinh dưỡng là môi trường F/2 và môi trường TH.04, với tổng cộng ba lần lặp lại để đảm bảo tính chính xác của kết quả.

(Tổng số có 2 × 3 = 6 nghiệm thức).

 Nhiệt độ: ở điều kiện phòng thí nghiệm nuôi tảo.

 Cường độ ánh sáng: 3000-4000 lux.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN