Phân lập và lưu giữ 2 loài tảo silic lông chim sống đáy Navicula sp. và Nitzschia sp

được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau.... được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở các môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nha

Để có được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Chủ Nhiệm Khoa cùng các quý thầy cô trong Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản - Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học và thực hiện công tác tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô hướng dẫn: TS Hoàng Thị Bích Mai và ThS Tôn Nữ Mỹ Nga đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ hai phòng thí nghiệm: Thực hành Sinh Lý và Thực hành Môi Trường - Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tất cả những người thân trong gia đình, bạn bè cùng lớp đã giúp đỡ, động viên tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần để tôi có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình

Xin chân thành cảm ơn!

LỜI CẢM ƠN

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Phân loại và đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo Silic 3

1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chủ yếu 3

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Navicula sp và Nitzschia sp 3

1.1.2.2 Sinh trưởng 5

1.2 Thành phần sinh hóa của tảo 7

1.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của tảo 8

1.3.1 Ánh sáng 8

1.3.2 Nhiệt độ 8

1.3.3 Độ mặn 9

1.3.4 pH 9

1.3.4 Các yếu tố dinh dưỡng 10

1.4 Khái quát các công trình nghiên cứu nuôi trồng vi tảo 11

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới 11

1.4.2 Ở Việt Nam 14

CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng 16

2.1.2 Thời gian 16

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 16

2.2.2 Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, nước và môi trường thí nghiệm 18

2.2.2.1 Dụng cụ thí nghiệm 18

2.2.2.2 Nguồn nước 19

2.2.3 Nguồn tảo 19

2.2.4 Pha môi trường dinh dưỡng dùng trong các thí nghiệm 19

2.2.5 Phương pháp phân lập 20

2.2.5.1 Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch 20

2.2.5.2 Phân lập bằng phương pháp pha loãng 21

2.2.6 Xác định điều kiện lưu giữ tảo thích hợp 22

2.2.6.1 Xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp 22 2.2.6.2 Thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp 23

2.2.7 Định lượng tảo và xử lý số liệu 23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Phân lập tảo bằng các phương pháp khác nhau 26

MỤC LỤC

3.1.1 Phương pháp pha loãng 26

3.1.1.1 Navicula sp 26

3.1.1.2 Nitzschia sp 27

3.1.2 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch 28

3.1.2.1 Navicula sp 28

3.1.2.2 Nitzschia sp 30

3.2 Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau 31

3.2.1 Navicula sp 31

3.2.1.1 Lưu giữ tảo trong môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau31 3.2.1.2 Lưu giữ tảo trong khoảng thời gian khác nhau 34

3.2.2 Nitzschia sp 36

3.2.2.1 Lưu giữ trong môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau 36

3.2.2.2 Lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau 40

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 42

4.1 Kết luận 42

4.2 Đề xuất ý kiến 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần của vi tảo 7 Bảng 2.1 Các lô thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ

thích hợp đối với tảo Navicula sp và Nitzschia sp 22 Bảng 3.1 Sự sinh trưởng của tảo Navicula sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi

lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau 32

Bảng 3.2 Sự sinh trưởng của tảo Navicula sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi

lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau 35

Bảng 3.3 Sự sinh trưởng của tảo Nitzschia sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi

lưu giữ ở các môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau 37

Bảng 3.4 Sự sinh trưởng của tảo Nitzschia sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi

lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng tế bào Nitzschia sp 3

Hình 1.2 Hình dạng tế bào Navicula sp 3

Hình 1.3 Cấu tạo vỏ của tảo Silic 4

Hình 1.4 Thể màu ở tảo Silic 5

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 17

Hình 2.2 Cách pha độ mặn 18

Hình 2.3 Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng 21

Hình 2.4 Nhân sinh khối tảo 25

Hình 3.1 Quần tảo Navicula sp thuần chủng 26

Hình 3.2 Quần tảo Nitzschia sp thuần chủng 27

Hình 3.3 Quần lạc tảo mọc trên các đĩa thạch 28

Hình 3.4 Tảo chuyển sang các ống nghiệm 29

Hình 3.5 Diễn biến về mật độ tế bào tảo Navicula sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau 33

Hình 3.6 Diễn biến về mật độ tế bào Navicula sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau 36

Hình 3.7 Diễn biến về mật độ tế bào tảo Nitzschia sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ ở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau 38

Hình 3.8 Diễn biến mật độ tế bào Nitzschia sp được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữ trong khoảng thời gian khác nhau 41

CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT

ctv: Cộng tác viên

g: Gram

mg/l: Minigram/lít

ppt: Phần ngàn

tb: Tế bào

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam phát triển rất mạnh, nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất giống và nuôi lớn Bào ngư, Ốc hương, cua, Trai ngọc, Điệp, Hải sâm, giáp xác và một số loài cá biển đã thành công và có triển vọng lớn Vi tảo (Microalgae) đã có những đóng góp nhất định vào thành công đó bởi chúng là nguồn thức ăn không thể thiếu trong công nghệ sản xuất giống cũng như nuôi thương phẩm Vì vậy, việc nghiên cứu về vi tảo là vấn đề đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm, đặc biệt là tảo Silic

Ở trong các thủy vực nước ngọt, tảo Silic là thành phần chính của năng suất sơ cấp Ở biển và đại dương, tảo Silic chiếm ưu thế cả về sinh khối và thành phần loài Chúng đóng vai trò chủ đạo trong việc tạo nên các năng suất sơ cấp trong hệ sinh thái biển, nhất là những vùng không được tiếp nhận nguồn thức ăn hữu cơ mang tới từ các dòng lục địa [10] Mặt khác, hiện nay trên thế giới, tảo

Silic, đặc biệt là một số loài tảo Silic sống đáy như Navicula sp., Nitzschia sp.…

đang là thức ăn rất phổ biến cho ấu trùng Bào ngư cũng như một số đối tượng

thủy sản khác, phổ biến nhất là ở Mexico Giống Nitzschia đã được phân lập từ

trại nuôi Bào ngư ở Esenada, Mexico (Corea-Reyes và ctv), còn Navicula được phân lập từ vùng nước ven biển của Bahina, Mexico để làm thức ăn cho các loài động vật thân mềm ăn lọc (trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12]

Ở nước ta, tảo Silic nói chung, Navicula sp và Nitzschia sp nói riêng là những loài tảo phù hợp về kích thước và chất lượng dinh dưỡng cho ấu trùng động vật thủy sản, đặc biệt là động vật thân mềm 2 mảnh vỏ Tảo có tốc độ tăng trưởng nhanh, có thể nuôi trong điều kiện nhân tạo, trong các trại giống Đến nay,

chúng ta đã phân lập được một số loài Tuy nhiên, hiện nay hai loài Navicula sp.,

Nitzschia sp phải nhập từ nước ngoài, chủ yếu là từ Úc và Trung Quốc, nhưng giá thành nhập rất cao Việc nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố như hàm

lượng muối dinh dưỡng, độ mặn… đến sự phát triển của chúng đã có nhiều tài

liệu đề cập đến [10], [12], nhưng chưa tìm thấy tài liệu nào công bố về phương pháp phân lập cũng như điều kiện lưu giữ thích hợp cho mỗi loài

Vì vậy, để góp phần vào việc phân lập ra một số loài tảo Silic thuần chủng

và điều kiện lưu giữ thích hợp hơn, tạo cơ sở cho việc thiết lập ngân hàng tảo, giảm chi phí nhập tảo, từ ngày 30/7/2007 đến ngày 10/11/2007, tôi thực hiện đề

tài: “Phân lập và lưu giữ hai loài tảo Silic lông chim sống đáy Navicula sp và

Nitzschia sp.”

Mục tiêu của đề tài

- Phân lập được hai loài tảo Navicula sp., Nitzschia sp thuần chủng

- Xác định điều kiện lưu giữ giống thích hợp cho mỗi loài (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, thời gian)

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập hai loài tảo Navicula sp và Nitzschia sp bằng 2 phương pháp khác

nhau (phương pháp pha loãng và phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch)

- Lưu giữ giống Navicula sp và Nitzschia sp thuần chủng trong môi trường

dinh dưỡng, nhiệt độ và thời gian khác nhau

Ý nghĩa của đề tài

- Góp phần vào việc thành lập ngân hàng tảo, nhằm cung cấp tảo giống cho công nghệ sản xuất giống thủy sản

- Lưu giữ giống Navicula sp., Nitzschia sp hiệu quả hơn

Trong quá trình thực hiện đề tài, do thời gian ngắn, tài liệu tham khảo khan hiếm, trình độ chuyên môn có hạn nên một số nội dung nghiên cứu còn hạn chế Được sự hướng dẫn của TS Hoàng Thị Bích Mai và ThS Tôn Nữ Mỹ Nga nên tôi

đã hoàn thành được nội dung Tôi xin chân thành cảm ơn đến sự giúp đỡ quý báu này

Nha Trang, tháng 11 năm 2007 Sinh viên thực hiện

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Phân loại và đặc điểm sinh học chủ yếu của tảo Silic

Loài: Nitzschia sp Loài: Navicula sp

Hình 1.1 Hình dạng tế bào Nitzschia sp Hình 1.2 Hình dạng tế bào Navicula sp

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chủ yếu

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo của Navicula sp và Nitzschia sp

Navicula sp và Nitzschia sp cũng như các loài tảo Silic khác, có thể nhận

biết bằng kính hiển vi quang học nhờ thành tế bào (cấu tạo vỏ) bằng chất silic

cứng Kích thước tế bào 30 x 4 µm (Navicula sp.), 30 x 5 µm (Nitzschia sp.) Mỗi

tế bào được bao bọc bởi vách tấm silic như một cái hộp có nắp đậy lại được gọi

là vỏ Như vậy, vỏ có hai mảnh lồng vào nhau, giống như một hộp petri với cái nắp và đáy hộp, mảnh trên hơi to hơn và úp lên mảnh dưới với đai là 2 mảnh

chồng vào nhau Đối với Navicula sp., tảo có dạng hình thuyền, đường sống ở

trên đường giữa nhỏ và gần với đường giữa, do đó hình dạng mặt phẳng thẳng, rãnh dọc cũng thẳng Hình dạng mặt vỏ là hình chữ S hoặc hình cong Rãnh dọc cũng hình chữ S hoặc hình cong, có đốt giữa và đốt cực

- Cấu tạo vách tế bào:

Tế bào tảo được bao bọc bởi lớp vỏ cấu tạo bằng chất silic và chất pectin gồm 2 tầng: Tầng ngoài (silic) và tầng trong (pectin)

- Sắc tố, thể sắc tố:

Số lượng ít, kích thước lớn, thể sắc tố sẻ thùy, có dạng hình sao, gồm chlorophyll, phycoxanthin, carotenoit và diatomi

- Nguyên sinh chất:

Là chất sống căn bản của tế bào, có tính lỏng, nhớt, đàn hồi, và trong suốt

Hình 1.4 Thể màu ở tảo Silic (Geitler) (trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12]

a Thể màu của tảo thuộc Pennales c Thể màu của Cocconeis

b Sơ đồ hình thể của chúng

- Nhân:

Mỗi tế bào tảo Silic có một nhân, thường có dạng hình cầu, kích thước phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của tế bào Nhân nằm trên cầu nguyên sinh chất chạy qua trung tâm tế bào Nhân có màng nhân cố định chứa một hay nhiều hạch nhân, quá trình phân chia không giảm nhiễm [1]

phải kể đến công trình của Đặng Ngọc Thanh (1974) [9], Fluks và Main (1991)

- Pha logarit: Ở pha này mật độ hay sinh khối tế bào tăng lên với tốc độ nhanh nhất, theo cấp số nhân do tảo hấp thụ chất dinh dưỡng mạnh và tăng tốc độ sinh sản

- Pha gia tốc âm: Được đặc trưng bởi tốc độ tăng trưởng chậm dần so với pha logarit

- Pha cân bằng: Sinh khối tảo không tăng và đạt mật độ cực đại Quá trình quang hợp và phân chia tế bào vẫn xảy ra trong suốt pha này, nhưng số lượng tế bào mới sinh ra gần ngang bằng với số lượng tế bào chết đi, do đó không có sự tăng trưởng của tảo

- Pha tàn lụi: Sinh khối tảo giảm đi một cách rõ rệt do khả năng sinh sản của tảo mất dần sau khi đạt mật độ cực đại

Như vậy, các pha sinh trưởng khác nhau, tốc độ sinh trưởng của tảo cũng khác nhau Ngoài ra tốc độ sinh trưởng của tảo nói chung và tảo Silic nói riêng còn phụ thuộc vào loài tảo nuôi và sự thay đổi của các yếu tố môi trường như: cường độ và chế độ ánh sáng [17], nhiệt độ [15], [22], muối dinh dưỡng [4], [10], mức độ xáo trộn hoặc sục khí môi trường nuôi [15], [17], [20]

1.2 Thành phần sinh hóa của tảo

Thành phần sinh hóa của vi tảo được Brown và ctv (1989) [14] bổ sung trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần của vi tảo (tính theo khối lượng khô của tế bào) Protein 30-55% Thành phần aminoacid tương tự trứng gà Cacbohydrat 10-30% Chủ yếu là polysaccharid

Phospholipid: 10% lipid tổng số Khoáng 10-40% Silic (tảo Khuê), phospho, natri, canxi

Giá trị dinh dưỡng của những loài tảo khác nhau rõ rệt giữa các loài, và ngay giữa các dòng trong cùng một loài cũng khác nhau (Enright và ctv, 1986; Ryther và Goldman, 1975; trích theo Hà Lê Thị Lộc) [3] Ngành

Prymnessiophyceae có hàm lượng lipid 17%, và ngành Eustigmatophyta tảo có

hàm lượng lipid là 17% khối lượng khô tế bào Giống Navicula và Nitzschia

thuộc ngành tảo Silic và có hàm lượng lipid cao nhất, với giá trị trung bình là

18% (trích theo Hà Lê Thị Lộc, 2000) [3] Mặt khác, trong lipid của tảo có chứa một số axit béo không no, có thể mạch ngắn hay mạch dài, rất quan trọng cho động vật tiêu thụ tảo, ngay cả con người cũng không thể tổng hợp được axit béo không no này: DHA (Docosahec xaenoic-acid) chiếm 0,2-11%, EPA (Eicosapentaenoic - acid) chiếm 7-34% khối lượng khô của tảo Đối với 2 loài

tảo Navicula sp và Nitzschia sp., EPA chiếm 1-5%, AA rất cao chiếm hơn 20% khối lượng khô Ngoài ra, ở Navicula sp., DHA chiếm 0,2-1%, và Nitzschia sp

chiếm 1-5% khối lượng khô [13]

Tuy nhiên, giá trị dinh dưỡng của tảo có thể bị thay đổi rất lớn ở các pha sinh trưởng hay ở các điều kiện nuôi khác nhau (ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, pH, muối dinh dưỡng, …) Vào cuối pha logarit, tất cả các loài chứa khoảng 30-40%

protein, 10-20% lipid, 5-15% cacbohydrat [14] Vì vậy, chúng ta cần xác định

thời gian thu hoạch thích hợp để có tảo đạt giá trị dinh dưỡng cao nhất

1.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến sự phát triển của tảo

1.3.1 Ánh sáng

Ánh sáng là nguồn năng lượng chính cho quá trình quang hợp của vi tảo Ánh sáng ảnh hưởng không chỉ đến sự phát triển số lượng của vi tảo, mà còn ảnh hưởng đến thành phần hóa sinh của vi tảo Hầu hết các loài vi tảo sử dụng trong nuôi trồng thủy sản thích ứng với cường độ ánh sáng từ 50 đến 300 µEm-2s-1, tương ứng với thời gian chiếu sáng 12-18 giờ/ngày [16]

Brand và Guillard (1981) (trích theo Thinh, 1999) [23], khi nghiên cứu trên 22 loài tảo cho thấy có một số loài tảo không tăng trưởng trong điều kiện

chiếu sáng liên tục Một số loài tăng trưởng tốt nhất ở chế độ 14 giờ, cũng có một

số thích nghi với thời gian chiếu sáng 12 giờ trong ngày Navicula và Nitzschia

thích nghi với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày [10], [12]

1.3.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến cấu trúc tế bào, tốc độ phản ứng trao đổi chất, sinh trưởng, quá trình quang hợp, mật độ phân bố, cường độ hô hấp, kích thước tế bào và sự thích nghi của loài Vi tảo có thể sống được trong khoảng nhiệt độ 16-30oC Ở nhiệt độ cao hơn 35oC và thấp hơn 16oC, vi tảo phát triển rất kém [3] Tuy nhiên, nhiệt độ được coi là thích hợp cho sự phát triển của hầu hết các loài vi tảo là khoảng 20-25oC (Coutteau, 1996) [15] Một số loài sinh trưởng ngoài tự nhiên ở nhiệt độ thấp, nhưng khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì lại

thích nghi với độ mặn cao hơn Chẳng hạn, Skeletonema costatum ngoài tự nhiên

sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 12-13oC và 14-20oC, trong khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của chúng là 20-30oC (Fogg,

1965) (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10] Navicula sp và Nitzschia sp

có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 10-35oC, trong đó, nhiệt độ tối ưu cho

Nitzschia sp là 20-30oC, và Navicula sp là 26-31oC [10], [12]

1.3.3 Độ mặn

Khả năng chịu đựng sự thay đổi độ mặn của vi tảo biển rất lớn Các loại tảo khác nhau thì khả năng thích nghi của chúng đối với các độ mặn cũng khác nhau Có những loài tảo có khả năng phát triển tốt trong môi trường có độ mặn cao đến hơn 35 ppt, nhưng cũng có những loài chỉ sống được trong môi trường

có độ mặn chỉ vài phần ngàn Hầu hết, các loài tảo sinh trưởng và phát triển được trong khoảng độ mặn 12-40 ppt, nhưng phát triển tốt hơn trong khoảng 20-

35 ppt (Ukeles, 1976; Duerr và Misui, 1982; trích theo Fulks và Main, 1991) [20]

Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu của Hoàng Thị Bích Mai (1995)

[4] cho thấy loài tảo Chaetoceros sp thích hợp phát triển ở độ mặn 20-35 ppt, tốt nhất ở 30 ppt, còn S costatum lại thích hợp phát triển ở độ mặn thấp từ 15-25 ppt,… Tảo Chaetoceros gracilis có thể phát triển tốt như nhau trong khoảng độ

mặn 10-35 ppt (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6] Hầu hết, các loài tảo thuộc giống Nitzschia, Navicula đều là những loài rộng muối, chúng có thể sinh trưởng ở độ mặn dao động từ 5-35 ppt [10], [12] Trong thực tế, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã nuôi Navicula ở độ mặn 25-28 ppt Trong điều kiện bị sốc mặn, khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu, duy trì cân bằng nội môi của tế bào tảo sẽ bị ảnh hưởng Độ mặn cao có thể ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt tính quang hợp, hô hấp, tốc độ sinh trưởng của tế bào tảo [10]

1.3.4 pH

pH được coi là yếu tố biến đổi nội tại, sự biến đổi của nhiệt độ cũng như ánh sáng đều tác động đến pH thông qua quá trình quang hợp của tảo pH của môi trường quá cao hoặc quá thấp đều làm chậm tốc độ tăng trưởng của vi tảo Mỗi loài tảo sinh trưởng tối ưu trong môi trường có pH nhất định pH tốt đối với hầu hết các loài tảo trong khoảng 7-9, và thích hợp nhất từ 8,2-8,7 (Ukeles 1971; trích theo Fulks và Main, 1991) [20] Khoảng pH này cũng thích hợp cho

Navicula sp và Nitzschia sp [10], [12] Tuy nhiên, có những loài chịu được

khoảng dao động pH khá rộng, như Isochrysis galbana có thể phát triển tốt trong

khoảng dao động pH từ 5-9 (Fulk và Main, 1991) [20]

1.3.4 Các yếu tố dinh dưỡng

Dinh dưỡng là yếu tố vô cùng quan trọng, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo cả về số lượng và chất lượng Mật độ tế bào tảo nuôi thường cao hơn nhiều so với mật độ tảo trong tự nhiên, nên việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi là cần thiết Thành phần dinh dưỡng đa lượng cần thiết cho tảo nuôi gồm các muối nitơ, photpho, silic… Các nguyên tố vi lượng tác động đến quá trình trao đổi chất của vi tảo Môi trường bổ sung dinh dưỡng cho tảo đang được sử dụng phổ biến hiện nay cho tảo Silic là môi trường L và L1 (Guillard & Hargraves, 1993) [17] Ở Việt Nam, môi trường bổ sung dinh dưỡng của Hoàng Thị Bích Mai rất phù hợp cho ngành tảo trần, đang được sử dụng phổ biến tại các

cơ quan nghiên cứu và trại nuôi tôm Sú Nha trang [3]

Nitơ:

Mặc dù nitơ chỉ chiếm từ 1-10% khối lượng cơ thể trong hầu hết các loại tảo, nhưng nhu cầu nitơ rất quan trọng đối với sự phát triển của tảo Khi mà amon được sử dụng như nguồn nitơ duy nhất cho tảo thì môi trường pH sẽ giảm nhanh, gây ra một số hiệu ứng phụ ảnh hưởng tới sinh trưởng của tảo Mzapharov và ctv (1974) (trích theo Phan Thị Thu Trang) [10] cho biết tảo có khả năng sử dụng đạm dưới dạng 3 hợp chất: Amoni, nitrat, và nitrit Mỗi loài có nhu cầu sử dụng

hàm lượng nitơ khác nhau Hàm lượng nitơ bổ sung tốt nhất cho tảo Chaetoceros

gracilis là 12,41-17,41 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6] Đối với Navicula sp và

Nitzschia sp , nhu cầu này từ 10-45 ppm, và tốt nhất ở 30 ppm [10], [12]

Photpho:

Là một trong những yếu tố không thể thiếu trong nhu cầu dinh dưỡng của tảo

Nó có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của tảo Chức năng chính của photpho là tham gia vào việc hình thành nhiều hợp chất hữu cơ có vai trò là những khâu chuyển hóa trung gian hoặc những chất có ý nghĩa then chốt trong trao đổi năng lượng và trao đổi chất Hàm lượng photpho cần bổ sung cho hầu

hết các loài vi tảo từ 2,5-15 ppm (trích theo Hà Lê Thị Lộc) [3], cho loài C

gracilis là 2,27-3,27 ppm (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2006) [6] Đối với Navicula sp và

Nitzschia sp ., hàm lượng photpho bổ sung tối ưu khoảng 10 ppm [10] Lượng

photpho nhiều quá hay ít quá đều không tốt cho sự phát triển của tảo [3]

Silic:

Vừa là yếu tố tạo sinh, vừa là nguyên tố tạo nên vỏ silic của tảo Silic Theo Nguyễn Trọng Nho (1972) (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10], silic rất cần cho việc xây dựng vỏ tảo Khuê Nếu thủy vực tồn tại nhiều tảo Khuê thì trong thời kỳ tảo Khuê phát triển mạnh, hàm lượng silic sẽ giảm nhiều, và do đó,

sẽ hạn chế sự phát triển cực đại của tảo Một số tác giả khác chỉ ra rằng khi thiếu silic, tảo Khuê vẫn phát triển bình thường nhưng cấu trúc tế bào sẽ bị thay đổi và khó khăn cho việc xác định loài Cấu trúc phức tạp của vỏ silic giúp cho tảo có khả năng sử dụng đầy đủ ánh sáng mặt trời (trích theo Cao Thị Xoan, 2006) [12] Đối với Chaetoceros gracilis, hàm lượng silic bổ sung tối ưu là 1,49 ppm (Tôn

Nữ Mỹ Nga, 2006) [6] Trong phòng thí nghiệm, Richer (1961) đã nghiên cứu 2

loài tảo Navicula sp và Nitzschia sp và thấy rằng môi trường nuôi chúng nên bổ

sung thêm silic (trích theo Phan Thị Thu Trang, 2006) [10] Hàm lượng silic

thích hợp đối với Navicula sp là 5-30 ppm và tối ưu là 20-30 ppm [12]; còn ở

Nitzschia sp , hàm lượng silic thích hợp từ 5-20 ppm, tốt nhất là 10 ppm [10]

1.4 Khái quát các công trình nghiên cứu nuôi trồng vi tảo

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới

Theo Hans R và Robert A (2005) [18], môi trường nuôi, phương pháp nuôi của tảo được nghiên cứu từ những năm 1800-1900, và kỹ thuật nuôi trồng vi tảo được mô tả trong khá nhiều sách báo, tạp chí Vào thế kỷ 19-20, khá nhiều công trình về nuôi trồng vi tảo được công bố, song phần lớn các công trình này

mô tả cách nuôi vi tảo, ít đề cập đến phương pháp phân lập, lưu giữ các loài tảo này như thế nào, đặc biệt là các loài tảo sống đáy Mặc dù vậy, có thể đề cập đến

một số công trình sau:

Vào năm 1850, mặc dù Ferdinand Cohn đã lưu giữ thành công tảo Lục đơn bào có roi Hamatococcus, song Cohn đã không phân lập được thuần chủng loài tảo này trong phòng thí nghiệm [18] Năm 1971, Famintzin đã nuôi được hai

loài tảo Lục Chlorococcum infusionum, Protcoccus viridis trong môi trường có

chứa muối vô cơ Môi trường này đã được phát minh bởi Knop (1865) khi ông nghiên cứu về thực vật [18]

Báo cáo đầu tiên về nuôi thuần chủng tảo được công bố bởi Beijerinck (1890) [18] Ông đã giới thiệu kỹ thuật nuôi tảo trong môi trường hỗn hợp (nước muối, muối dinh dưỡng và gelatin) Vào năm 1893, ông đã phân lập được 2 loài tảo Lục (Chlorella, Scenedesmus) và một loài tảo Vàng Trebauxia Ngoài ra, Beijerinck còn nuôi thuần chủng một số loài tảo khác (tảo Lam Anabana )

Miquel (Pháp) cũng được xem là người có nhiều đóng góp trong nuôi trồng tảo Từ 1890-1898, ông đã pha loãng tảo tạp trong môi trường có chứa các nguyên tố khoáng khác nhau để phân lập một số loài tảo Silic trung tâm Tuy nhiên, độ thuần chủng của tảo còn rất thấp [18]

Năm 1892, Noll và Oltmanns (Đức) [18] đã xuất bản những bài báo về nuôi trồng tảo, song chủ yếu là về nuôi và lưu giữ tảo chứ không đề cập đến phân lập chúng Năm 1894, Kriiger (Đức) [18] đã nuôi thuần chủng quần lạc tảo Lục, bao gồm Prototheca, Chlorella Năm 1896-1898, Klebs đã phân lập được tảo trong các đĩa petri có agar hay gelatin cho dù tảo vẫn còn bị nhiễm vi khuẩn [17]

Kế đó là Tischutkin (1897) [18], tại Belarus cũng đã nuôi thuần chủng được một

số loài tảo Lam bằng môi trường có agar, nhưng độ thuần chủng cũng không cao hơn

Tại đại học Cambirdge (Mỹ), Ward (1899-1942) [18] đã giới thiệu phương pháp phân lập tảo thuần chủng bằng cách trộn agar, axit axetic loãng với môi trường giàu dinh dưỡng, sau đó đổ vào đĩa petri và nuôi trong phòng thí nghiệm, song một vài ngày sau đó chỉ có một số loài tảo mọc được trên bề mặt agar Tuy nhiên, Ward cũng được xem là người đầu tiên phân lập tảo thành công trên bề mặt môi trường đặc Đến năm 1900, Winkler đã tiến hành thu mẫu tảo ở

vùng nước ngọt xung quanh nhà và ông đã thuần chủng được một số loài tảo nước ngọt bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch Đồng thời, ông cũng đã tìm ra môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của chúng và nuôi ở các thể tích khác nhau (1-5 lít) [24]

Zumstein (1900) [18] cũng đã phân lập được loài tảo Mắt Euglena gracilis

bằng pipet và tách được vi khuẩn khỏi môi trường nuôi mà không ảnh hưởng đến

sự phát triển của tảo Năm 1903, bằng phương pháp phân lập tảo của Miquel, Richter đã lưu giữ được một số loài, trong đó có tảo Silic trung tâm Ở Đức, từ năm 1926 đến 1960 [18], Vischer cũng đã thu và lưu giữ được một số loài thuộc các bộ Vovocales, Euglenales, Cryptomonadales Tại Trung Quốc, nghiên cứu tảo nuôi đã được bắt đầu từ năm 1940 Guo và ctv (1959) đã phân lập và nuôi 2

loài tảo đơn bào Tetraselmis sp và Dunaliella sp (trích theo Hà Lê Thị Lộc,

2000) [3]

Vào năm 1997, Comtois [18] đã phân lập và nuôi thuần chủng được một

số loài tảo Silic bằng phương pháp nhặt tế bào bằng Micropipette, một phương pháp mới và đòi hỏi kỹ thuật khá cao Bristol đã phân lập được tảo Lục từ nhiều môi trường dinh dưỡng khác nhau (môi trường của Detmet, Beierinck 1, và Beierinck 2) Ông cũng là người khẳng định việc phân lập tảo thường khó hơn việc phân lập vi khuẩn kỵ khí [25] Những năm gần đây, các nhà tảo học chủ yếu quan tâm đến việc cải tiến và nâng cao hiệu quả những phương pháp phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối các loài đã công bố trước đây (Robert A Anderden, 2005) [18] Năm 2007, Trường Đại học Murdoch (Úc) đã sử dụng phổ biến 4 phương pháp phân lập tảo (phương pháp pha loãng, nuôi cấy trên môi trường thạch, dùng Micropipette, và phương pháp làm giàu) Đặc biệt, khi phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch, được làm sạch bằng hỗn hợp kháng sinh khi tảo bị nhiễm vi khuẩn: 100 g Peniciline + 25 g Dihydrostreptomysin sulphate (Tôn Nữ Mỹ Nga, 2007) [7]

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều loài tảo (300-400 loài) được phân lập, lưu giữ và nuôi sinh khối nhằm phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau (y học,

công nghệ thực phẩm, nông nghiệp…), nhưng chỉ có khoảng 40-50 loài tảo được

sử dụng làm thức ăn cho các đối tượng nuôi trồng thủy sản (trích theo Thinh, 1999) [23]

1.4.2 Ở Việt Nam

Các công trình nuôi trồng tảo được bắt đầu và phát triển cùng với sự phát triển của nghề nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, các báo cáo khoa học về vấn đề này lại không nhiều, đặc biệt là quá trình phân lập và lưu giữ giống tảo thuần chủng Vào năm 1974, Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Đại Học Nha Trang đã nghiên cứu và nuôi sinh khối ngoài trời một số tảo Lục (Chlorella), tảo Silic (Skeletonema) làm thức ăn cho động vật nổi, thức ăn cho cá và ấu trùng tôm…

Từ năm 1976-1984, Viện Nghiên Cứu Hải Sản Hải Phòng đã có những nghiên cứu về tảo Silic hỗn hợp làm thức ăn cho cá biển Năm 1989, trại giống non nước (liên doanh Vatech) Đà Nẵng đã phân lập và nuôi đại trà tảo Silic trung tâm

Skeletonema costalum làm thức ăn cho ấu trùng tôm đạt kết quả khá tốt [2] Cũng năm 1989, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã phân lập được

Skeletonema costalum tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa Theo Lê Viễn Chí

và cộng sự 1994, Viện Nghiên Cứu Hải Sản Hải Phòng đã lưu giữ và nuôi đại trà

một số loài tảo Silic trung tâm Chaetoceros calcitrans và tảo lục

Chlamydomonas sp , Dunnalliela salina làm thức ăn cho ấu trùng Điệp quạt [10]

Hoàng Thị Bích Mai (1995) [4] đã đưa ra quy trình nuôi 2 loài tảo Silic trung tâm

Chaetoceros sp và Skeletonema costalum làm thức ăn cho ấu trùng tôm sú (giai

đoạn Zoea-Mysis1) Lê Viễn Chí (1996) [1] cũng đã thành công trong nuôi và ứng dụng Skeletonema costalum làm thức ăn cho ấu trùng tôm Sú tại Hải Phòng Năm 1995, Hoàng Thị Bích Mai [4] đã thiết lập được môi trường dinh dưỡng TH04 dùng để phân lập, lưu giữu và nuôi sinh khối một số loài tảo Lục đơn bào

(Chlorella sp., Scenesmus sp., Chlamydomonas sp )

Những năm gần đây, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III đã tiến

hành lưu giữ và nuôi sinh khối các loài tảo Silic (Chaetoceros calcitrans,

Chaetoceros sp , Skeletonema costatum, Navicula sp., Nitzschia sp.), tảo Lục

(Nanochloris sp., Chlorella sp., Tetraselmis sp.), tảo Eutisgmatophyta (Nanochloropsis oculata), tảo vàng ánh (Isochrysis sp.) (trích theo Phan Thị Thu

Trang, 2006) [10] Tuy nhiên, phần lớn các loài tảo trên được di nhập từ nước ngoài (chủ yếu là từ Trung Quốc và từ Úc)

Năm 2005, Vũ Thị Thùy Minh đã phân lập được loài tảo Chlorella sp thu

mẫu từ ao nuôi tôm, và Đoàn Văn Phúc cũng đã phân lập được loài tảo Silic

Pseudo-nitzschia cuspidata tại vịnh Nha Trang trong phòng thí nghiệm Hiện nay, Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản (Đại học Nha Trang) cũng đã và đang lưu giữ

một số loài tảo (Tetraselmis sp., Nanochloropsis oculata, Isochrysis gabana) làm

thức ăn chp Artemia, Rotatoria để nuôi ấu trùng cá chẽm…

Tóm lại, có khá nhiều loài tảo (chủ yếu là tảo Lục và tảo Silic) được phân lập, lưu giữ và nuôi đại trà làm thức ăn cho đối tượng nuôi trồng thủy sản Nhưng

việc đề cập đến phương pháp phân lập và lưu giữ hai loài tảo Navicula sp.,

Nitzschia sp thì ở Việt Nam chưa thấy có tài liệu nào đề cập đến Hiện nay, trên

thế giới đã có 4 phương pháp phân lập thường được sử dụng để thu tảo thuần chủng: nhặt tảo bằng Micropipet, pha loãng, nuôi cấy trên môi trường agar hoặc gelatin, hay phương pháp làm giàu [26] Tuy nhiên, việc ứng dụng các phương pháp trên vào nuôi tảo ở Việt Nam còn chưa phổ biến Các loài tảo dùng làm thức ăn cho đối tượng nuôi trồng thủy sản (đặc biệt là giai đoạn ấu trùng) chủ yếu được nhập giống thuần chủng từ nước ngoài và được lưu giữ trong phòng thí nghiệm Hiện nay, một số loài đã bị tạp, nhiễm vi khuẩn hoặc thoái hóa

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng: Tảo Silic lông chim sống đáy Navicula sp và Nitzschia sp

2.1.2 Thời gian: 30/07/2007 đến 10/11/2007

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu: Trường Đại Học Nha Trang

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu

Môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp

Nhân sinh khối Phân lập

Nuôi cấy trên môi trường thạch

Tảo giống thuần chủng Lưu giữ tảo

Nhân sinh khối

Nhân sinh khối Thời gian lưu giữ thích hợp Lưu giữ giống thuần chủng

Môi trường F2, 7-8oC

2.2.2 Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, nước và môi trường thí nghiệm

2.2.2.1 Dụng cụ thí nghiệm

- Lưới vớt thực vật nổi, động vật nổi, các chai nhựa để thu mẫu

- Sử dụng các đĩa petri để phân lập tảo, các bình nón 100 ml, 300 ml, 500 ml,

1000 ml để lưu giữ và nuôi thí nghiệm Ngoài ra còn có các dụng cụ khác như: lamen làm giá thể, pipet Pasteur, pipet 2 ml, 10 ml, đũa thủy tinh, cốc thủy tinh, các ống nghiệm, que cấy… Tất cả các dụng cụ được rửa bằng xà phòng, nước máy, để khô, sau đó đưa vào tủ sấy vô trùng ở 105oC, trong thời

gian 12 giờ

2.2.2.2 Nguồn nước

- Nước biển được lấy từ vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa, nước biển được bơm lên bằng máy bơm, được xử lý bằng chlorine và lọc bằng hệ thống bể lọc tại trại sản xuất giống nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang Sau

đó, để lắng và sục khí nhằm làm bay hơi dư lượng chlorine còn trong nước

- Nước ngọt: Nước cất tại phòng thí nghiệm Môi trường - Trường Đại Học Nha

b ppt (a-c) Vb

Hình 2.2 Cách pha độ mặn Trong đó:

a, b, c: Độ mặn tương ứng của nước mặn, nước ngọt và nước sau khi hòa trộn

Va, Vb: thể tích nước ngọt và nước mặn để trộn lẫn

2.2.2.3 Kiểm tra các yếu tố môi trường

- Nhiệt độ nước được đo bằng nhiệt kế thủy ngân (0 đến 100oC)

- Độ mặn được đo bằng khúc xạ kế

- pH đo bằng test pH

2.2.3 Nguồn tảo

- Địa điểm thu mẫu: Tảo được thu tại các địa điểm cầu Xóm Bóng - Nha Trang

- Cách thu mẫu: Mẫu tảo được thu bằng cách rũ các đám rong, hoặc dùng que gạt nhẹ các viên gạch, đá, lọc lại bằng lưới vớt thực vật nổi, cho vào chai nhựa mở nắp Sau đó đưa về phòng thí nghiệm lọc lại bằng lưới vớt động vật

nổi để loại bỏ các động vật nổi và các cặn bẩn

- Tiến hành nhân sinh khối bằng các bình nón 500 ml, với môi trường dinh dưỡng HBM-95, sau đó đặt ở điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ phòng thí nghiệm (28-30oC), kiểm tra tảo hàng ngày Sau 4-5 ngày, khi tảo phát triển tốt (mật độ dày, màu vàng nâu đậm, tế bào tảo quan sát dưới kính

hiển vi rõ nét), ta có thể tiến hành lấy mẫu phân lập

2.2.4 Pha môi trường dinh dưỡng dùng trong các thí nghiệm

Môi trường HBM-95 (Hoàng Thị Bích Mai, 1995) [4]

Để tránh kết tủa trong dung dịch, ta pha thành các dung dịch khác nhau:

(KNO3: KHPO4: Na2SiO3: EDTA: FeCl3 = 3: 1: 1: 1:0,5)

- Dung dịch 1: KNO3: 30 g

KH2PO4: 10 g

Na2EDTA: 10 g Nước: 1 lít

- Dung dịch 2: Na2SiO3 9 H2O: 10 g

Nước: 1lít

- Dung dịch 3: FeCl3 6H2O: 5 g

Nước: 1 lít Đưa các dung dịch đã pha vào vô trùng bằng nồi thanh trùng ở 120oC, áp suất 1,5 atm, trong thời gian 20 phút

Cách bón phân: 1 ml dung dịch 1 + 1 ml dung dịch 2 + 1 ml dung dịch 3 cho vào 1 lít nước nuôi cấy tảo

Môi trường F2 (Guillard, 1975) [17]

- Vitamin: Thiamin (B1): 0,1 mg/l

Biotin (B6): 0,0005 mg/l Riboflavin (B12): 0,0005 mg/l Cách bón: Mỗi lần bón lấy 1 ml dung dịch 1+ 1 ml dung dịch 2 + 1 ml hỗn hợp vitamin cho vào 1 lít nước tảo nuôi

2.2.5 Phương pháp phân lập

- Quá trình phân lập sử dụng môi trường dinh dưỡng HBM-95 (Hoàng Thị Bích Mai, 1995) [4] Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.2.5.1 Phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch

- Chuẩn bị môi trường thạch: Pha 10 g agar với 500 ml nước biển trong cốc thủy tinh 1 lít và bổ sung môi trường dinh dưỡng HBM-95

- Đun sôi cho tan agar rồi cho vào đĩa petri (10 ml/đĩa)

- Khi thạch đông, nguội, nhỏ 1 ml mẫu tảo hỗn hợp vào bề mặt thạch và tráng đều

- Đậy nắp lại và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang (thời gian chiếu sáng

12 giờ/ngày)

- Sau 4-5 ngày thấy xuất hiện các quần lạc tảo màu vàng nâu có hình dạng khác nhau trên bề mặt thạch, đem soi dưới kính hiển vi, dùng que cấy lấy mẫu từ khuẩn lạc của loài cần phân lập

- Tảo được chuyển qua nuôi trong các ống nghiệm có chứa 1 ml dung dịch đã pha

- Tiến hành thuần chủng lại để tránh sau khi phân lập có thể lẫn tảo tạp, bằng cách nuôi tảo trong các ống nghiệm Sau khoảng 1 tuần, lọc lấy phần dịch nước tảo, cấy lại trong môi trường thạch, ta có thể thu được tảo có độ thuần chủng cao hơn

2.2.5.2 Phân lập bằng phương pháp pha loãng

Navicula sp

- Chuẩn bị 10 đĩa petri, mỗi đĩa chứa 9 ml môi trường đã pha dinh dưỡng nuôi tảo và đề nhãn từ 10-1 đến 10-10 để chỉ số lần pha loãng

- Đặt các lamen vào mỗi đĩa tạo vật bám cho tảo

- Dùng pipet hút 1 ml tảo mẫu thu ngoài tự nhiên đã nhân sinh khối đưa sang đĩa petri đầu tiên 10-1 và khuấy nhẹ nhàng cho đều

- Tiếp tục hút 1 ml từ đĩa 10-1 sang đĩa 10-2 và khuấy nhẹ

- Lặp lại như vậy cho tới đĩa petri thứ 10 (10-10)

Nitzschia sp

Ở đĩa có độ pha loãng 10-2, quan sát ta thấy Nitzschia sp chiếm ưu thế, tôi

tiến hành pha loãng mẫu ở đĩa petri có độ pha loãng 10-2 Mục đích để phân lập được Nitzschia sp thuần chủng Phương pháp pha loãng Nitzschia sp cũng tiến

hành tương tự như phương pháp pha loãng Navicula sp., nhưng chỉ pha loãng đến

đĩa 10-5 do mật độ tế bào ở đĩa 10-2 (khi pha loãng Navicula sp.) không lớn bằng

mẫu tảo thu ngoài tự nhiên Ta dùng lamen cào nhẹ tảo trên vật bám (lamen), đảo đều và tiến hành pha loãng

2.2.6 Xác định điều kiện lưu giữ tảo thích hợp

2.2.6.1 Xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp

Bảng 2.1 Các lô thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ

thích hợp đối với tảo Navicula sp và Nitzschia sp

Lô thí nghiệm STT Điều kiện

Điều kiện lưu giữ: Mật độ: 20 x 104 tb/ml

- Sau đó, tiến hành nuôi sinh khối ở các bình tam giác thể tích 500 ml trong điều kiện:

- Xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp cho mỗi loài

- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần