Quá trình phân lập Chlorella sp được thực hiện trên 2 môi trường dinh dưỡng là môi trường F/2 và môi trường TH.04 và bằng 2 phương pháp là phương
pháp pha loãng và phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc (thạch). Các lô thí nghiệm được tiến hành đồng thời.
Thí nghiệm 1: Thí nghiệm phân lập tảo lục Chlorella sp bằng phương
pháp pha loãng
Chuẩn bị 10 lọ thuỷ tinh có dung tích 50 mL đ ược đậy kín bằng bông gòn bên trên được bọc bằng giấy bạc, mỗi lọ chứa 9 mL môi tr ường nuôi đã pha dinh dưỡng nuôi tảo và có đề nhãn từ 10-1 đến 10-10để chỉ số lần pha loãng.
Dùng pipet có dung tích chứa 1 mL, hút 1 mL dung dịch tảo mẫu ngoài tự nhiên đã nhân sinh khối đưa sang lọ đầu tiên 10-1 và lắc nhẹ.
Sau đó lấy 1 mL từ lọ 10-1 đưa sang lọ 10-2, cứ làm tương tự như vậy với các lọ thí nghiệm tiếp sau.
Các lọ thí nghiệm được nút lại và đặt trong tủ nhân sinh khối dưới ánh sáng đèn neon.
Thí nghiệm được bố trí với 2 nghiệm thức, t ương ứng với 2 môi trường dinh dưỡng là môi trường F/2 và môi trường TH.04. Số lần lặp lại thí nghiệm là 3 lần. (Tổng số 2 × 3 = 6 nghiệm thức).
Điều kiện thí nghiệm:
Độ mặn của dung dịch môi trường nuôi là 200/00. Nhiệt độ: ở điều kiện phòng thí nghiệm nuôi tảo. Cường độ ánh sáng: 3000-4000 lux
Thời gian chiếu sáng 12 h/ngày.
Các chỉ tiêu đánh giá: Mức độ thuần chủng của Chlorella sp qua các lần phân lập ở các nghiệm thức (%) bằng cách xác định các tỷ lệ tế bào Chlorella sp trong
tổng số các tế bào có trong mẫu và sự phù hợp củaChlorella sp trên các môi trường dinh dưỡng thông qua việc thu mẫu v à xác định mật độ tế bào Chlorella sp. Việc
thu mẫu và đếm các tế bào được tiến hành vào thời điểm ngay trước khi tiến hành phân lập lần kế tiếp.
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 9 mL
10-1 10-2 10-3 10-10
Hình 3.6: Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng.
Thí nghiệm 2: Thí nghiệm phân lập tảo lục Chlorella sp bằng phương
pháp nuôi cấy trên môi trường thạch
Chuẩn bị môi trường thạch: Pha môi tr ường thạch với tỷ lệ 2 gram agar với 100 mL dung dịch nuôi tảo và khuấy đều.
Đun sôi cho đến khi tan hết agar.
Đưa ra ngoài để nguội tự nhiên, khi thạch sắp đông thì cho vào đĩa Petri (10 mL/đĩa).
Đậy nắp lại và chờ cho đến khi thạch đông, dùng que cấy đã hơ nóng đỏ tạo các đường ziczac trên bề mặt thạch (hình 3.10).
Nhỏ 1 mL mẫu tảo hỗn hợp vào bề mặt thạch và tráng đều.
Đậy nắp lại, sau đó để d ưới đèn cực tím khoảng 15 phút sau đó đ ưa vào tủ nhân sinh khối có chiếu sáng của đèn huỳnh quang (thời gian chiếu sáng là 12 h/ngày).
Sau 4 – 5 ngày khi trên bề mặt thạch xuất hiện những quần lạc có màu xanh vàng. Đem soi dưới kính hiển vi xác định chính xác quần lạc của Chlorella sp, sau
đó dùng que cấy đã hơ nóng đỏ tách các khuẩn lạc ra đ ưa vào các lọ thuỷ tinh (có
Hình 3.7: Kỹ thuật phân lập Chlorella sp bằng phương
pháp cấy trên môi trường đặc
dung tích 50 mL) chứa 9 mL dung dịch nuôi ( môi trường dinh dưỡng giống như môi trường dinh dưỡng trong các đĩa Petri).
Tiến hành thuần chủng lại tránh tảo phân lập bị tạp bằng cách sau khi nuôi trong các lọ thuỷ tinh 50 mL đó khoảng 5 ngày thì lọc lấy phần dung dịch n ước tảo trong các lọ thuỷ tinh ấy đem cấy lại tr ên môi trường thạch, ta có thể thu được tảo có độ thuần chủng cao hơn.
Thí nghiệm được bố trí với 2 nghiệm thức, t ương ứng với 2 môi trường dinh dưỡng là môi trường F/2 và môi trường TH.04. Số lần lặp lại thí nghiệm là 3 lần.
(Tổng số có 2 × 3 = 6 nghiệm thức). Điều kiện thí nghiệm:
Độ mặn: 20 0/00.
Cường độ ánh sáng: 3000-4000 lux. Thờigian chiếu sáng: 12h/ngày.
Các chỉ tiêu đánh giá: Mức độ thuần chủng của Chlorella sp (%) bằng cách xác định các tỷ lệ tế bào Chlorella sp trong tổng số các tế bào có trong mẫu. Việc
thu và đếm các tế bào được tiến hành vào thời gian sau khoảng 5 ngày kể từ ngày lấy khuẩn lạc ra khỏi các đĩa Petri đưa vào dung dịch nuôi.
Qua 2 thí nghiệm trên sẽ xác định được phương pháp phân lập hiệu quả nhất (dựa vào mức độ thuần chủng của Chlorella sp ở các nghiệm thức) và môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất cho Chlorella sp phát triển. Lấy nguồn tảo (Chlorella sp)
ở lô thí nghệm cho kết quả thuần chủng cao nhất đem nhân sinh khối v à đưa vào lưu giữ.