Địa điểm thu mẫu: Tảo giống đ ược thu từ Trung Tâm Khuyến Ng ư – Tp Nha Trang. Địa chỉ: Linh Lộc – Tp Nha Trang – Tỉnh Khánh Hòa. Thu tại ao nuôi cá Chẽm theo hình thức mương nổi, độ mặn trong ao dao động tr ên dưới 200/00. Màu nước trong ao có màu xanh lá cây hơi nhạt.
Cách thu mẫu: Múc nước môi trường vào bình thu mẫu, dùng lưới vớt thực vật nổi thu cách khoảng 20 cm mặt n ước rồi cho vào bình. Tiến hành thu nhiều lần. Sau đó đưa về phòng thí nghiệm lọc qua bằng lưới vớt động vật nổi loại bỏ các chất cạn bẩn và động vật phù du.
Nhân sinh khối: Từ nguồn tảo giống thu đ ược tiến hành nhân sinh khối bằng các bình nón có dung tích 0.5 lít và 1 lít. Môi trường dinh dưỡng sử dụng cho nhân sinh khối là môi trường F2. Nhiệt độ khoảng 20-220C, độ mặn 200/00, chiếu sáng 12giờ/ ngày với cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux, chế độ sục khí 24/24. Sau khoảng thời gian 1 tuần, dung dịch tảo l ên màu xanh đậm, quan sát dưới kính hiển vi thấy tảo lục Chlorella sp có mật độ dày tiến hành phân lập.
d, Môi trường dinh dưỡng trong các thí nghiệm
Môi trường F2.(Guillard, 1975. Trích theo Bùi Thị Vân, 2007) [1]. Dung dịch 1: Các thành phần đa lượng.
Hóa chất: KNO3: KH2PO4: Na2SiO39 H2O: Nồng độ (mg/l) 89.6 5.6 30
Dung dịch 2: Các thành phần vi lượng. Hóa chất Na2EDTA: FeCl3. 6 H2O: CuSO4. 5 H2O: ZnSO4. H2O: CoCl2. 6 H2O: MnCl2. 4 H2O: NaMoO4. 2 H2O: Nồng độ (mg/l) 4.36 3.15 0.01 0.022 0.01 0.18 0.006 Dung dịch 3: Vitamin. Loại vitamin Thiamin (B1): Biotin (B6): Riboflavin (B12): Nồng độ (mg/l) 0.1 0.0005 0.0005
Hình 3.5 Hóa chất pha môi trường và môi trường dinh dưỡng cho nuôi tảo.
Môi trường TH.04 cải tiến. Dung dịch 1: Thành phần đa lượng.
Hoá chất NH4Cl NaH2PO4 CaCl2 NaHCO3 KNO3 Nồng độ (mg/l) 81 1.8 22.9 100 33.5 Dung dịch 2: Thành phần vi lượng Hóa chất Nồng độ (mg/l) MgSO4. 7H2O FeSO4 H3BO3 MnCl2. H2O ZnSO4. 7H2O EDTA (NH4)Mo7O24. 4H2O 80 0.4 2.86 1.81 0.22 0.37 0.2 3.2.4. Bố trí thí nghiệm
3.2.4.1. Thí nghiệm phân lập thuần chủng Chlorella sp
Quá trình phân lập Chlorella sp được thực hiện trên 2 môi trường dinh dưỡng là môi trường F/2 và môi trường TH.04 và bằng 2 phương pháp là phương
pháp pha loãng và phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc (thạch). Các lô thí nghiệm được tiến hành đồng thời.
Thí nghiệm 1: Thí nghiệm phân lập tảo lục Chlorella sp bằng phương
pháp pha loãng
Chuẩn bị 10 lọ thuỷ tinh có dung tích 50 mL đ ược đậy kín bằng bông gòn bên trên được bọc bằng giấy bạc, mỗi lọ chứa 9 mL môi tr ường nuôi đã pha dinh dưỡng nuôi tảo và có đề nhãn từ 10-1 đến 10-10để chỉ số lần pha loãng.
Dùng pipet có dung tích chứa 1 mL, hút 1 mL dung dịch tảo mẫu ngoài tự nhiên đã nhân sinh khối đưa sang lọ đầu tiên 10-1 và lắc nhẹ.
Sau đó lấy 1 mL từ lọ 10-1 đưa sang lọ 10-2, cứ làm tương tự như vậy với các lọ thí nghiệm tiếp sau.
Các lọ thí nghiệm được nút lại và đặt trong tủ nhân sinh khối dưới ánh sáng đèn neon.
Thí nghiệm được bố trí với 2 nghiệm thức, t ương ứng với 2 môi trường dinh dưỡng là môi trường F/2 và môi trường TH.04. Số lần lặp lại thí nghiệm là 3 lần. (Tổng số 2 × 3 = 6 nghiệm thức).
Điều kiện thí nghiệm:
Độ mặn của dung dịch môi trường nuôi là 200/00. Nhiệt độ: ở điều kiện phòng thí nghiệm nuôi tảo. Cường độ ánh sáng: 3000-4000 lux
Thời gian chiếu sáng 12 h/ngày.
Các chỉ tiêu đánh giá: Mức độ thuần chủng của Chlorella sp qua các lần phân lập ở các nghiệm thức (%) bằng cách xác định các tỷ lệ tế bào Chlorella sp trong
tổng số các tế bào có trong mẫu và sự phù hợp củaChlorella sp trên các môi trường dinh dưỡng thông qua việc thu mẫu v à xác định mật độ tế bào Chlorella sp. Việc
thu mẫu và đếm các tế bào được tiến hành vào thời điểm ngay trước khi tiến hành phân lập lần kế tiếp.
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 9 mL
10-1 10-2 10-3 10-10
Hình 3.6: Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng.
Thí nghiệm 2: Thí nghiệm phân lập tảo lục Chlorella sp bằng phương
pháp nuôi cấy trên môi trường thạch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị môi trường thạch: Pha môi tr ường thạch với tỷ lệ 2 gram agar với 100 mL dung dịch nuôi tảo và khuấy đều.
Đun sôi cho đến khi tan hết agar.
Đưa ra ngoài để nguội tự nhiên, khi thạch sắp đông thì cho vào đĩa Petri (10 mL/đĩa).
Đậy nắp lại và chờ cho đến khi thạch đông, dùng que cấy đã hơ nóng đỏ tạo các đường ziczac trên bề mặt thạch (hình 3.10).
Nhỏ 1 mL mẫu tảo hỗn hợp vào bề mặt thạch và tráng đều.
Đậy nắp lại, sau đó để d ưới đèn cực tím khoảng 15 phút sau đó đ ưa vào tủ nhân sinh khối có chiếu sáng của đèn huỳnh quang (thời gian chiếu sáng là 12 h/ngày).
Sau 4 – 5 ngày khi trên bề mặt thạch xuất hiện những quần lạc có màu xanh vàng. Đem soi dưới kính hiển vi xác định chính xác quần lạc của Chlorella sp, sau
đó dùng que cấy đã hơ nóng đỏ tách các khuẩn lạc ra đ ưa vào các lọ thuỷ tinh (có
Hình 3.7: Kỹ thuật phân lập Chlorella sp bằng phương
pháp cấy trên môi trường đặc
dung tích 50 mL) chứa 9 mL dung dịch nuôi ( môi trường dinh dưỡng giống như môi trường dinh dưỡng trong các đĩa Petri).
Tiến hành thuần chủng lại tránh tảo phân lập bị tạp bằng cách sau khi nuôi trong các lọ thuỷ tinh 50 mL đó khoảng 5 ngày thì lọc lấy phần dung dịch n ước tảo trong các lọ thuỷ tinh ấy đem cấy lại tr ên môi trường thạch, ta có thể thu được tảo có độ thuần chủng cao hơn.
Thí nghiệm được bố trí với 2 nghiệm thức, t ương ứng với 2 môi trường dinh dưỡng là môi trường F/2 và môi trường TH.04. Số lần lặp lại thí nghiệm là 3 lần.
(Tổng số có 2 × 3 = 6 nghiệm thức). Điều kiện thí nghiệm:
Độ mặn: 20 0/00.
Cường độ ánh sáng: 3000-4000 lux. Thờigian chiếu sáng: 12h/ngày.
Các chỉ tiêu đánh giá: Mức độ thuần chủng của Chlorella sp (%) bằng cách xác định các tỷ lệ tế bào Chlorella sp trong tổng số các tế bào có trong mẫu. Việc
thu và đếm các tế bào được tiến hành vào thời gian sau khoảng 5 ngày kể từ ngày lấy khuẩn lạc ra khỏi các đĩa Petri đưa vào dung dịch nuôi.
Qua 2 thí nghiệm trên sẽ xác định được phương pháp phân lập hiệu quả nhất (dựa vào mức độ thuần chủng của Chlorella sp ở các nghiệm thức) và môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất cho Chlorella sp phát triển. Lấy nguồn tảo (Chlorella sp)
ở lô thí nghệm cho kết quả thuần chủng cao nhất đem nhân sinh khối v à đưa vào lưu giữ.
3.2.4.2. Thí nghiệm xác định điều kiện lưu giữ thích hợp
Hình 3.8: Lưu giữChlorella sp
ở nhiệt độ 7 – 80C (trong tủ lạnh)
Nhân sinh khối Chlorella sp thuần chủng đã phân lập được. Đến khi đạt được thể tích cung cấp đủ cho lưu giữ và mật độtế bào cao (tảo đang ở gần cuối pha logarit) tiến hành bổ sung muối dinh dưỡng vào dung dịch tảo rồi đem đi lưu giữ. Hàm lượng muối dinh dưỡng cần bổ sung là 1 mL dung dịch mẹ cho 1 l dung dịch tảo.
Lưu giữ tảo lục Chlorella sp trên 2 điều kiện nhiệt độ là 7 – 80C trong tủ lạnh, và 300C trong tủ ấm, ở 2 môi trường dinh dưỡng (F/2 và TH0.04) với 2 dạng dịch nuôi là bán lỏng và lỏng. Các thí nghiệm đ ược tiến hành đồng thời.
Bảng3.1 Thí nghiệm lưu giữChlorella sp trongđiều kiện dịch nuôi dạng lỏng
với nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khác nhau.
Lô thí nghiệm Điều kiện lưu
giữ
Lô 3 Lô 4 Lô 7 Lô 8 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhiệt độ 7-80C 300C 7-80C 300C
Môi trường
dinh dưỡng TH.04 F/2
Bảng3.2 Thí nghiệm lưu giữChlorella sp trongđiều kiện dịch nuôi dạng bán
lỏng với nhiệt độ và môi trường dinh dưỡng khác nhau.
Lô thí nghiệm Điều kiện lưu
giữ
Lô 1 Lô 2 Lô 5 Lô 6
Nhiệt độ 7-80C 300C 7-80C 300C
Môi trường
dinh dưỡng TH.04 F/2
Điều kiện lưu giữ:
Mật độ: 12.8×106 tb/mL. Độ mặn: 200/00.
Thí nghiệm 1: Lưu giữ trong điều kiện dịch nuôi dạng lỏng.
Chuẩn bị các lọ thuỷ tinh có dung tích l à 150 mL, nút được làm bằng bông gòn, bên ngoài được bọc bằng giấy bạc.
Lấy 100 mL dung dịch Chlorella sp đã được bổ sung muối dinh d ưỡng cho vào lọ thuỷ tinh có dung tích 150 mL.
Đậy nút lại và đưa đi lưu giữ ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
Thí nghiệm 2: Lưu giữ Chlorella sp trong điều kiện dịch nuôi dạng bán
lỏng.
Chuẩn bị các lọ thuỷ tinh có dung tích 150 mL, nút lọ làm bằng bong gòn, bên ngoài được bọc bằng giấy bạc.
Chuẩn bị môi trường thạch: Pha môi tr ường thạch giống như môi trường thạch đã sử dụng trong thí nghiệm phân lập bằng ph ương pháp cấy trong môi trường thạch. Sau khi thạch được đun sôi (tan hết agar), để nguội tự nhiên cho đến khi thạch gần đông thì cho vào các lọ thuỷ tinh (150 mL) với 50 mL/1 lọ
Để nghiêng các lọ thuỷ tinh một góc khoảng 450 tạo ra bề mặt thạch nghiêng trong các lọ lưu giữ tảo.
Để thạch nguội tự nhiên đến khi thạch đông cứng, lấy dung dịch tảo Chlorella sp (như ở thí nghiệm 1 lưu giữ) có bổ sung dinh dưỡng cho vào các lọ này (50 mL dung dịch tảoChlorella sp/ 1 lọ)
Đậy nút lại và đem đi lưu giữ.
Cả hai Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức, tương ứng với thang nhiệt độ lưu giữ là 7 – 8 0C (trong tủ lạnh) và ở 300C (trong tủ ấm), trên 2 môi trường dinh dưỡng là F/2 và TH.04. Số lần lặp lại thí nghiệm là 3 lần.
Sau 14 ngày lưu giữ, tiến hành nuôi nhân giống trở lại để kiểm tra sự phát triển của tảo ở các điều kiện lưu giữ khác nhau: Chuyển tảo Chlorella sp từ tủ lưu giữ giống sang phòng nuôi tảo (nhiệt độ khoảng 20-220C) trong các lọ có dung tích 250
mL. Với mật độ banđầu 1.6×106 tb/mL và môi trường dinh dưỡng tương tự như môi trường dinh dưỡng đã sử dụng trong lưu giữ. Cácđiều kiện thí nghiệm còn lại giống với điều kiện trong lưu giữ.
Các chỉ tiêu đánh giá: Các chỉ tiêu so sánh để đánh ảnh hưởng của các điều kiện lưu giữ đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo ở các lô thí nghiệm sau khi lưu giữ là: Hình dạng đường sinh trưởng củaChlorella sp, mật độ cực đại, thời gian đạt cực đại, thời gian duy trì cực đại (độ dài của pha cân bằng) và tốc độ sinh trưởng hàng ngày củaChlorella spở các lô thí nghiệm.
Qua 2 thí nghiệm trên đánh giá được điều kiện (dạng dịch nuôi tảo, nhiệt độ và môi trườngdinh dưỡng)lưu giữ thích hợp nhất cho tảo lục Chlorella sp.
3.2.2. Cácphương pháp xác định mật độ tế bào, tỷ lệ thuần chủng, tốc độ sinh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trưởnghàng ngày và các yếu tố môi trường nuôi
3.2.5.1. Đếmtế bào
Phương pháp lấy mẫu tảo: Định kỳ lấy tảo để xác định mật độ 1 lần trong ngày vào 13h. Mẫutảo được lấy ra 1 mL bằng các pipet có dung tích 1 mL cho vào các ô trong vỉ thuốc tây (các ô trong vỉ thuốc tây có dung tích lớn hơn 1 mL). Cố định mẫu bằng dung dịch formalin 2 %.
Phương pháp xác định mật độ tế bào: Dùng buồng đếm hồng cầu Neubauer có dung tích 0.25 × 106 mL. Dùng pipet hút mẫu và nhỏ 1 giọt lên bề trên buồng đếm,đậy lam men lại và đưa lên soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại (theo hướng dẫn sử dụng đi kèm với buồng đếm).
Công thức xác định mật độ tế bào: (Theo Mucklow) [18] Sốtb/nL: N = (D×1000 mm3)/(Y×W2×d)
Trongđó:
N là mật độ tế bào. D là số tế bào đếm được.
Y là số ô vuông đếm.
W là chiều dài của một ô vuông.
d là độ dày của lớp nước trong buồng đếm.
3.2.5.2.Phương pháp xác định tỷ lệ thuần chủng trong các thí nghiệm phân lập
Chlorella sp
Hình 3.9: Buồng đếm hồng cầu Neubauer.
Công thức xác định mức độ thuần chủng của các thí nghiệm phân lập Chlorella sp.
f = (Na/ Nb) × 100% Trongđó:
f là mức độ thuần chủng.
Na là số lượng tế bào Chlorella sp trong một ô của buồng đếm. Nb là tổng số tế bào đếm được trong một ô của buồng đ ếm.
3.2.5.3. Công thức xác định tốc độ sinh tr ưởng hàng ngày
µ = ln(N2/N1)/(T1– T2) Trongđó:
µ là tốc độ sinh trưởng hàng ngày. N1 là mật độ tế bàoở thời điểm T1. N2 là mật độ tế bàoở thời điểm T2.
3.2.5.4. Kiểm tra các yếu tố môi tr ường
Nhiệt độ: Nhiệtkế thủy ngân (0 đến 1000C),độ chính xác là 10C. Độ mặn: Khúc xạ kếRefractometer cầm tay,độ chính xác 1 0/00. Cường độ ánh sáng: Máyđo cường độ ánh sáng cầm tay.
3.2.5. 5. Xửlý các số liệu
Các chỉ số thống kê như giá trị trung bình,độ lệch chuẩn STDEV và giá trị trung bìnhđược kiểm định bằng chương trình Data analysis trong phần mềmExel.
Những số liệu về tốc độ sinh tr ưởng hàng ngày ở các thí nghiệm được chuyển sang dạng ln.
Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lậpChlorella sp thuần chủng bằng các ph ương pháp khác nhau
4.1.1. Phân lập bằng phương pháp pha loãng
Kết quả phân lập tảo giống thuần chủngChlorella sp bằng phương pha loãng trên 2 môi trường dinh dưỡng (môi trường dinh dưỡng F/2 và TH.04) được thể hiện như sau:
Bảng 4.1: Mức độ thuần chủng (%) của tảo giống Chlorella sp nước mặn bằng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phương pháp pha loãng:
MT Độ pha loãng F/2 TH.04 Tảo giống (tạp) 62.32±0.36 62.32±0.36 10-1 86.43±0.97 92.07±0.79 10-2 88.01±0.54 95.04±0.34 10-3 89.01±0.81 97.49±0.25 10-4 63.69±0.38 100±0.00
Môi trường dinh dưỡngTH.04
Độ thuần chủng của Chlorella sp tăng lên nhanh qua các lần phân lập pha loãng và tăng nhanh nhất sau lần phân lập thứ nhất (độ pha loãng 10-1). Qua lần phân lập này (10-1) độ thuần chủng của Chlorella sp tăng lên từ 62.32±0.36 % (mức độ chiếm ưu thế củaChlorella sp trong mẫu tảo giống thu ngoài tự nhiên và đã nhân sinh khối) đến 92.07±0.79 %. Nguyên nhân là do trong hỗn hợp tảo giống thu ngoài tự nhiên thì Chlorella sp có mật độ cũng như mức độ chiến ưu thế của loài là khá cao (mật độ 3.2×106 tb/ml và chiếm 62.32±0.36 % thành phần các loài tảo có trong
mẫu). Đồng thời, vi tảo đã qua giai đoạn thích nghi với điều kiện môi tr ường sống mới(điều kiện phòng thí nghiệm).
Ở độ pha loãng 10-4 thì từ mẫu tảo thu ngoài tự nhiên đã phân lập được tảo giống Chlorella sp có độ thuần chủng 100%, quan sát trên kính hiển vi thấymật độ của chúng trong mẫu còn lại cũng rất cao, do đó ở các độ pha loãng về sau (từ 10-5 trở đi) vẫn thu được tảo giống thuần chủng 100%.
Môi trường dinh dưỡng F/2
Diễn biến độ thuần chủng của Chlorella sp qua các lần pha loãng cũng có nhiều điểm tương tự như ở môi trường dinh dưỡng TH.04 nhưng ở mức độ thấp hơn. Độ thuần chủng của Chlorella sp trong thí nghiệm này cao nhất có thể đạt đến 89.01±0.81 %ở lọ cóđộ pha loãng 10-3.
Từ độ pha loãng 10-4 trở đi, độ thuần chủng của Chlorella sp có xu hướnggiản xuống. Theo chúng tôi có 2 nguy ên nhân chính như sau: (1) mật độ củaChlorella sp
còn lại sau 3 lần pha loãng là rất thấp, do đó ở độ pha loãng sau (10-4 trở đi) mật độ quá thưa sẽ là điều kiện bất lợi cho vi tảo sinh tr ưởng và nhân tăng sinh khối, ngoài ra ở một số lô thí nghiệm tảo có dấu hiệu suy tàn.(2) môi trường dinh dưỡng F/2 là môi trường thích hợp cho nhiều loài tảo mà không thật sự thích hợp vớiChlorella sp. Nên
trong mẫu Chlorella sp không phát triển lấn át các loài tảo khác. Vì vậy trong mẫu