phân lập và lưu giữ tảo giống thuần chủng chlorella sp nước mặn làm thức ăn cho các đối tượng nuôi thủy sản

Độ thuần chủng của Chlorella sp % bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau.. Bên cạnh đó,các công trình nghiên c ứu trên tảo trong nước chủ y

Lời cảm ơn

Với lòng biết ơn chân thành sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn tới:

 Ban Chủ Nhiệm Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản – Trường Đại Học Nha Trang

 Bộ môn Môi Trường Và Nguồn Lợi Thủy Sản, Bộ môn C ơ Sở Sinh HọcNghề Cá - Trường Đại Học Nha Trang

 Phòng thư viện Trường Đại Học Nha Trang

 Phòng vật tư và thiết bị - Trường Đại Học Nha Trang

Đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi ho àn thành đề tài tốt nghiệp này

Đặc biệt cho tôi gửi lời cám ơn trực tiếp tới:

 TS Hoàng Thị Bích Mai

 Ths Bùi Bá Trung

 KS Nguyễn Thị Thúy

Đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề t ài

Để Có được những thành công này, cho tôi g ửi lời cám ơn tới gia đình,người thân và bạn bè, những người đã ủng hộ, động viên giúp đỡ tôi vượt quanhững khó khăn để hoàn thành tốt những mục tiêu đã đề ra

Một lần nữa tôi xin chân th ành cảm ơn

Nha trang, tháng 11 năm 2008

SV: Mai Đức Thao

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

Chương 2: TỔNG LUẬN 4

2.1 Hệ thống phân loại và đặc điểm sinh học Chlorella sp 4

2.1.1 Hệ thống phân loại 4

2.1.2 Một số đặc điểm sinh học chủ y ếu của tảo lục Chlorella sp (theo Đặng Đình Kim,1998) [2] 4

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Chlorella sp 4

2.1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng 5

2.1.2.3 Đặc điểm sinh sản 6

2.1.2.4 Phân bố 7

2.1.3 Thành phần sinh hoá của vi tảo lục Chlorella sp 7

2.1.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của vi tảo 8

2.1.4.1 Ánh sáng 8

2.1.4.2 Nhiệt độ 10

2.1.4.3 Độ mặn 11

2.1.4.4 Ảnh hưởng của pH 11

2.1.4.5 Ảnh hưởng của hàm lượng khí Cacbonic (CO2) 12

2.1.4.6 Ảnh hưởng của khuấy sục 13

2.1.4.7 Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh d ưỡng 13

2.2 Vài nét về tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo 16

2.2.1 Phương pháp phân l ập tảo giống thuần chủng 16

2.2.2 Về vấn đề lưu giữ tảo giống thuần chủng 19

2.2.3 Môi trường dinh dưỡng sử dụng cho nuôi trồng Chlorella 21

2.3 Ứng dụng của vi tảo trong ng ành nuôi trồng thủy sản 22

2.3.1 Vai trò làm thức ăn tươi sống 22

2.3.2 Xử lý môi trường nước và làm cân bằng hệ sinh thái 24

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 27

3.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

3.1.1 Đối tượng 27

3.1.2 Thời gian 27

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 27

3.2 Phương pháp nghiên c ứu 27

3.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 27

3.2.2 Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, n ước và môi trường thí nghiệm 30

3.2.3 Nguồn Tảo 32

3.2.4 Bố trí thí nghiệm 34

3.2.4.1 Thí nghiệm phân lập thuần chủng Chlorella sp 34

3.2.4.2 Thí nghiệm xác định điều kiện l ưu giữ thích hợp 38

3.2.2 Các phương pháp xác đ ịnh mật độ tế bào, tỷ lệ thuần chủng, tốc độ sinh trưởng hàng ngày và các yếu tố môi trường nuôi 41

3.2.5.1 Đếm tế bào 41

3.2.5.2 Phương pháp xác đ ịnh tỷ lệ thuần chủng trong các thí nghiệm phân lập Chlorella sp 42

3.2.5.3 Công thức xác định tốc độ sinh tr ưởng hàng ngày 43

3.2.5.4 Kiểm tra các yếu tố môi trường 43

Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44

4.1 Phân lập Chlorella sp thuần chủng bằng các phương pháp khác nhau 44

4.1.1 Phân lập bằng phương pháp pha loãng 44

4.1.2 Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc (thạch) 47

4.2 Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Đường cong sinh trưởng quần thể vi tảo 6

Hình 3.1: Sơ đồ khối nội dung phân lập tảo giống thuần chủng Chlorella sp 28

Hình 3.2: Sơ đồ khối nội dung lưu giữ tảo giống thuần chủng Chlorella sp 29

Hình 3.3 Hình ảnh cân điện tử (trái) v à kính hiển vi (phải) phục 30

Hình 3.4: Cách pha độ mặn 31

Hình 3.5 Hóa chất pha môi trường và môi trường 33

Hình 3.6: Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng 36

Hình 3.7: Kỹ thuật phân lập Chlorella sp bằng phương 37

Hình 3.8: Lưu giữ Chlorella sp 38

Hình 3.9: Buồng đếm hồng cầu Neubauer 42

Hình 4.1: Hình Chlorella sp trước và sau khi phân lập 47

Hình 4.2: Quần lạc tảo mọc trên các đĩa thạch 48

Hình 4.3: Kết quả phân lập Chorella sp thuần chủng bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc (ảnh được chụp dưới độ phóng đại 40×10 l ần) 49

Hình 4.4 Diễn biến mật độ tế bào tảo Chlorella sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở các điều kiện khác nhau 55

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Thành phần sinh hoá của Chlorella sp 8

Bảng 2.2: Môi trường tối ưu để nuôi một số loài tảo (Nguyễn Thị Xuân Thu v à ctv,2004) [6] 9Bảng 2.3: Các lớp và các chi tảo được nuôi trồng để làm thức ăn cho động vật thuỷsinh (Đặng Đình Kim, 1998) [2] 26

Bảng 3.1 Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch nuôi dạng lỏng với

nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khác nhau 39

Bảng 3.2 Thí nghiệm lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch nuôi dạng bán lỏng

với nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khác nhau ………39

Bảng 4.1: Mức độ thuần chủng (%) của tảo giống Chlorella sp nước mặn bằng

phương pháp pha loãng: ………44

Bảng 4.2 Độ thuần chủng của Chlorella sp (%) bằng phương pháp nuôi cấy trên

môi trường thạch ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau 49

Bảng 4 3 Sinh trưởng của Chlorella sp (N×106 tb/mL) được đưa ra nuôi dinh khối

sau khi lưu giữ ở các điều kiện khác nhau. 53

Chương 1: MỞ ĐẦU

Thập niên đầu tiên của thế kỷ 21 đã đánh dấu sự phát triển vượt bậc củangành thuỷ sản trong nước cũng như trên thế giới Nó dần trở thành nền kinh tế mũinhọn và được huy động mọi tiềm năng để phát triển , nhằm đóng góp có hiệu quảvào nền kinh tế quốc dân cũng nh ư nâng cao đời sống cho cộng đồng dân c ư Songmột điều dễ nhận thấy l à nguồn lợi tự nhiên về hải sản cũng như thuỷ sản nước ngọtkhông phải là vô hạn Ngược lại, nó lại luôn có chiều hướng suy giảm do khai thácquá mức và môi trường thì ngày càng ô nhiễm Chính vì vậy nuôi trồng thuỷ sản sẽnắm giữ một vai trò chủ đạo đưa ngành thuỷ sản tiếp tục phát triển bền vững trongtương lai

Song bên cạnh đó, ngành nuôi trồng thuỷ sản ở nước ta cũng như một sốnước khác trong khu vực vẫn còn nhiều tồn tại cần sớm khắc phục nh ư: vấn đề congiống, môi trường, dịch bệnh …chỉ có khắc phục được những tồn tại đó mới có thểkhai thác triệt để và hiệu quả những lợi ích kinh tế mà nuôi trồng thuỷ sản đem lại

Chung quy lại những tồn tại đó sẽ được khắc phục một phần rất đáng kể nếugiải quyết tốt vấn đề thức ăn Sử dụng thức ăn tươi sống và đặc biệt là vi tảo hiện nayđang được coi là một trong những hướng ứng dụng có triển vọng nhất Bởi lẽ, vi tảonắm giữ nhiều lợi thế trong vai tr ò làm nguồn thức ăn cho các đối tượng nuôi thuỷsản Vi tảo không gây ô nhiễm môi trường nước, về khía cạch dinh dưỡng thì nó cungcấp đầy đủ các vitamin,chất khoáng, vi lượng, bên cạnh đó chúng còn chứa nhiều cácacid béo không no Từ đó sẽ cung cấp đầy đủ dưỡng chất, tăng sức đề kháng cho vậtnuôi thuỷ sản Ngoài ra, vi tảo còn có phổ kích thước rộng, phù hợp với cỡ mồi củanhiều đối tượng ở nhiều giai đoạn phát triển Cũng chính vì vậy vi tảo (và đặc biệt làtảo đơn bào) đã càng khẳng định là thức ăn tươi sống tốt nhất cho nhiều động vậtnuôi thuỷ sản, đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng và các động vật phù du

Đã có hàng trăm loài tảo được sử thử nghiệm làm thức ăn, nhưng cho đếnnay chỉ có khoảng 20 loài tảo đơn bào được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủysản (Brown, 2002) [13], bởi lẽ tảo đơn bào có giá trị trong nuôi trồng thủy sản phải

có kích thước phù hợp (1 – 15m cho những loài ăn lọc và 10 – 100m cho nhữngloài khác) và phải được tiêu hóa dễ dàng, không chứa các độc tố, cũng như dễ nuôi

trồng… Và trong các loài tảo đó thì Chlorella là đại diện tiêu biểu nhất (trích theo

Nguyễn Thị Xuân Thu và ctv, 2004) [6]

Cho đến nay, nguồn thức ăn là vi tảo còn gặp những khó khăn nhất định Đại

đa số các chủng vi tảo phải nhập nội , không phải những loài có nguồn gốc bản địaViệt Nam, hạn chế của các chủng này nằm ở chỗ điều kiện khí hậu ở n ước ta cónhiều điểm khác biệt so với điều kiện khí hậu ở một số n ước đồng thời không ho àntoàn chủ động về nguồn cung cấp, giá thành lại cao, dẫn tới hiệu quả của sản xuấtkinh doanh giảm sút Ngược lại, hầu hết những chủng vi tảo có nguồn gốc bản địađang được sử dụng đều không thuần khiết, tạp và nhiễm khuẩn nhiều, kèm theo đó

là ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta chưa có sự thống nhất chỉ đạo về các nguồngiống vi tảo, chưa có các bộ phận quản lý và cung cấp giống chuẩn Bên cạnh đó,các công trình nghiên c ứu trên tảo trong nước chủ yếu thiên về các kỹ thuật nuôi thusinh khối mà các nghiên cứu, phân lập và lưu giữ các giống tảo thuần chủng c ònhạn chế cả về số lượng lẫn chất lượng

Để phần nào giải quyết những tồn tại trên, cũng như tạo thêm cơ sở chonhiệm vụ điều tra, phân lập và lựa chọn những chủng vi tảo có giá trị, làm thức ăncho các đối tượng nuôi trồng thủy sả n và đồng thời là cơ sở giữ giống, cung cấpgiống thuần cho các trại sản xuất, chúng tôi thực hiện đề tài:

“ Phân lập và lưu giữ tảo giống thuần chủng Chlorella sp nước mặn làm

thức ăn cho các đối tượng nuôi thủy sản ”

Để góp phần hoàn thiện quy trình phân lập và lưu giữ thuần chủng Chlorella

sp nước mặn chúng tôi tiến hành thực hiện 2 nội dung chính nh ư sau:

 Phân lập Chlorella sp nước mặn bằng 2 phương pháp khác nhau (phương pháp

pha loãng và phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch), trên 2 môi trường dinhdưỡng (F/2 và TH.04)

 Lưu giữ Chlorella sp thuần chủng bằng 2 phương pháp (phương pháp lưu giữ

trong môi trường lỏng và trong môi trường bán lỏng), trên 2 môi trường dinh dưỡng(là F/2 và TH.04), và ở 2 nhiệt độ khác nhau (nhiệt độ 7 – 80C và 300C

Đề tài có những mục tiêu sau:

 Phân lập Chlorella sp nước mặn thuần chủng.

 Xác định các điều kiện lưu giữ thích hợp nhất đối với loài

Đề tài có các ý nghĩa:

 Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu các thông số khoa học ph ù hợp làm cơ sở khoa

học xây dựng quy trình phân lập và lưu giữ tảo thuần chủng Chlorella sp nước mặn.

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Góp phần vào việc tạo ra dòng tảo thuần chủng cung

cấp giống cho các trại sản xuất, đồng thời lưu giữ giống Chlorella sp hiệu quả hơn.

Chương 2: TỔNG LUẬN

2.1 Hệ thống phân loại và đặc điểm sinh học Chlorella sp

2.1.1 Hệ thống phân loại

Theo Komapoenko và Vasilieva (người Nga), năm 1978 (trích theo Vũ Thị

Thùy Minh, 2006) [12] thì vị trí phân loại của Chlorella sp được xác định như sau:

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Chlorella sp

Tảo lục Chlorella sp hay được gọi là rong tiểu cầu, có cấu trúc cơ thể dạng

monas đơn bào hình trứng, hình tròn hay hình ôvan Đường kính tế bào không vượtquá 15m trung bình khoảng 5 – 10 m Tế bào không có roi nên không có kh ảnăng di động

Đa số tế bào có một nhân, nhân gồm có màng dịch nhân, hạch nhân và mạnglưới nhiễm sắc Sắc tố quang hợp chỉ có một thể sắc tố chloroplast v à có dạng hìnhchén Lục lạp được bao phủ bởi một lớp m àng mỏng kép, bên trong chứa dịchprotein gọi là chất nền (matrix) và những cấu trúc dạng bản mỏng hay l à lamen Lạplục là nơi duy nhất trong tế bào tích lũy tinh bột, tinh bột tập trung xung quanh c ơquan chuyên hóa được gọi là pyreoit hay hạt tạo bột

Chất dự trữ của vi tảo Chlorella sp là tinh bột.

2.1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng

Cũng giống như đại đa số các loài tảo đơn bào khác, Chlorella sp cũng có 5

pha trong chu trình sinh tr ưởng, đó là:

- Pha gia tốc dương: Trong giai đoạn này vi tảo bắt đầu có sự tiếp xúc v à dầnthích nghi với môi trường sống Cơ thể tiến hành hấp thu các chất dinh d ưỡng vàphân cắt các tế bào Ở môi trường sống thuận lợi, dinh dưỡng phong phú th ìquần thể tảo có tốc độ sinh tr ưởng nhanh Song, do số lượng tảo giống ít nên sựtăng số lượng vi tảo trong một đ ơn vị thời gian là không lớn, dẫn đến sinh trưởngquần thể chậm

- Pha logarit: Sau pha gia tốc dương, mật độ vi tảo đã đạt đến một số lượng nhấtđịnh, bên cạnh đó môi trường còn thuận lợi cho sự phát triển , vi tảo đẩy mạnh quátrình hấp thu các chất dinh d ưỡng và gia tăng tốc độ sinh trưởng Do vậy ở pha nàythì mật độ cũng như sinh khối tế bào tăng lên với tốc độ nhanh nhất

- Pha gia tốc âm: Số lượng vi tảo đã đạt đến một lượng nhất định Môi trường đãbắt đầu bất lợi cho vi tảo phát triển nhất l à yếu tố dinh dưỡng Do đó tốc độ sinhtrưởng đã chậm hơn so với pha logarit

- Pha cân bằng: Sinh khối tảo đã đạt đến ngưỡng cực đại quá trình quang hợpcũng như phân chia tế bào vẫn diễn ra song số lượng tế bào sinh ra và chết đi gầnnhư cân bằng Do vậy sinh khối của quần thể vi tảo không có s ư tăng lên

- Pha tàn lụi: Sau khi sinh khối tảo đạt cực đại, yếu tố môi trường đã trở nên bấtlợi hơn nhiều Khả năng hấp thu chất dinh dưỡng và sinh sản của vi tảo giảm đi r õrệt, do vậy sinh khối tảo mất dần đi sau giá trị cực đại

Hình 2.1: Đường cong sinh trưởng quần thể vi tảo.

Trong điều kiện nuôi trồng, mật độ tảo tăng lên, môi trường nghèo chất dinhdưỡng và tích lũy các chất thải trong quá trình sống đã làm chậm lại nhịp điệu phân

chia tế bào và tích lũy sinh khối Tóm lại, tốc độ sinh trưởng của vi tảo Chlorella sp

phụ thuộc vào các yếu tố sau:

- Yếu tố bên trong: Trạng thái sinh lý, giai đoạn phát triển của tế bào

- Yếu tố bên ngoài: Môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, khả năngkhuấy đảo, hàm lượng CO2 Vấn đề này được đề cập nhiều trong những công trìnhnghiên cứu của Muzapharov, Taybaev (1974) và Dovorakova (1963) (trích TheoTrần Thị Tho, 1999) [9]

2.1.2.3 Đặc điểm sinh sản

Chlorella sp sinh sản vô tính, các quá trình sinh sản được tiến hành nhờ vào

cơ thể tế bào mẹ sản sinh ra các tự b ào tử (autospore) Tế bào mẹ phân chia ra 2, 4,

8, 16, 32 thậm chí có trường hợp tạo ra 64 tự b ào tử Kết thúc sự phân chia, tự bào

tử tách ra khỏi tế bào bằng cách phá hủy màng tế bào mẹ Các tế bào con này lớnlên đến giai đoạn chín sinh dục , các quá trình được thực hiện lại từ đầu

Qua tính toán, người ta xác định rằng muốn tăng sinh khối l ên gấp đôi trong

điều kiện tối ưu, Chlorella sp cần từ 4 – 6 giờ Điều chú ý là với những thời kỳ phát

N: Mật độ tế bàot: Thời gian

t

12

4

triển nhất định của tế bào, vi tảo cần ở các chế độ sáng, tối khác nhau Ví dụ ở phasinh trưởng tảo rất cần đến ánh sáng th ì trong quá trình phóng tự bào tử ra môi trườnglại thường tiến hành trong bóng tối Hiện tượng này có thể giúp cho việc làm trẻ đồng

bộ toàn bộ tế bào tảo trong việc nuôi trồng trên diện rộng (Trần Văn Vỹ, 1995) [10]

2.1.2.4 Phân bố

Chlorella được phân bố ở khắp n ơi trên thế giới, chúng là một loài rộng

nhiệt (Pauw và CTV, 1983 Trích theo Vũ Thị Thùy Minh, 2006) [12] và có mặt

ở cả 3 thủy vực n ước mặn, nước lợ và nước ngọt Đặc biệt là xuất hiện nhiều ởthủy vực giàu dinh dưỡng

2.1.3 Thành phần sinh hoá của vi tảo lục Chlorella sp

Thành phần sinh hóa của các lo ài vi tảo khác nhau thì khác nhau Bên cạnh

đó, còn có sự khác nhau về thành phần sinh hóa của cùng một loài tảo ở các giaiđoạn phát triển trong chu kỳ sinh trưởng, phát triển của chúng (Trần Thị Tho và ctv)

9 Ngoài ra, thành phần sinh hoá của vi tảo c òn phụ thuộc nhiều vào tốc độ sửdụng các chất dinh dưỡng trong môi trường sống, cũng như trong các điều kiện nuôi

cụ thể (Enright & ctv, 1986 và Brow & ctv, 1997) [14] Kết quả nghiên cứu củaRenaud, Thinh & Parry (năm 1999) [17] chỉ ra rằng vi tảo phát triển đến cuối phalogarit thường chứa 30 – 40% protein, 10 – 20 % lipid và 5 – 10% carbohydrate.Khi qua pha cân bằng thì hàm lượng này bị thay đổi rất lớn Mối liên quan giữathành phần dinh dưỡng với hàm lượng Lipid tổng cộng, Carbohydrate và Proteinkhông được thể hiện rõ (Web & Chu, 1981; Brow, 2002 Trích theo Nguyễn ThịXuân Thu và CTV, 2004) [6]

Ngoài ra Chlorella sp cũng như một số loài vi tảo ưa đạm khác thì thành

phần sinh hóa của chúng còn phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của Nitơ trong môitrường sống Chính từ đó, sự biến thiên hàm lượng Protein trong thành phần sinhhóa của các loài vi tảo này tỷ lệ thuận với hàm lượng Nitơ có mặt trong môi trường

sống của chúng Dưới đây là thành phần sinh hoá của Chlorella sp (theo Đặng Đình

Kim, 1998) [2]

Bảng 2.1: Thành phần sinh hoá của Chlorella sp.

3.60 – 6.602.200.586.0010.00 – 34.00

Vitamin B1Vitamin CVitamin KVitamin B6Vitamin B2Vitamin B12NiacinAcid nicotinic

1800.0030.00– 60.00600

2.33.5

700 – 900250010000

2.1.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của vi tảo

2.1.4.1 Ánh sáng

Ánh sáng là yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh tr ưởng và phát triển của

vi tảo Là nguồn năng lượng chính cho quá tr ình quang hợp của chúng Ảnh hưởngcủa ánh sáng được biểu hiện ở khía cạnh chất lượng ánh sáng (phổ màu), cường độánh sáng và thời gian chiếu sáng (chu kỳ quang) (Thịnh 1991 Trích theo Trần ThịThanh Nga, 2005) [8]

Hầu hết các loài vi tảo sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản đều thích hợp vớiánh sáng cường độ thấp từ 50 đến 300 µEm-2s-1, và thời gian chiếu sáng từ 12 – 18h/ngày (trích theo Bùi Thị Vân, 2007) [1]

Thông thường, các bình tảo giống phát triển rất tốt trong điều kiện nuôi cómái che hay trong phòng thí nghi ệm bởi vì trong các điều kiện như vậy, lượng ánh

sáng khuyếch tán vào, đủ cho tảo giống quang hợp và phát triển Ngược lại khi nuôitảo trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời thì tảo có thể không hoặc là kém phát triển vàđôi khi là chết Nếu mật độ tảo đạt khá cao cộng với đặc tính riêng của loài là chịuđược cường độ ánh sáng mạnh thì tảo vẫn có thể sinh trưởng và phát triển Song sốlượng các loài như vậy là không nhiều Một điểm đáng chú ý là một số loài vi tảokhông tăng trưởng trong điều kiện chiếu sáng li ên tục (Brand và Guillard, 1981.Trích theo Thinh, 1999) [17] và bên cạnh đó thì ánh sáng liên tục không nhữngkhông làm tăng năng su ất của tảo mà còn làm giảm hàm lượng protein,cacbonhydrat, và các acid béo không no HUFA (Hoàng Thị Bích Mai, 1995) [4].

Bảng 2.2: Môi trường tối ưu để nuôi một số loài tảo (Nguyễn Thị Xuân Thu và

ctv, 2004) [6].

Điều kiện nuôi

tên loài

Cường độ ánhsáng (lux) Nhiệt độ (

0C) Độ mặn (0/00) pH

2.1.4.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của tất cả cácsinh vật sống hiện hữu trên trái đất Riêng đối với vi tảo thì nhiệt độ tác động đếnsinh trưởng và phát triển của chúng thông qua 2 yếu tố là sự tác động lên cấu trúc tếbào và ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng trao đổi chất (tác động này kéo theo sự thayđổi về tốc độ sinh trưởng, quá trình quang hợp, mật độ tảo, cường độ hô hấp, kíchthước tế bào và sự thích nghi của chúng đối với môi tr ường sống) của vi tảo Nhiệt

độ trong khoảng 16 – 300C là khoảng nhiệt độ mà tại đó tảo có thể duy tr ì sự sống,

ở ngoài ngưỡng nhiệt độ này sự sinh trưởng phát triển của có thể thấp hay không có,nếu vượt xa thì tảo có thể bị chết Bên cạnh đó, khoảng nhiệt độ thích hợp cho sựsinh trưởng phát triển của đại đa số các lo ài vi tảo nằm trong khoảng 20 – 25 0C(Coutteau, 1996 Trích theo Bùi Thị Vân, 2007 [1]

Riêng đối với vi tảo Chlorella sp, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh tr ưởng phát

triển là vào khoảng 250C (Nguyễn Thị Xuân Thu và ctv, 1998), còn giới hạn nhịêt

độ của Chlorella sp nằm trong khoảng khá rộng 10 – 360C

Trong điều kiện sản xuất đại trà vi tảo, nhiệt độ đóng vai trò đặc biệt quantrọng Chính vì vậy, việc chọn các chủng vi tảo chịu nhiệt có ý nghĩa rất lớn đếnnăng suất của tảo Mặt khác nhiệt độ thấp cũng có nhiều ảnh h ưởng xấu đến sinhtrưởng của tảo Ví dụ: Ono và Murata đã giả thiết cơ chế tác động của nhiệt độ thấp

ở tảo Anacystis nidulans là do sự phân rã của lớp lipid kép của m àng nguyên sinh

chất dẫn đến việc thẩm thấu cá c ion và các chất hoà tan trong phân tử lượng thấp ramôi trường Điều này dẫn đến việc làm giảm hoạt tính sinh lý của chính tế bào.Cũng chính vì lý do này, cộng với đặc thù về điều kiện khí hậu n ước ta có nhiềuđiểm khác với nhiều nước, thì nhập nội vi tảo phục vụ cho nuôi trồng thuỷ sảnkhông phải là giải pháp hiệu quả và toàn diện Hướng giải quyết được xem là hiệuquả và thuyết phục nhất hiện nay cho nghề nuôi trồng thuỷ sản xét ở khía cạnh vitảo là cần tạo ra các giống tảo thuần chủng có nguồn gốc bả n địa, chỉ có như vậy

mới đảm bảo được tính lâu dài và nâng cao hiệu quả sử dụng vi tảo cho nghề nuôitrồng thuỷ sản ở nước ta.

2.1.4.3 Độ mặn

Phổ chịu muối của tảo biển l à rất lớn Tuy vậy, các loài tảo khác nhau thì khảnăng thích nghi của chúng với các độ mặn cũng khác nhau Có những loài tảo chỉ cóthể tồn tai ở độ mặn v ài ppt nhưng ngược lại có những loài có thể sống trong điềukiện muối bão hoà (Đặng Đình Kim, 1998) [2] Để sống được trong các điều kiệnmôi trường như vậy vi tảo cần có thêm những cơ chế tạo thêm ra năng lượng đểtổng hợp các chất có chức năng điều ho à áp suất thẩm thấu (osmotica ), duy trì cânbằng nội môi Đó là sản sinh ra các chất có vai tr ò điều hoà áp suất thẩm thấu cho

cơ thể như glycerol, sucrose và prolin Trong trường hợp này, nồng độ của các chất

đó trong cơ thể vi tảo tỷ lệ thuận với nồng độ muối (NaCl) trong môi trường sống.Bên cạnh việc tổng hợp các chất n ày, khi độ mặn môi trường sống tăng cao c ơ thểtảo cũng tích luỹ thêm β– caroten Việc tĩch luỹ thêm β– caroten không chỉ giúp vitảo tồn tại được trong điều kiện môi tr ường sống có độ mặn cao m à còn giúp chúngthích nghi trong khi môi trư ờng nghèo dinh dưỡng đạm

Độ mặn tăng cao không chỉ ảnh h ưởng đến cơ chế điều hoà áp suất thẩmthấu mà nó còn ảnh hưởng rất lớn và trực tiếp đến hoạt tính quang hợp v à hô hấpcủa tảo (Đặng Đình Kim, 1998) [2]

Riêng đối với Chlorella sp là một loài tảo rộng muối song với độ muối trong

khoảng 25 – 300/00là khoảng độ mặn thích hợp nhất cho sự phát triển

2.1.4.4 Ảnh hưởng của pH

pH trong môi trường nước có ảnh hưởng rất lớn đến nhiều quá tr ình sinh họccủa các sinh vật sống trong đó Đối với vi tảo thì pH được coi là yếu tố gây biến đổinội tại Trước tiên thì sự biến đổi của nhiệt độ , ánh sáng đều gây tác động đến pHthông qua quá trình quang h ợp của vi tảo Đây được coi như tác động trở lại của vi

tảo tới môi trường sống thông qua pH Ở một số loài tảo độc (như Microcytis aeruginosa) thì pH trong môi trường nước có ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng độc

tố có trong cơ thể (hàm lượng độc tố trong Microcytis aeruginosa cao hơn khi pH

môi trường thấp hơn giá trị tối ưu)

Đặc biệt pH có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh tr ưởng và phát triển của vi tảogián tiếp thông qua các chỉ số môi tr ường như: Độ kiềm, khí độc (chủ yếu là H2S)

và khả năng phân ly của cũng nh ư tính hoà tan của muối (bao gồm NaCl và cácmuối dinh dưỡng khác) …

Các tác động của yếu tố pH lên cơ thể tảo được quan sát rõ nhất tại các thuỷvực có mật độ tảo cao nh ư ao phú dưỡng, ao nuôi thuỷ sản Trong trường hợp này,

pH thể hiện vai trò quyết định đến sự thành phần, mật độ của các loài tảo có trongthuỷ vực đó

pH quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của tảo Mỗiloài tảo đều có khoảng dao động pH thích hợp nhất cho sự phát triển Và đại đa sốcác loài tảo đều có khoảng pH thích hợp nhất là 8.2 – 8.7 (Ukeles, 1971 Trích theoFulks và Main 1991) [15], song bên cạnh đó, một số loài tảo có khả năng chịu được

khoảng dao động pH rất lớn như Isochrysis gallabana có thể phát triển tốt trong

khoảng dao động pH là 5 – 9 (Fulk và Main, 1991) [15]

2.1.4.5 Ảnh hưởng của hàm lượng khí Cacbonic (CO 2 )

Tảo cầu Chlorella sinh trưởng và phát triển rất nhanh chóng trong điều kiện

môi trường thích hợp (Trần Thi Tho, 1998) [9] Khi cường độ quang hợp mạnh , tảothải Oxy và cần một lượng lớn khí Cacbonic Bởi vậy hàm lượng khí Cacbonic cótrong môi trường nuôi ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển vi tảo và việc

bổ sung CO2 vào dung dịch nuôi là điều cần thiết Song không phải hàm lượng CO2càng cao thì mật độ tảo đạt đến càng cao mà ngược lại khi hàm lượng CO2 vượt quávới ngưỡng cho phép thì lại làm hạn chế tốc độ sinh tr ưởng của tảo (ngưỡngcacbonic trong môi trư ờng nuôi từ 5 – 10 % không làm tăng năng suất của tảo)(theo Vũ Thị Thùy Minh, 2005) [12]

Theo Mukaelan (1968) năng suất của vi tảo Chlorella sp trong điều kiện nuôi

sẽ tăng cao nều bổ sung 2 – 3 % lượng khí CO2

Như vậy hàm lượng cacbonic tăng thích hợp th ì năng suất của Chlorella sp

sẽ tăng một cách rõ rệt và có thể gấp nhiều lần so với không sục th êm nó

2.1.4.6 Ảnh hưởng của khuấy sục

Năng suất của tảo phụ thuộc nhi ều vào khuấy đảo huyền phù trong bể nuôi.Nhờ có khuấy đảo các chất dinh d ưỡng phân bố đều trong môi trường, đồng thời tảotiếp xúc với nhiều ánh s áng và làm tảo khỏi vị lắng Người ta thường dùng các động

cơ để tạo dòng chảy hoặc dùng bàn trang khuấy sục trong bể nuôi Cũng có thểdùng biện pháp thổi khí để khuấy đảo dịch tảo v à mang lại hiệu quả tốt Khi khuấyđảo dịch tảo bằng máy b ơm có công suất khác nhau thì cũng thu được những kếtquả khác nhau

2.1.4.7 Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh d ưỡng

Các yếu tố dinh dưỡng là một trong những yếu tố quan trọng nhất , có tínhquyết định đến sinh trưởng và phát triển của vi tảo cả về số l ượng lẫn chất lượng.Nắm bắt được các nhu cầu dinh d ưỡng này và bổ sung vào môi trường nuôi giúp thuđược sinh khối tảo có mật độ có thể cao h ơn rất nhiều so với ngoài tự nhiên Thànhphần dinh dưỡng cần thiết cho vi tảo bao gồm th ành phần đa lượng (nitơ, phốt pho,silic ), thành phần vi lượng (thành phần giúp ích cho quá tr ình trao đổi, hấp thu cácchất dinh dưỡng) và một số các vitamin (nâng cao chất lượng vi tảo)

Các loài tảo khác nhau có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Việc tìm ra môitrường dinh dưỡng thích hợp cho các loài tảo sẽ đưa đến thành công về sau trong

công nghệ vi tảo, đặc biệt là vi tảo trong nuôi trồng thuỷ sản Riêng đối với Chlorella

sp, có rất nhiều môi trường dinh dưỡng đã được nghiên cứu, ứng dụng vào thực tế

trong từng điều kiện cụ thể điển h ình như: môi trường kum, môi trường F/2, môitrường Eminson và Lius, môi trường của J M kain và G E Fogg (1958)…Thực tế

có sự khác nhau về thành phần dinh dưỡng trong các môi trường này đối với cùngmột đối tượng ở các nơi khác nhau Sự khác nhau đó xuất phát từ nguồn dinh dưỡngsẵn có trong các thuỷ vực tự nhi ên mà chúng sinh sống Trong điều kiện cụ thể ở Việt

Nam và trên đối tượng Chlorella sp nước mặn, môi trường dinh dưỡng TH.04 được

xem là môi trường thích hợp nhất, đã và đang được sử dụng rộng rãi trong các trungtâm, các viện nghiên cứu và các trại sản xuất trong cả nước.

 Nitơ:

Nhu cầu dinh dưỡng nitơ là một trong những nhu cầu dinh d ưỡng rất quantrọng đối với vi tảo Trong đó, 1 – 10 % nhu cầu nitơ cho cấu trúc cơ thể và cònphần lại phục vụ cho nhu cầu sinh tr ưởng và phát triển cơ thể Chỉ một số ít loài vi

tảo có khả năng cố định nit ơ (Prokaryot) còn lại hầu hết các loài tảo chỉ có thể sử

dụng nitơ dưới dạng NO3-và NH4+

Khi mà amôn được sử dụng như một nguồn nitơ duy nhất cho tảo thì pH môitrường sẽ giảm nhanh gây ra một số hiệu ứng phụ ảnh h ưởng tới sinh trưởng củatảo Nitrit cũng được một số loài tảo sử dụng nhưng chỉ với nồng độ rẩt thấp(khoảng 1 mM)

Bên cạnh đó, nhiều loài tảo sử dụng các hợp chất nit ơ như amid, ure,glutamin, asparagin, các acid amin như glyxin , serin, alanin, acid glutamic, acidaspactic…làm nguồn cung cấp đạm phục vụ cho các hoạt động sống của chúng

Hàm lượng nitơ cũng rất khác nhau cho từn g loài tảo, Chaetoceros gracilis là

12 41 – 17.41 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006 Trích theo Bùi Thị Vân, 2007) [1],

Navicula sp và Nizschia sp là 10 – 45 ppm và tốt nhất ở 30 ppm Đối với Chlorella

sp thì nhu cầu này là 0.7 – 1.2 ppm (Trần Thị Thanh Nga, 2005) [8]

 Photpho (P):

Nhu cầu dinh dưỡng photpho cũng là một nhu cầu dinh dưỡng không thểthiếu đối với vi tảo P có vai trò quan trọng trong đa số các quá trình xảy ra ở tế bào,đặc biệt quá trình chuyển hoá năng lượng và tổng hợp acid nucleic Vai trò của Pđối với trao đổi chất ở vi tảo l à vấn đề được quan tâm nhiều nhất do nó l à thànhphần của nhiều hợp chất hữu c ơ có vai trò là khâu chuyển hoá trung gian hoặcnhững chất có ý nghĩa then chốt trong trao đổi chất , trao đổi năng lượng của tế bàotảo Cũng từ đó, P trở thành yếu tố giới hạn sinh trưởng trong tự nhiên

Trong môi trường nước thì P hữu cơ ít được vi tảo sử dụng trực tiếp m àthông thường tảo sử dụng nhiều P vô cơ Đại đa số các loài tảo có thể sử dụng Phữu cơ thông qua các ph ản ứng thuỷ phân bởi các enzyme ngoại bào(phosphoestetrase, photphatase) để chuyển sang dạng P vô cơ (theo Đặng ĐìnhKim, 1998) [2].

Tảo lục có nhu cầu phôt pho cao nhất so với các loài tảo khác, khoảng từ 0.1

– 0.3 ppm (Gusev, 1952) Riêng đối với Chlorella sp thì hàm lượng P cần bổ sung

thích hợp nhất là từ 0.25 ppm (Trần Thị Thanh Nga, 2005) [8]

 Nhu cầu vi lượng:

Các vi lượng được coi là không thể thiếu đối với vi tảo là Fe, Mn, Cu, Mo,

và Cl Và một số loài tảo đặc biệt có nhu cầu vi l ượng quan trọng là Co, B, V, Si,I…cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển

 Fe tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ thông qua hợp chất ferredoxin Đây

là hợp chất cho điện tử trong hoạt động của nitrate reductase v à nitrite reductase.Ngoài ra, Fe rất quan trọng đối với quá tr ình quang hợp vì tác động đến quá trìnhsinh tổng hợp chlorophyll a , C – phycocyanin và cytoctom

 Mn và Cu là các yếu tố quan trọng trong hệ truyền điện tử quang hợp cầncho tất cả các loại tảo Các nguyên tố này cũng tham gia vào hoạt động tế bào với tưcách là thành phần hoặc cofactor của enzyme

 B cần cho một số tảo lam v à tảo silíc, trong khi Mo tham gia vào quá trình

cố định nitơ và là thành phần của nitrat reductase Vanadi là thành phần không thểthiếu đối với sinh trưởng của tảo lục hầu hết các loài tảo biển Coban và một sốvitamin cần cho sinh trưởng của một số loài tảo silic

 Silic đặc biệt cần cho các lo ài tảo thuộc nhóm tảo silíc , bởi lẽ silic vừa làyếu tố tạo sinh vừa là nguyên tố tạo nên lớp vỏ silic của nhóm tảo n ày (NguyễnTrọng Nho, 1972) [7] Bên cạnh đó silic cũng cần thiết cho sự phát triển của tảokhuê Bằng chứng là trong các thuỷ vực tồn tại nhiều tảo khu ê thì trong thời kỳ tảo

khuê phát triển mạnh thì hàm lượng silic sẽ giảm nhiều (theo Đặng Đình Kim,1998) [2].

2.2 Vài nét về tình hình phân lập và lưu giữ giống tảo

2.2.1 Phương pháp phân lập tảo giống thuần chủng

Theo Hans R và Robert A, 2005 [16] thì môi trường nuôi và phương phápnuôi được nghiên cứu và mô tả từ rất sớm, từ những năm 1800 – 1900 Và trong số

đó thì Chlorella sp là một đại diện tiêu biểu nhất Nhìn chung, các công trình nghiên

cứu vi tảo chủ yếu tập trung vào mô tả thu nuôi sinh khối mà ít đề cập đến phân lập

thuần chủng chúng như thế nào Song, riêng với Chlorella sp thì ngược lại, nó sớm

nhận được sự quan tâm chú ý của nhiều nh à khoa học trong nước cũng như trên thếgiới Bằng chứng là nó được phân lập thành dòng thuần chủng sớm nhất, từ nhữngnăm 1890 bởi Beijerinck

Mặc dù vậy, không chỉ riêng Chlorella sp mà hầu hết các loài vi tảo khác

đều chưa có hệ thống hoàn chỉnh về phương pháp cũng như môi trường cho phânlập Đặc biệt là công nghệ vi tảo ở Việt Nam

Những năm gần đây (2007) trường đại học Murdoch (Úc) đã đưa ra 4phương pháp phân lập giống tảo: Phương pháp pha loãng, phương pháp nuôi c ấytrên môi trường đặc, phương pháp nhặt tế bào bằng Micropipette và phương pháplàm giàu Còn ở Việt Nam, theo TS vi tảo Hoàng Thị Bích Mai (1995) [4] ngoài 4phương pháp trên bà c òn đề cập tới phương pháp lọc bằng các màng lọc với kích cỡ

lỗ màng khác nhau

 Về phương pháp pha loãng:

 Phương pháp này gắn liền với thành công đầu tiên trong lịch sử phân lập

giống tảo thuần chủng trên đối tượng Chlorella sp bởi Beijenck Ông đã giới thiệu

kỹ thuật nuôi tảo trong môi tr ường hỗn hợp (nước muối, muối dinh dưỡng vàgelatin) Sau đó 3 năm, (tức năm 1893) cùng với phương pháp đó của mình ông đã

phân lập thành công được 2 loài tảo lục (Chlorella và Scenedesmus) và một số loài tảo khác như tảo vàng Trebauxia, tảo lam Anabana…

 Nhà vi tảo học người Pháp Miquel cũng được xem là người có nhiều đónggóp cho công nghệ vi tảo Ông đã tiến hành nhiều thí nghiệm pha lo ãng tảo tạptrong môi trường có chứa các nguyên tố khoáng khác nhau để phân lập một số lo àitảo silic trung tâm, tuy nhi ên độ thuần chủng còn rất thấp Cũng bằng phương phápnày, năm 1926 - 1960, Richter (người Đức) cũng đã phân lập được một số loài tảothuộc các bộ Vovocales, Euglenales, Cryptomonadales…còn tại Trung Quốc, Guo

và ctv (1959) đã phân lập thành công 2 loài tảo đơn bào Tetraselmis sp và Dunaliella sp (trích theo Hà Lê Thị Lộc, 2000) [3].

 Ở Việt Nam, phương pháp pha loãng như là một phương pháp “cổ truyền”

đã và đang được áp dụng nhiều nhất trong các công tr ình nghiên cứu Trong số đó

phải kể đến công trình phân lập và nuôi đại trà tảo silic trung tâm Skeletonema costatum làm thức ăn cho ấu trùng tôm của trại giống non nước Đà Nẵng (năm

1989) Thành công của công trình nghiên cứu này cũng đã mở ra nhiều hướng trongnghiên cứu phân lập tảo giống ở việt nam

 Kế đó phải kể đến công trình tương đối hoàn thiện của Nguyễn Thị XuânThu, Nguyễn Thị Bích Ngọc và Nguyễn Thị Hương (2004) [6] Trong công trìnhnày, các tác giả đã mô tả khá đầy đủ và hoàn thiện quy trình sản xuất các vi tảo từphân lập, lưu giữ và gây nuôi thu sinh khối Trong đó phương pháp pha lo ãng được

sử dụng nhiều nhất cho phân lập và trên nhiều đối tượng như Chlorella sp, Platymonas, Chaetoceross muelleri, cho hiệu quả tương đối cao Tuy nhiên trong

báo cáo của mình, các tác giả không mô tả chi tiết các kết quả phân lập thu được,đồng thời hầu hết các giống tảo đều l à nhập nội (Trung Quốc, Philipine, Đan Mạch,Úc…) mà không phải có nguồn gốc bản địa ở Việt Nam

 Năm 2007, Bùi Thị Vân công bố một cách khá bài bản và chi tiết quy trình

cũng như kết quả phân lập và lưu giữ 2 loài tảo silic lông chim sống đáy là Navicula

sp và Nizschia sp Với 2 phương pháp phân l ập là pha loãng và nuôi cấy trên môi

trường đặc Kết quả cho thấy phân lập pha lo ãng 2 loài vi tảo này là đạt hiệu quảcao hơn so với phương pháp cấy trên môi trường đặc

Riêng Chlorella sp vài năm trở lại đây đã có nhiều công trình nghiên cứu có

đề cập đến công tác phân lập thuần chủng lo ài tảo này như của Trần Thị Thanh Nga(2005); của Vũ Thị Thùy Minh (2006) Đặc biệt trong đó là công trình của Trần ThịThanh Nga đã mô tả tương đối đầy đủ các thao tác cũng nh ư kết quả của 2 phươngpháp phân lập pha loãng và nuôi cấy trên môi trường đặc Ngược lại với kết quả của

Bùi Thị Vân, cả 2 tác giả đều đi đến chung một kết luận l à phân lập Chlorella sp

bằng phương pháp pha loãng là kém hiệu quả hơn so với phương pháp nuôi cấy trênmôi trường đặc

 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc

 Với phương pháp phân lập tảo thuần chủng bằng cách trộn agar, acid axeticloãng với môi trường giàu dinh dưỡng, sau đó đổ vào các đĩa Petri và nuôi trongphòng thí nghiệm, Ward (người Mỹ, năm 1899 - 1942) đã được xem là người đầutiên phân lập tảo thành công trên bề mặt môi trường đặc Mặc dù vậy, với phươngpháp này, ông cũng chỉ thành công trên một số ít đối tượng

 Kế tiếp Ward, năm 1900 Winkler đã tiến hành thu mẫu tảo vùng nước ngọtxung quanh nhà và ông đ ã thuần chủng được một số loài tảo nước ngọt cũng bằngphương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch Đồng thời, ông cũng tìm ra môitrường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của chúng v à nuôi ở các thể tích khácnhau

 Ở Việt Nam, cùng với phương pháp pha loãng, phân lập bằng phương phápnuôi cấy trên môi trường thạch cũng đã được sử dụng một cách phổ biến Tuynhiên, với từng đối tượng cụ thể thì hiệu quả của phương pháp này là rất khác nhau.(theo kết quả trong công trình của Bùi Thị Vân, của Trần Thị Thanh Nga và Vũ Thị

Thùy Minh) Riêng với Chlorella sp thì phương pháp này (phương pháp nuôi c ấy

trên môi trường đặc) cho hiệu quả cao nhất (theo Trần Thị Thanh Nga, năm 2005 và

Vũ Thị Thùy Minh, năm 2006)

 Một điểm chú ý trong phương pháp này là khi phân lập chúng, vi tảo sẽđược làm sạch hơn bằng hỗn hợp kháng sinh khi chúng bị nhiễm vi khuẩn: 100 gpeniciline + 25 g dihydrostreptomysin sulphate (theo Tôn Nữ Mỹ Nga, 2007, Tríchtheo Bùi Thị Vân, 2007) [1].

 Vào năm 1997, Comtois [16] đã phân lập nuôi thuần chủng được một số loàitảo silic với phương pháp nhặt tế bào bằng Micropipette, đây là một phương phápmới và đòi hỏi kỹ thuật khá cao Song, phương pháp này chỉ thích hợp cho nhữngđối tượng có kích thước không quá nhỏ, cơ thể có cấu tạo đơn giản (ít phần phụ) ỞViệt Nam Vũ Dũng và các ctv (năm 2000) [11] cũng đã thành công với phương

pháp này trên đối tượng là Skeketonema costatum Trong thí nghiệm của mình ông

tiến hành pha loãng mẫu tảo thu ngoài tự nhiên, sao cho trên thị trường kính hiển vi

có từ 5 – 10 chuỗi tế bào, sau đó dùng ống hút mao quản hút từng chuỗi tế b ào

S.costatum chuyển vào dung dịch môi trường nhân giống.

 Ngoài các phương pháp đó , thì vẫn còn 2 phương pháp phân lập nữa đó làphương pháp phân lập bằng màng lọc có kích thước màng khác nhau hay phươngpháp làm giàu Song, cho đến nay vẫn chưa thấy có công trình nào đạt kết quả caocông bố ở trong nước cũng như trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều loài tảo (300 – 400 loài) được phân lập,lưu giữ và nuôi thu sinh khối nhằm phục vụ nhiều lợi ích khác nhau, nh ưng chỉ cókhoảng 40 – 50 loài vi tảo trong số đó được sử dụng làm thức ăn cho các đối tượngnuôi thủy sản (trích theo Thinh, 1999) [17]

2.2.2 Về vấn đề lưu giữ tảo giống thuần chủng

Có 4 phương pháp lưu gi ữ thuần chủng các chủng vi tảo được sử dụng phổbiến hiện nay đó là: Lưu giữ trên môi trường thạch, môi trường lỏng (5 – 6 0C)trong tối, môi trường bán lỏng đặt ở điều kiện PTN, môi tr ường bán lỏng (5 – 60C)trong tối (theo TS Hoàng Thị Bích Mai, năm 1995) [4] Trong đó, môi trư ờng dinhdưỡng, yếu tố vật lý, thời gian l ưu giữ và mật độ ban đầu là những yếu tố có ảnhhưởng lớn nhất đến kết quả l ưu giữ các giống tảo Và mỗi loài tảo khác nhau thì

thích hợp ở một điều kiện l ưu giữ khác nhau Ở Việt Nam và trên đối tượng là

Chlorella sp thì cũng chưa thấy công trình nào mô tả, cũng như rút ra kết luận một

cách chi tiết vấn đề lưu giữ đối tượng này

 Phương pháp lưu giữ trên môi trường thạch:

Lấy tảo giống thuần cấy tr ên bề mặt thạch Để trong điều kiện ánh sáng dưới

2 bóng đèn neon Sau 8 – 10 ngày thấy các khuẩn lạc bắt đầu xuất hiện th ì giảmcường độ ánh sáng và để trong điều kiện nhiệt độ khoảng 20 – 220C

Phương pháp này sử dụng tốt đối với các loài tảo xanh Thời gian lưu giữ

từ 2 – 6 tháng tùy loài

 Phương pháp lưu giữ giống ở môi trường lỏng, nhiệt độ 5 – 60

C trong tối:Dịch tảo thuần được thu ở cuối pha logarit khi sức sống v à chất lượng tảo làtốt nhất Tảo được nuôi trong các ống ng hiệm, sau đó đặt vào tủ lạnh ở nhiệt độ 5 –

6 0C Phương pháp này thích hợp cho hầu hết các lo ài tảo đơn bào Thời gian lưu

giữ ngắn, thường là chỉ vài ngày (với Skeletonema, Isochrysis ), 2 – 3 tháng (với các

loài tảo xanh), và 1 – 2 tháng đối với các loài tảo khuê

 Phương pháp lưu giữ tảo ở môi trường bán lỏng, nhiệt độ 5 – 60

C, trong tối:Lấy tảo giống thuần đem nuôi trong ống nghiệm có đáy sạch Sau đem cấtvào tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 6 0C khi tảo đạt gần mật độ tối đa Đây l à phương pháptối ưu nhất cho hầu hết các loài tảo thời gian lưu giữ rất dài, 6- 8 tháng đối với các

loài tảo Heterogloea sp, Chlorella sp, Nannochlorepsis oculata và 2 – 4 tháng với các loài trong giống tảo Chaetoceros.

 Phương pháp lưu giữ tảo trong điều kiện môi tr ường bán lỏng, đặt ở điều kiệnphòng thí nghiệm:

Giống tảo thuần được nuôi trong các ống nghiệm (10 ml), giảm c ường độánh sáng khi tảo đạt đến cuối pha logarit Định kỳ hàng tuần san nửa thể tích giốnggốc sang thể tích mới Phương pháp này tốn môi trường, thời gian chăm sóc nhiều,

tảo dễ bị lẫn tạp Chủ yếu sử dụng đối với tảo Isochrysis galbana (trích theo

Nguyễn Thị Xuân Thu và CTV, 2004) [6]

2.2.3 Môi trường dinh dưỡng sử dụng cho nuôi trồng Chlorella

Có rất nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác nhau để nuôi trồng tảo lục

Chlorella đạt hiệu quả cao Đó là môi trường vô cơ thuần khiết, môi trường phân hóa

học…Môi trường hữu cơ như chiết suất phân gia cầm, phân tằm, bột cá, n ước thải sinhhoạt, bột nhộng tằm, nước tiểu…Bên cạnh đó có thể dùng hỗn hợp vô cơ lẫn hữu cơ

Muzapharov (năm 1974), đã sử dụng môi trường 04, môi trường Lênigrat,môi trường Myers và môi trường Tamiya … Trong các môi trường trên đều có đạm

ở dạng nitrat hoặc ở dạng amôni v à có hàm lượng phôt pho ở dạng PO4- Theo ýkiến của các nhà nghiên cứu, lúc đầu tảo sử dụng ở dạng amôn, sau đó l à dạng nitrat(Muzapharov và ctv, 1961 Trích Theo Trần Thị Tho, 1999) [9]

Bằng nhiều thí nghiệm các nh à khoa học đã tìm ra hàm lượng dinh dưỡng

cho môi trường 04 cải tiến thích hợp nhất để nuôi t rồng Chlorella (g/1lit dung dịch

Người ta thường áp dụng môi trường 04 cải tiến này cho các thí nghiệmtrong các dụng cụ thủy tinh hoặc nuôi ở diện hẹp Việc bổ sung các chất hữu c ơ vàomôi trường vô cơ làm tảo phát triển mạnh mẽ, l àm tốt trạng thái chung và tăng năngsuất của tảo (trích theo Trần Thị Tho, 1999) [9].

Ở Việt Nam, một số môi trường dinh dưỡng được coi là thích hợp cho

Chlorella như môi trường Provasoli, L; môi trường McLauhglin, J.J.A; v à môi

trường M.R (1957) (theo Nguyễn Thị Xuân Thu và ctv, 2004) [6] Tuy nhiên, trongmột số báo cáo gần đây về phân lập v à lưu giữ giống tảo thuần chủng th ì môi

trường TH.04 được coi là môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất đối với Chlorella

(theo Vũ Thị Thùy Minh, 2006) [12], ngoài ra môi trường dinh dưỡng Eminson

cũng được Trần Thị Thanh Nga sử dụng để phân lập Chlorella sp thuần chủng và

cũng cho hiệu quả rất cao

2.3 Ứng dụng của vi tảo trong ng ành nuôi trồng thủy sản

Trong vài năm trở lại đây, nghề nuôi thuỷ hải sản ở n ước ta đã có nhiều tínhiệu đáng mừng cho sự phát triển Nhiều công tr ình nghiên cứu thực nghiệm về sảnxuất giống và nuôi lớn các đối tượng thân mềm (Mollusca), giáp xác, và một số loài

cá biển đã thành công và mở ra nhiều triển vọng lớn Vi tảo đ ã đóng góp nhất địnhvào những thành công đó Bên cạnh những đóng góp quan trọng trong việc h ìnhthành năng suất sinh sơ cấp làm cơ sở thức ăn tươi sống cho các đối tượng nuôi thì

nó còn có vai trò không nh ỏ trong xử lý môi trường nước và tạo cân bằng sinh thái

2.3.1 Vai trò làm thức ăn tươi sống

Vi tảo (Micro algae) là những cơ thể tự dưỡng, có kích thước hiển vi sốngchủ yếu trong môi trường nước và có ý nghĩa to lớn đối với sự sống trong các thuỷvực Thông qua quá trình tự quang hợp, vi tảo hấp thụ các muối vô c ơ trong môitrường nước chuyển hoá thành các chất hữu cơ cho cơ thể Nói cách khác, vi tảo l àmắt xích đầu tiên của hệ sinh thái trong n ước tạo nên năng suất sinh học sơ cấp vàgóp phần không nhỏ trong tuần ho àn vật chất của thuỷ vực Biển cả, song ng òi, hồ

ao là môi trường sống chủ yếu của tảo, n ơi chứa đựng tiền năng to lớn về thực phẩm

và các nguồn nguyên liệu khác phục vụ cho đời sống nhân loại H àng năm có tới

200 tỷ tấn chất hữu cơ được tạo thành trên toàn thế giới, trong đó khối l ượng chấthữu cơ được tạo thành từ tảo lên đến 170 – 180 tỷ tấn (Tambiep, 1974) (trích theo

Vũ Thị Thùy Minh, 2006) Tuy vậy, trong nuôi trồng thuỷ sản, vi tảo lại đ ược xemnhư là loại thức ăn bổ dưỡng cho các vật nuôi h ơn là khối lượng các chất hữu cơkhổng lồ mà chúng tạo ra

Trước tiên, vi tảo trong nuôi trồng thuỷ sản đ ược biết đến như một loại thức

ăn tươi sống có giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt là hàm lượng protein Phân tích 40loài tảo thuộc 7 lớp (Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Prymnesiophyceae,Cryptophyceae, Eustigmatophyceae, Rhodophyceae, Prasinophyceae) Brown & ctv(1997) đã xác định được thành phần protein rất cao trong tảo đơn bào, có thể chiếmtới 52 % khối lượng cơ thể Bên cạnh đó, các acid béo không no mạch d ài (PUFA

và HUFA) có trong tảo như docosahecxaenoic (DHA), eicosapentanoic acid (EPA),arachidonic (AA) là rất quan trọng và đặc biệt cần thiết cho sự sinh trưởng, pháttriển cũng như nâng cao sức đề kháng của động vật nuôi thủy sản Theo Nguyễn ThiXuân Thu (2004) thì hầu hết các loài tảo đều chứa các loại acid béo không no EPA

ở mức độ trung bình đến cao (7 – 34 %) Lớp tảo Bacilariophyceae (Chaetoceros, Thalassiosia, Nizschia, Skeletonema), Prymnesiophyceae (Isochrysis, Paplova), Cryptophyceae (Rhodosorus), Eustisgmatophyceae (Nannochloropsis) rất giàu một

hoặc cả hai loại acid béo không no DHA v à EPA

Vi tảo làm thức ăn sẽ cung cấp nhiều loại vitamin bổ dưỡng và cần thiết chocác đối tượng nuôi thủy sản (như thiamin (B1), riboflavin (B2), pyridoxine (B6),cyanocobalamin (B12), biotin…) Ngoài ra, các khoáng ch ất và sắc tố trong tảo cũngđóng góp một vai trò quan trọng trong việc xây dựng nên giá trị dinh dưỡng của một sốloài tảo (chlorophyll, carotenoid, phycoerythin, phycocyanim, β - carotene….)

Về cách thức sử dụng vi tảo l àm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản thì đượcchia làm 2 nhóm:

 Dùng vi tảo làm thức ăn tươi sống trực tiếp: Bao gồm các loài vi tảo thuộc cácchi như Chaetoceros, Thallassiosira, Tetraselmis, Isochrysis, Chlorell, Nannochloropsis.

 Dùng vi tảo gián tiếp qua zooplankton nh ư Artemia, Brachionus, Moina, Daphnia.

2.3.2 Xử lý môi trường nước và làm cân bằng hệ sinh thái

Phát triển mạnh nuôi trồng thuỷ sản cũng kéo theo sự suy giảm t ài nguyênthiên nhiên nước Điều đáng nói ở đây l à đôi khi tài nguyên nư ớc bị khai thác mộtcách quá mức dẫn đến môi trường ngày càng bị ô nhiễm, công tác quản lý các yếu

tố môi trường này cũng gặp nhiều khó khăn h ơn Hướng giải quyết khá hiệu quả v àmang tính thuyết phục cao được nghĩ tới là tạo ra một hệ sinh thái môi tr ường aonuôi ổn định thông qua các quần thể sinh vật tự nhi ên trong đó mà tâm đi ểm là vitảo Và cho tới nay hướng đi đó vẫn được coi là hiệu quả và toàn diện, bằng chứng

là đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thu nuôi sinh khối vi tảo (đặc biệt l à

Chlorella) để xử lý và cải tạo môi trường nước giữ cân bằng sinh thái.

Nhờ vào khả năng tự quang hợp dưới tác động của ánh sáng mắt trời, vi tảohấp thu mạnh các muối dinh d ưỡng như amonia, các muối PO4- làm sạch môitrường nước (các muôi dinh dưỡng này thường là sản phẩm tạo ra từ quá tr ình phângiải các chất hữu cơ, các sản phẩm bài tiết của động vật nuôi, thức ăn thừa và xácchết của sinh vật) quá tr ình đó được thực hiện theo phương trình sau:

CO2 + NO3- + PO43- + H2O [CH2ONP] + O2

Cũng trong quá trình này, vi tảo hấp thu một lượng lớn khí CO2 trong nước,làm ổn định hệ cân bằng cacbonat, từ đó độ kiềm, pH trong ao nuôi sẽ đ ược duy trì,

ổn định trong giới hạn thuận lợi cho sự sinh tr ưởng và phát triển của động vật nuôi

Ngoài ra, thông qua đó vi t ảo còn sản sinh ra lượng lớn khí Oxy, vai tr ò sinhhọc của Oxy đối với vật nuôi th uỷ sản cũng như bất kỳ sinh vật nào khác là điềukiện cần thiết cho sự tồn tại Song xét tr ên khía cạnh động thái môi trường thì Oxy

Ánh sáng

cũng có vai trò rất lớn, nó thúc đẩy quá tr ình phân giải các mùn bã hữu cơ tích tụ ởđáy ao và gián tiếp làm giảm độc tính của khí độc: như NH3, H2S, NO2…

Bên cạnh đó, một tập đoàn tảo tốt sẽ làm giảm hàm lượng các kim loại nặngtrong môi trường nước, ổn định nhiệt độ v à kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gâybệnh Trong ao nuôi tôm công nghiệp th ì sự phát triển của chúng c òn đóng một vaitrò hết sức quan trọng đó tạo cảm giác an to àn cho vật nuôi và ngăn chặn sự pháttriển của tảo đáy

Chính vì vậy, trong hệ sinh thái ao nuôi trồng thuỷ sản th ì vi tảo được coinhư các tác nhân sinh h ọc cho quá trình tự làm sạch môi trường – nhà máy lọc sinhhọc (theo Dương Đức Tiến, 1988) (trích theo Vũ Thị Thùy Minh, 2006) [12]

Bảng 2.3: Các lớp và các chi tảo được nuôi trồng để làm thức ăn cho động vật

thuỷ sinh (Đặng Đình Kim, 1998) [2].

Bacillariophyceae Skeletonema

Thalassiosira Phaeodactylum Chaetoceros Nitzchia và cyclotella

PL, BL, BP

PL, BL, BP

PL, BL, BP, ML, BS

PL, BL, BP, BSBS

Scenedesmus Nanochloris

PL - Ấu trùng tôm, BL - Ấu trùng nhuyễn thể hai mảnh vỏ, ML - Ấu trùng tôm

nước ngọt, BP - Hậu ấu trùng hai mảnh vỏ, AL - Ấu trùng bào ngư, MR – Brachionus,

BS – Artermia, SC – Saltwater copepoda, FZ – Phù du động vật nước ngọt.

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng

Tảo lục Chlorella sp

3.1.2 Thời gian

Từ 28/07/2008 đến 08/11/2008

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Sinh lý – Sinh hóa, Bộ Môn Cơ Sở Sinh Học Nghề Cá,Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang

3.2 Phương pháp nghiên c ứu

3.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Hình 3.1: Sơ đồ khối nội dung phân lập tảo giống thuần chủng Chlorella sp.

Phương pháp và môi trường dinh dưỡng

thích hợp cho phân lập Chlorella sp

Hình 3.2: Sơ đồ khối nội dung lưu giữ tảo giống thuần chủng Chlorella sp.

Môi trường dinh dưỡng

3.2.2 Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, n ước và môi trường thí nghiệm

a, Dụng cụ thí nghiệm

 Dụng cụ thu mẫu: Lưới vớt động vật, thực vật nổi

 Dụng cụ chứa: Chai, lọ, can nhựa có dung tích từ 0.5 – 10 lít

 Các dụng cụ trong phân lập: Đĩa pertri, ống nghiệm 30 mL, lọ thuỷ tinh códung tích 50 mL, các bình nón có dung tích 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1 l

 Dụng cụ trong lưu giữ: Các lọ thuỷ tinh có dung tích 150 mL

Hình 3.3 Hình ảnh cân điện tử (trái) v à kính hiển vi (phải) phục

vụ cho nghiên cứu.

 Ngoài ra còn có các dụng cụ khác như: Hệ thống kính hiển vi quang học,buồng đếm hồng cầu, buồng đếm hồng cầu Neubauer, cân điện tử, lam, lam men,giá để ống nghiệm, pipet 0 5mL 1mL, 3mL, 10mL, ống đong 50 mL, que cấy, đũakhuấy thủy tinh, nồi nấu aga Các dụng cụ thí nghiệm đ ược rửa sạch bằng xà phòng,nước máy, để khô, nút bông, quấn báo, đem sấy ở 1050C trong 12giờ

b, Thiết bị phục vụ