Phân lập và xác định khả năng gây bệnh lở loét của vi khuẩn Vibrio trên cá ngựa (Hippocampus spp.) tại các trại nuôi ở Nha Trang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------PHAN THỊ THẢO PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH LỞ LOÉT CỦA VI KHUẨN VIBRIO TRÊN CÁ NGỰA HIPPOCAMPUS SPP... TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ----

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- -PHAN THỊ THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH

LỞ LOÉT CỦA VI KHUẨN VIBRIO TRÊN CÁ NGỰA (HIPPOCAMPUS SPP.) TẠI CÁC TRẠI NUÔI

Ở NHA TRANG

Nha Trang, năm 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- -PHAN THỊ THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH

LỞ LOÉT CỦA VI KHUẨN VIBRIO TRÊN CÁ NGỰA (HIPPOCAMPUS SPP.) TẠI CÁC TRẠI NUÔI

Ở NHA TRANG

Nha Trang, năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Được sự phân công của Bộ môn Công nghệ sinh học, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, tôi thực hiện đồ

án tốt nghiệp tại Phòng Vi sinh - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường trong thời gian từ ngày 02/08/2012 đến ngày 02/06/2013

Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp, tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến

cô Văn Hồng Cầm, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Đặng Thúy Bình – Viện phó Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, chủ nhiệm đề tài “Bảo tồn và lưu trữ nguồn gene các loài

ốc cối (Conus spp.), trai tai tượng (Tridacna spp.) và cá ngựa (Hippocampus spp.) ven biển Nam Trung Bộ và Nam Bộ, Việt Nam” đã tạo điều kiện để tôi được thực hiện các nghiên cứu trong mảng bệnh học trên cá ngựa của đề tài Xin chân thành cảm ơn ThS Trương Thị Thu Thủy - cán bộ quản lý Phòng Vi sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua Xin chân thành cảm ơn!

Do bước đầu làm quen với môi trường nghiên cứu khoa học, kinh nghiệm còn hạn chế nên có thể còn nhiều điều thiếu sót Kính mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý thầy cô giáo và các bạn

Nha Trang, tháng 6 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Phan Thị Thảo

DANH MỤC VIẾT TẮT

APW Alkaline Peptone Water

ATCC American Type Collection Culture

(Bộ sưu tập chủng chuẩn của Mỹ)

CFU Colony-forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

FDA U.SFood and Drug Administration

(Cục Quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ) KIA Kligler Iron Agar

(Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RV Rappaport – Vassiliadis

TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salf Sucrose

VP Voges - Proskauer

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC VIẾT TẮT ii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cá ngựa 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của cá ngựa 3

1.1.2 Giá trị của cá ngựa 9

1.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá ngựa (Hippocampus spp.) trên thế giới 11

1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh trên cá ngựa (Hippocampus spp.) ở Việt Nam 13

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản 14

1.3 Mục tiêu của đề tài 15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phân lập vi sinh vật 18

2.3.2 Giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hóa 20

2.4 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được 21

2.5 Lập kháng sinh đồ 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Kết quả 23

3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn 23

3.1.2 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được 27

3.1.3 Kháng sinh đồ 31

3.2 Thảo luận 34

3.2.1 Định danh vi khuẩn dựa trên các đặc điểm sinh hóa và 16S rDNA 34

3.2.2 Độc lực của các chủng phân lập được 35

3.2.3 Khả năng mẫn cảm với kháng sinh 36

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

4.1 Kết luận 37

4.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu tạo của cá ngựa 4

Hình 1.2: a) Loài Hippocampus kuda 6

Hình 1.2: b) Loài Hippocampus spinosissimus 6

Hình 1.3: Bản đồ phân bố cá ngựa trên thế giới (Project Seahorse, 1999) 7

Hình 1.4: Bản đồ phân bố cá ngựa đen Hippocampus kuda và cá ngựa gai Hippocampus spinosissimus (Lourie và cs., 1999) 8

Hình 1.5: Một số loài cá ngựa tại vùng biển Khánh Hòa 9

Hình 1.6: Cá ngựa đen (Hippocampus kuda) bị bệnh lở loét bị bạc da và lở loét đuôi 16

Hình 2.1: Sơ đồ xác định chủng vi sinh vật 19

Hình 2.2: Cá ngựa đen được gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm vây ngực 22

Hình 3.1: a) Chủng TNX-X1 trên môi trường TCBS 25

Hình 3.1: b) Chủng TNX-X1 phát sáng trên môi trường NA + NaCl 3% 25

Hình 3.2: Chủng YR-X2 trên môi trường TCBS 25

Hình 3.3: a) Biểu hiện của cá ngựa sau khi cảm nhiễm chủng TNX-X1 28

Hình 3.3: b) Biểu hiện của cá ngựa sau khi cảm nhiễm chủng YR-X2 28

Hình 3.4: Tỷ lệ cá chết tích luỹ (%) theo thời gian cảm nhiễm 2 chủng vi khuẩn TNX-X1 và YR-X2 28

Hình 3.5: LD50 do chủng vi khuẩn TNX-X1 gây ra trên cá ngựa đen (H kuda) sau khi cảm nhiễm 29

Hình 3.6: LD50 do chủng vi khuẩn YR-X2 gây ra trên cá ngựa đen (H kuda) sau khi cảm nhiễm 30

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng vi khuẩn TNX-X1 và YR-X2 26

Bảng 3.2: Kết quả cảm nhiễm chủng TNX-X1 trên cá ngựa đen H kuda 29 Bảng 3.3: Kết quả cảm nhiễm chủng YR-X2 trên cá ngựa đen H kuda 30

Bảng 3.4: Kết quả xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của hai

chủng vi khuẩn TNX-X1 và YR-X2 31

Bảng 3.5: Kết quả so sánh trình tự 16S rDNA của TNX-X1 với các dữ trên

Genbank 33

LỜI MỞ ĐẦU

Cá ngựa (Hippocampus spp.) phân bố khắp các vùng nhiệt đới Ấn Độ - Thái

Bình Dương (Lourie và cs., 1999) Chúng thường sống ngụy trang trong các thảm

cỏ biển, rạn đá, rạn san hô Từ lâu, cá ngựa được biết đến là nhóm động vật thủy sản

có giá trị cao trong y - dược học Hằng năm, trên thế giới, có khoảng 20 triệu cá ngựa được đánh bắt từ tự nhiên (Vincent, 1996) với mục đích: điều trị nhức mỏi, viêm nhiễm, yếu sinh lý hoặc khó sinh nở (Ryan và Ray, 2004; Trương Sỹ Kỳ và

Đỗ Hữu Hoàng, 2006; Ryua và cs., 2010) Cá ngựa không chỉ dùng làm thuốc chữa bệnh mà còn được làm cá cảnh Do nhu cầu tiêu thụ cá ngựa ngày càng lớn làm nguồn lợi cá ngựa ngoài tự nhiên giảm Theo Hilomen-Garcia (1999), ở một số vùng, lượng khai thác cá ngựa giảm 50% chỉ trong vòng 5 năm Vì lý do đó, cá ngựa trở thành đối tượng được nhiều nhà nghiên cứu bảo tồn thiên nhiên chú ý và được nhiều ngư dân nuôi trồng thủy sản quan tâm (Trương Sĩ Kỳ, 2000)

Gần đây, cá ngựa đã trở thành đối tượng nuôi của nhiều quốc gia trên thế

giới Ở Ấn Độ, cá ngựa đen Hippocampus kuda được nuôi phổ biến (Raj và cs.,

2010) Tại Iloilo (Philippines), Sở Nuôi trồng và phát triển thủy sản Đông Nam Á

(SEAFDEC) đã tiến hành nuôi và sản xuất giống cá ngựa Hippocampus kuda

(Bleeker, 1852) Ở Việt Nam, nuôi cá ngựa đã được phát triển ở nhiều nơi như: Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bà Rịa-Vũng Tàu…

Trong thời gian qua, để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong và ngoài nước, các cơ

sở, trại nuôi đã mở rộng quy mô sản xuất lớn Tuy nhiên, các cơ sở nuôi cá ngựa luôn phải đối mặt với các vấn đề như điều kiện dinh dưỡng không đảm bảo, đặc biệt

là bệnh xảy ra đã làm cá ngựa chết hàng loạt trong thời gian ngắn (Truong, 1998; Murugan và cs., 2009)

Cá ngựa là loài có khả năng đề kháng yếu, rất dễ nhiễm các tác nhân gây

bệnh Trong số các vi khuẩn gây bệnh lở loét ở cá, Vibrio được công bố nhiều nhất

là tác nhân gây bệnh trên nhiều loài cá nước mặn Hiện đã có nhiều công trình trong

và ngoài nước nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh của vi

khuẩn Vibrio trên nhiều loài cá Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về bệnh trên

cá ngựa vẫn còn hạn chế

Từ những lý do trên, tôi nghiên cứu đồ án “Phân lập và xác định khả năng

gây bệnh lở loét của vi khuẩn Vibrio trên cá ngựa (Hippocampus spp.) tại các

trại nuôi ở Nha Trang” Qua nghiên cứu này, tôi phân lập, định danh và xác định

độc lực của một số chủng vi khuẩn phân lập trên cá ngựa có biểu hiện bệnh Đồng thời xác định khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được, góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho việc ngăn ngừa và điều trị bệnh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cá ngựa

1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của cá ngựa

1.1.1.1 Đặc điểm sinh học

Cá ngựa thuộc bộ phụ cá Chìa Vôi, họ Syngnathidae, giống Hippocampus và

xuất hiện cách đây ít nhất 40 triệu năm (Fritzsche, 1980) Kích thước của các loài cá

này thay đổi khá lớn, loài nhỏ nhất H minotaur (được tìm thấy ở Úc) chỉ dài 10 – 20mm, trong khi đó loài H ingens ở Thái Bình Dương dài đến 300mm (Vincent,

1996) Cá ngựa có hình dáng kỳ lạ, đầu giống đầu ngựa, mõm hình ống, không có răng, thân không có vảy, không có vây đuôi như các loài cá thông thường khác Cơ thể cá ngựa có nhiều vòng xương ở thân và đuôi Cá thường bơi đứng, di chuyển chậm Do khả năng di chuyển chậm nên cá thường sống ngụy trang trong các thảm

cỏ biển, rạn đá, rạn san hô và có thể thay đổi màu sắc cơ thể theo môi trường sống

để trốn tránh kẻ thù Đặc biệt, cá ngựa là loài duy nhất có con đực đẻ con Do đó, cá ngựa đực trưởng thành có túi ấp dưới phần bụng, cá ngựa cái không có túi này Khi buồng trứng đạt đến giai đoạn chín muồi thì cá cái chuyển trứng của mình vào túi

ấp trứng của con đực - nơi trứng được thụ tinh Tùy thuộc vào loài và nhiệt độ nước

mà quá trình mang thai có thể kéo dài từ 10 ngày đến 6 tuần (Lourie và cs., 1999)

Cá ngựa con được sinh ra và sống độc lập, không nhận được sự chăm sóc từ cá bố

mẹ Hầu hết các loài cá ngựa đẻ từ 100 - 200 cá ngựa con trong mỗi đợt sinh nở (Vincent, 1996)

Hình 1.1: Cấu tạo của cá ngựa

(Nguồn: Sarah Jones, Florida Institute of Technology:

http://www.sms.si.edu/irlspec/images/Hippoc_erectu_draw.jpg)

Cá ngựa con ăn được nhiều loại động vật phù du khác nhau và động vật giáp xác cỡ nhỏ Chế độ ăn uống của cá ngựa thay đổi khi chúng lớn (Lourie và cs.,

1999) Thức ăn chính của cá ngựa lớn là những động vật phù du Copepoda, tôm

Mysidaceae và Artemia, đặc biệt chúng chỉ ăn những con mồi còn tươi sống Trong

điều kiện nuôi nhốt, chúng có thể ăn thức ăn nổi, ăn đáy hoặc ăn những con mồi bám vào thành bể Cá ngựa theo dõi con mồi ở nhiều tư thế và vị trí khác nhau Khi phát hiện con mồi, cá chọn vị trí thích hợp rồi bất chợt tấn công, khi đớp mồi có phát ra tiếng tép (Trương Sĩ Kỳ, 2000) Trên thế giới có tất cả 32 loài cá ngựa

(Lourie và cs., 1999) Ở Australia tìm thấy một số loài như H abdominalis (cá ngựa bụng lớn), H angustus (cá ngựa bụng hẹp), H bargibant (cá ngựa Bargibant), H breviceps (cá ngựa mõm ngắn), H histrix (cá ngựa gai dài), H minotaur (cá ngựa Bullneck), H planifrons (Dahl's Seahorse), H whitei (cá ngựa vương niệm), H spinossissimus (cá ngựa gai), H zebra (cá ngựa vằn), ở Bắc Mỹ có H erectus (cá

Thân

Mắt Mắt

Vây lưng

Vây ngực Vây ngực

ngựa đốm trắng), H ingens (cá ngựa Thái Bình Dương), H reidi (cá ngựa Brazil); ở châu Âu có H hippocampus (cá ngựa mõm ngắn), H ramulosus (cá ngựa mõm dài), Hippocampus algiricus (cá ngựa Tây Phi) được tìm thấy ở bờ biển phía tây của châu Phi và nhiều loài cá ngựa ở Ấn Độ - Thái Bình Dương như H kelloggi (cá ngựa thân trắng), H borboriensis…

Vì cá ngựa thay đổi màu sắc rất linh hoạt để phù hợp với môi trường sống nên việc xác định loài thường gặp nhiều khó khăn, vì thế chúng có tới 120 tên gọi khác nhau Vincent (1996) cho rằng cá ngựa có màu đen (tên thông thường của loài

H kuda) là tên gọi chung cho ít nhất 10 loài riêng biệt và được dân gian dùng làm

thuốc chữa bệnh từ lâu

Theo ITIS (Integrated Taxonomic Information System - Hệ thống phân loại sinh vật quốc tế) cá ngựa được phân loại như sau :

Giới: Animalia (Động vật)

Ngành: Vertebrata (Động vật có xương sống)

Lớp: Osteichthyes (Cá xương)

Bộ: Gasterosteiformes Họ: Syngnathidae (Cá chìa vôi)

Giống: Hippocampus (Cá ngựa)

Như đã nói trên, có khoảng 32 loài cá ngựa khác nhau Tuy nhiên, trong nội

dung bài viết, tôi trình bày về việc phân lập vi khuẩn Vibrio gây bệnh lở loét trên 2 đối tượng chính: Hippocampus kuda (cá ngựa đen) và Hippocampus spinosissimus

(cá ngựa gai)

Cá ngựa đen (Hippocampus kuda)

Cá có màu đen hoặc nâu Đôi khi cá có màu vàng và sự thay đổi màu và hiện tượng này chỉ xảy ra đối với con cái Chiều dài cá khai thác dao động từ 80 –

160mm (Trương Sĩ Kỳ, 2000)

Cá sinh sản quanh năm, mùa đẻ chủ yếu vào tháng 4 - 5 và tháng 9 – 12 (Trương Sĩ Kỳ và Đoàn Thị Kim Loan, 1994) Cá cái chín muồi sinh dục ở kích

thước 100 mm (khoảng 1 năm tuổi) Cá ngựa đực 1 năm tuổi có kích thước 90 mm

đã chín muồi sinh dục có thể nhận trứng để ấp trong túi của mình, mỗi cá thể đực có thể nhận 231 - 1405 trứng để ấp trong túi (Trương Sĩ Kỳ và Đoàn Thị Kim Loan, 1994) Thời gian phát triển phôi là 17 ngày ở nhiệt độ nước 27 - 300C (Trương Sĩ

Kỳ và Đoàn Thị Kim Loan, 1994; Foster và Vincent, 2004) Cá bột sau khi nở vẫn nằm trong túi ấp của cá bố, dinh dưỡng nhờ khối noãn hoàng lớn ở bụng đến khi phát triển hoàn chỉnh thành cá con thì cá bố đẻ con vào môi trường Nếu vì một lý

do nào đó trứng trong túi ấp không nở thì cá cũng sẽ chết (Trương Sĩ Kỳ, 1994).

Cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus)

Cá ngựa gai có màu vàng hoặc nâu, đôi khi có các đốm trên thân với những màu khác nhau Thân và đuôi có nhiều gai nhọn Chiều dài khai thác dao động từ 70-170mm (Trương Sĩ Kỳ, 2000)

Cá sinh sản quanh năm, mùa sinh sản chủ yếu vào tháng 5 - 11 Theo các kết quả nghiên cứu trong bể nuôi thí nghiệm cho thấy, mỗi lứa cá đực ấp từ 205 - 622 trứng, thời gian phát triển phôi ở nhiệt độ 27 - 300C là 11 - 12 ngày (Trương Sĩ Kỳ, 2000)

Hình 1.2: a) Loài Hippocampus kuda b) Loài Hippocampus spinosissimus

Hầu hết cá ngựa được tìm thấy ở độ sâu từ 1 đến 15 mét Phạm vi di chuyển của cá ngựa trong môi trường sống tương đối nhỏ và có sự khác nhau giữa con đực

và con cái Nghiên cứu loài cá ngựa Hippocampus whitei ở Úc cho thấy phạm vi cư

trú của con đực khoảng 1m2, con cái khoảng 100m2 (Vincent, 1996)

Vùng phân bố của cá ngựa (http://www.discoverlife.org/mp/20q?search=Hippocampus+kuda)

Hình 1.3: Bản đồ phân bố cá ngựa trên thế giới (Project Seahorse, 1999)

Cá ngựa thường sống ở độ mặn 30 - 34‰, nhiệt độ nước 25 - 320C, trên

những rạn san hô hoặc những vùng có thảm thực vật lớn (như rong tảo, cỏ biển), độ

trong cao (Trương Sĩ Kỳ, 2000) Chúng dùng đuôi cuốn chặt vào các nhánh cây để giữa cho thân thẳng đứng và không bị dòng nước hay sóng đẩy đi

Cá ngựa đen H kuda và cá ngựa gai H spinosissimus tập trung chủ yếu ở

khu vực Đông Nam Á: Campuchia, Indonesia, Malaysia, Myanmar, Philippines, Thái Lan , Việt Nam và một số nước khác như Australia, Trung Quốc, Pháp, Ấn

Độ, Nhật Bản, Pakistan, Singapore (Lourie và cs., 2004)

Khu vực phân bố của cá ngựa đen và cá ngựa gai

Hình 1.4: Bản đồ phân bố cá ngựa đen Hippocampus kuda và cá ngựa gai

Hippocampus spinosissimus (Lourie và cs., 1999)

Ở Việt Nam, người ta thường thấy cá ngựa ở Vịnh Bắc bộ, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu - Côn Đảo, Kiên Giang, Phú Quốc (Trương Sĩ Kỳ, 2000)

Tại Khánh Hoà có 7 loài cá ngựa đã được tìm thấy, sống chủ yếu ở các rạn san hô, thảm cỏ biển và cửa sông dọc theo bờ biển (Trương Sĩ Kỳ, 2000) Một số loài cá ngựa được tìm thấy tại vùng biển Khánh Hòa như: Cá ngựa gai

(Hippocampus spinosissimus), cá ngựa ba chấm (Hippocampus trimaculatus), cá ngựa đen (Hippocampus kuda), cá ngựa thân trắng (Hippocampus kelloggi), cá ngựa gai nhọn (Hippocampus histrix)

Cá ngựa ba chấm (Hippocampus trimaculatus, Leach và Nodder, 1814)

(http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/5/90/30942/Hai-ma-dieu-can-biet.aspx)

Cá ngựa gai nhọn Cá ngựa thân trắng

(Hippocampus histrix) (Hippocampus kelloggi)

(Kaup, 1856 ) (Jordan và Snyder, 1902)

Hình 1.5: Một số loài cá ngựa tại vùng biển Khánh Hòa 1.1.2 Giá trị của cá ngựa

1.1.2.1 Lịch sử khai thác và sử dụng cá ngựa

Cá ngựa là loài có giá trị xuất khẩu cao Theo người tiêu dùng, cá có màu trắng hoặc màu vàng có chất lượng tốt hơn Gần 77 quốc gia và vùng lãnh thổ có các hoạt động buôn bán và kinh doanh cá ngựa (Project Seahorse, 2006; Salin và Mohankumaran, 2006) Thông thường cá càng lớn giá càng cao, cá ngựa gai và cá ngựa thân trắng có giá trị cao hơn các loài cá khác (Trương Sĩ Kỳ, 2000)

Trong những năm 1980, chỉ tính riêng ở châu Á, tiêu thụ hàng năm được ước tính khoảng 45 tấn cá ngựa Sử dụng cá ngựa với mục đích chữa bệnh tăng 10 lần và tiếp tục tăng từ 8 đến 10% trong mỗi năm sau đó (Vincent, 1996)

Các quốc gia như Trung Quốc, Đài Loan là các nhà nhập khẩu cá ngựa lớn nhất Năm 1992, Trung Quốc tiêu thụ khoảng 20 tấn cá ngựa khô Năm 1994, Đài Loan nhập khẩu khoảng 3.000.000 con cá ngựa (Seahorse culture, 1998) Theo báo

cáo của Vincent (1996), vào năm 1995, có ít nhất 20 triệu con cá ngựa khô đã được giao dịch trên toàn thế giới Các nhà xuất khẩu cá ngựa lớn nhất hàng năm là Ấn Độ với sản lượng bán ít nhất là 1,3 triệu con cá ngựa; Philippines, Thái Lan với sản lượng bán khoảng 3.000kg cá ngựa khô trên thị trường (Vincent, 1996).Tại Australia, các dịch vụ kiểm tra ước tính rằng hơn 150.000 mẫu cá ngựa được xuất khẩu trong khoảng thời gian từ tháng 7 năm 1995 đến tháng 1 năm 1997 (Robert Hill, 1997)

Tại Việt Nam, nhìn chung cá ngựa tiêu dùng trong nội địa không lớn, chủ yếu cá được xuất khẩu ra các khu vực như Trung Quốc, Đài Loan thông qua các Công ty Xuất nhập khẩu Hải sản Sản lượng xuất khẩu được ước tính ít nhất là 5 tấn

cá ngựa trong năm 1996 Các tỉnh miền Trung (từ Đà Nẵng đến Bình Thuận) sản lượng khai thác cá ngựa khoảng 2 tấn khô/năm Hiện nay, trên thị trường Việt Nam, giá mỗi con cá ngựa đen khoảng 20.000 – 30.000 VNĐ tùy thuộc vào kích thước Ở HongKong, giá 1kg cá ngựa khô (chiều dài 150mm trở lên) có thể lên đến 1.200 USD (Trương Sĩ Kỳ, 2000)

1.1.2.2 Giá trị dƣợc liệu của cá ngựa

Cá ngựa không chỉ được dùng làm dược liệu mà còn được làm cá cảnh Trong y học cổ truyền Trung Quốc, cá ngựa đươc xem như một phương thuốc quý

để chữa các bệnh bao gồm bệnh hen suyễn, gãy xương, rối loạn thận Ngoài ra, cá ngựa còn được sử dụng để điều trị nhức mỏi, viêm nhiễm, yếu sinh lý hoặc khó sinh

nở (Trương Sỹ Kỳ và Đỗ Hữu Hoàng, 2006; Ryua và cs., 2010), tác dụng làm giảm kích thước của tế bào ung thư, thúc đẩy quá trình tạo bạch cầu hoặc hóa lỏng các khối

u ở người của cá ngựa đã được công bố (Zhang và cs., 2003)

Theo Đông y, cá ngựa có tính ôn, vị ngọt, không độc Ở Trung Quốc, hàng năm có tới 5.000kg cá ngựa khô làm dược liệu và được ghi đầu tiên vào bộ sách Bản Thảo Cương mục Thập Di của Triệu Học Mẫn (1765) Các nước Đông nam Á

từ lâu cũng dùng cá ngựa để điều chế thuốc chữa bệnh và thuốc bổ (Sách đỏ Việt Nam, 2007)

Một số nghiên cứu chứng minh cá ngựa có thành phần amino acid rất đầy đủ

và có tiền chất của prostaglandine - hormone kích thích quá trình sinh tinh ở nam giới (Đỗ Tuyết Nga, 1991; Lin và cs., 2008; Lin và cs., 2009) Các chất này giúp phục hồi sinh lực nhanh, tái tạo tinh trong thời gian ngắn ở phái nam nhờ vậy tăng

cơ hội thụ tinh ở nhiều cặp vợ chồng hiếm muộn (Zhang và cs., 2003) Trong thực

tế, ngư dân khi bắt được cá ngựa sẽ bảo quản sản phẩm bằng cách ngâm rượu ngay khi cá ngựa còn sống hoặc đem phơi nắng cho khô rồi sau đó ngâm rượu, hoặc sao vàng tán nhuyễn thành bột bán trên thị trường để phục vụ cho các mục đích trên (Hoàng Tùng và cs., 2011)

1.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn ở cá ngựa (Hippocampus spp.) trên

thế giới

Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ cá ngựa trong nước và quốc tế, gần đây nhiều

quốc gia tiến hành nuôi cá ngựa như Australia (H abdominalis), Sri Lanka (H kuda), Việt Nam (H kuda), Indonesia (H kuda), Brazil (H reidi), Mexico (H erectus), Ai-len (H hippocampus) và New Zealand (H abdominalis) (Project Seahorse, 2006) Tuy

nhiên vấn đề về dinh dưỡng và bệnh làm cá chết hàng loạt đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc nuôi cá ngựa (Truong, 1998; Lourie và cs., 1999)

Sự suy thoái môi trường sống, điều kiện quản lý không thích hợp là nguyên nhân dẫn đến sự xuất hiện các tác nhân gây bệnh Phần lớn bệnh do vi khuẩn gây ra làm giảm mạnh số lượng loài trong thời gian qua (Sreepada và cs., 2002)

Trong số các vi khuẩn gây bệnh ở cá biển, Vibrio spp là một trong những

nguyên nhân gây ra các thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế Vi khuẩn này thường có mặt trong môi trường biển và bùng phát dịch bệnh xảy ra khi cá tiếp xúc với tác nhân gây bệnh hiện diện khi điều kiện môi trường bị suy thoái (Austin và Austin,

1993) Các nghiên cứu bệnh trên cá ngựa gần đây cho thấy Vibriosis gây chết với tỉ

lệ hơn 90% (Alcaide và cs., 2001) Ortigosa Moo và cs (1989) cho rằng sự xuất

hiện của V harveyi và V mediterranei liên quan mật thiết với nhiệt độ Vibrio được

phân lập từ nước biển tại Hàn Quốc trong tháng 8 khi nhiệt độ nước và nhu cầu oxy hóa học (COD) cao, độ pH và độ mặn thấp (Kim và cs., 1990) Tỷ lệ phân lập được

chủng V cholerae tăng khi nhiệt độ và lượng chất hữu cơ tăng (Redacliff và cs.,

cs., 2007) Khi nhiễm Vibrio, cơ thể cá trở nên bạc màu, lờ đờ, chán ăn, có các vết

loét đỏ trên cơ thể (Bloch, 1790)

Theo nhiều báo cáo cho thấy rằng vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae xuất hiện rất nhiều trong đường tiêu hóa của loài cá và giáp xác (Dempsey và cs., 1989; Ringo và cs., 1995; Spanggaard và cs., 2000; Oxley và cs., 2002) và loài vi khuẩn

này cũng được phân lập từ đường ruột của cá ngựa H guttulatus trong điều kiện

nuôi nhốt (Balcazar và cs., 2010)

Theo nghiên cứu của Alcaide và cs (2001), Tendencia (2002), Bombardini

và cs (2006), Balcázar và cs (2011), Martins và cs (2010) cho thấy Vibrio harveyi,

V alginolyticus và V splendidus là nguyên nhân chính gây bệnh ở cá ngựa, dấu

hiệu chính là xuất huyết và gây hoại tử trên da

Nghiên cứu của Martins và cs (2010) cho thấy sự xuất hiện bệnh do Vibrio alginolyticus gây ra trên cá ngựa Hippocampus reidi ở Brazil làm ảnh hưởng đến sản lượng cá nuôi ở nước này Vì Vibrio alginolyticus có khả năng sinh độc tố (Lee,

1997) gây tổn thương các cơ quan chức năng như thận, mang và gan cá làm ảnh hưởng đến hoạt động trao đổi chất của cá dẫn đến tỷ lệ chết cao Kết quả của việc phân lập tám mẫu cá ngựa bệnh với các triệu chứng lờ đờ, bỏ ăn, hoại tử ở đuôi được thu thập từ hồ của Viện nghiên cứu biển (IIM-CSIC, Tây Ban Nha) vào giữa

tháng 3 năm 2007 đến tháng 5 năm 2009 đã chứng minh rằng Vibrio alginolyticus

và Vibrio splendidus là nguyên nhân chính gây ra các tổn thương cho cá ngựa

Bên cạnh đó, Vibrio harveyi được báo cáo là một tác nhân gây bệnh cơ hội ở

một số loài cá nước mặn (Austin và Austin, 2007) Theo mô tả của Raj và cs

(2010), Vibrio harveyi là tác nhân gây bệnh đốm trắng, thối đuôi và hoại tử trên cơ thể của cá ngựa nuôi nhốt, Hippocampus kuda Ngoài Vibrio, vi khuẩn Aeromonasspp., Tenacibaculum maritimum cũng là tác nhân gây chết cao ở cá với

triệu chứng lở loét da (Bombardini và cs., 2006) Theo nghiên cứu của Ringo và cs (1995) cho thấy các vi khuẩn được phân lập từ ruột của cá ngựa còn có các chủng

Bacillus spp., Vibrio spp., Staphylococcus sp., Burkholderia sp., Providencia spp., Enterococcus sp., Pseudoalteromonas sp., Phaeobacter spp., Enterovibrio sp và Shewanella spp

Ngoài ra, các khối u trong gan, thận, mang kết hợp với các tổn thương của da

và mang bị ăn mòn đã được Cheung và cs (1980) xác định ở cá ngựa là do tác nhân

ký sinh trùng như Uronemamarinum gây ra

1.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh trên cá ngựa (Hippocampus spp.) ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nuôi cá ngựa được phát triển ở nhiều nơi như: Huế, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Ninh thuận, Vũng Tàu…Tuy nhiên, cá ngựa là loài có khả năng đề kháng yếu, rất dễ nhiễm bệnh do các tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn và nấm(Vincent và Clifton-Hadley, 1989) Theo báo cáo của Trương Sĩ Kỳ (2000), bệnh ở cá ngựa con 5 – 30 ngày tuổi thường gặp là do động vật nguyên sinh

Zoothamnium gây ra Biểu hiện ban đầu là xuất hiện một vài cá thể Zoothamnium ở

đuôi Sau đó chúng sinh sản thành tập đoàn, phủ đầy đuôi cá ngựa như những sợi bông gòn làm cho cá mất khả năng bơi lội và kiếm ăn

Đối với cá trưởng thành, đôi khi thấy xuất hiện bệnh đốm trắng, bệnh phát

sinh do nhiễm Ichthyophthinius mutifiliis Khi nhiễm bệnh, cá thường xuất hiện các

đốm trắng trên thân và đuôi, cá bơi lội kém linh hoạt, thường ở trên mặt nước Sau vài ngày da cá bị phá hủy dần và làm cá chết (Trương Sĩ Kỳ, 2000)

Ngoài các tác nhân nêu trên, cá ngựa có thể bị nhiễm giun tròn, giun dẹp

hoặc các động vật ký sinh bên ngoài như Amyloodinium, Epistylis, Vorticella và một số vi khuẩn gây bệnh như: Vibrio alginolyticus, V anguillarius, …(Trương Sĩ

Kỳ, 2000)

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thủy sản

Bệnh do chi (genus) Vibrio gây ra thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales,

lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria Họ Vibrionaceae có 6 chi, trong

đó chi Vibrio gồm nhiều loài gây bệnh nguy hiểm cho người và động vật (Phạm Hồng Sơn, 2005) Đặc điểm chủ yếu của chi Vibrio là có dạng hình que hoặc hơi uốn cong như dấu phẩy, kích thước 0,3-0,5 x 1,4-2,6µm Hầu hết các chi Vibrio đều

phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp ở 20-40‰ Chúng không hình thành bào tử (Ryan và Ray, 2004) và di động nhờ tiên mao đơn cực (Thompson và cs., 2005) Chúng sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, liên quan đến các động vật biển, một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật

biển Vibrio spp gây bệnh ở cả hai nhóm động vật thủy sản nước mặn và ngọt: cá,

giáp xác, nhuyễn thể Những vi khuẩn này có thể là tác nhân chính hoặc tác nhân cơ hội khi được kết hợp với một hoặc nhiều tác nhân khác Nguyên nhân đầu tiên của bệnh chính là các yếu tố môi trường, yếu tố cơ học hay sinh vật ký sinh (như nấm, virus, kí sinh trùng) gây thương tổn trên bề mặt cơ thể động vật thủy sản nuôi, tạo

điều kiện cho vi khuẩn Vibrio xâm nhập và gây bệnh

Trong các hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao, bể theo

một số con đường: nguồn nước, dụng cụ sản xuất, từ tôm bố mẹ hoặc tôm giống,

đặc biệt là các loại thức ăn tươi sống như Artemia và có thể chúng đã có sẵn trên

thành bể hoặc trong ao nuôi (Khắc Lâm, 2012)

Bệnh ăn mòn da do một số chủng vi khuẩn gây ra như Vibrio alginolyticus (Austin và cs., 1995) hoặc Vibrio mediterranei (Huys và cs., 2001)

luôn là mối đe dọa lớn cho nghề nuôi trồng thủy sản

Các loài trong chi Vibrio là vi khuẩn kỵ khí tùy ý, hầu hết các loài đều cần

ion Na+ để sinh trưởng (Madigan và Martinko, 2005) Hầu hết các loài trong chi

Vibrio đều dương tính với phép thử oxidase và catalase, lên men glucose nhưng

không sinh hơi (Baumann và Schubert, 1984) Các vi khuẩn nhạy cảm với môi trường acid và phát triển tốt nhất ở khoảng pH từ 7,5 - 8,5; chúng bị ức chế ở pH dưới 6,8 và trên 10,2 (Rujiwat, 2007)

Một số loài Vibrio là tác nhân gây bệnh chính trên các loài thủy sản nước mặn như: Vibrio anguillarum, V ordalii, V harveyi, V splendida, V orientalis, V fischeri… Trong báo cáo của Panchayuthapani (1997), V alginolyticus, V costicola,

V harveyi, V splendidus, và V parahaemolyticus là các nguyên nhân chính gâybệnh cho tôm ở Ấn Độ V salmonicida gây bệnh trên cá Hồi (Austin và Austin, 1993) và các loài khác như V vulnificus, V alginolyticus, V splendidus được xem

là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm sú thương phẩm… Một số loài vi khuẩn

Vibrio có khả năng phát sáng như V harveyi, V splendida, V orientalis, V fischeri,

V vulnificus gây bệnh ở nhiều giai đoạn phát triển khác nhau của tôm với các triệu

chứng như nhiễm trùng, hình thành các u trong một loạt các cơ quan bao gồm tim,

mang, gan tụy, lớp biểu bì, làm giảm sút sản lượng tôm nuôi Trong đó, V harveyi được xác định là tác nhân gây bệnh phát sáng ở trai ngọc Pinctada maxima, tôm sú Penaeus monodon (Lavilla-Pitogo và cs., 1990) và tôm he Nhật bản Penaeus japonicus (Pass và cs., 1987; Lavilla-Pitogo và cs., 1990; Karunasagar và cs., 1994; Leano và cs., 1998) và cá chẽm Lates calcarifer (Tendencia, 2002) Bệnh do nhóm

vi khuẩn phát sáng đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở Philipines,

Ấn Độ và Indonesia

Năm 1998, ở Tây Ban Nha, tác nhân gây chết hàng loạt cá ngựa đen

(Hippocampus kuda) và cá ngựa (Hippocampus sp.) được xác định là có liên quan

đến chủng vi khuẩn gây bệnh trên tôm và theo báo cáo của Alcaide và cs (2001)

chủng vi khuẩn đó là V harveyi

1.3 Mục tiêu của đề tài

1.3.1 Mục tiêu nghiên cứu

Tại các trại nuôi cá ngựa ở (Ba Làng, Sông Lô – Nha Trang – Khánh Hòa), tình trạng cá ngựa chết xảy ra càng nhiều và đã được ghi nhận trong thời gian (8/2012 - 12/2012) Cá bệnh thường có các triệu chứng ban đầu như da nhợt nhạt,

cá bị cong đuôi, biếng ăn, bơi lờ đờ; sau đó xuất hiện các vết lở loét trên da, cổ, mõm (Hình 1.6 và 1.7)

Với mục đích phân lập và xác định tác nhân gây bệnh lở loét trên cá ngựa

đen (Hippocampus kuda) và cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus) Xác định

khả năng gây bệnh và khả năng nhạy cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập được Đồng thời, bổ sung các dữ liệu khoa học, làm cơ sở cho việc phát triển nghề nuôi trồng thủy sản nước nhà

1.3.2 Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Thu thập mẫu cá ngựa bệnh (cá ngựa đen và cá ngựa gai) tại các trại nuôi ở

Ba Làng và Sông Lô (Nha Trang – Khánh Hòa)

- Phân lập vi khuẩn Vibrio từ mẫu cá ngựa đen (Hippocampus kuda) và cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus) bệnh

- Giám định hình thái và các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn

Vibrio phân lập được trên cá ngựa đen và cá ngựa gai Định danh các chủng vi sinh

vật phân lập được dựa trên các test sinh hóa và bước đầu giải trình tự gene 16S rDNA

- Xác định độc lực của chủng vi khuẩn phân lập được bằng cách gây cảm nhiễm lên cá ngựa đen khỏe

- Thực hiện kháng sinh đồ cho chủng vi khuẩn phân lập được

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cá ngựa đen Hippocampus kuda (tại 2 trại nuôi cá ngựa thuộc khu vực Ba Làng - Nha Trang - Khánh Hòa) và cá ngựa gai Hippocampus spinosissimus tại

các bể thuần dưỡng (ở Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển nuôi biển - đại lộ Nguyễn Tất Thành - Sông Lô - Phước Đồng - Nha Trang)

- Mẫu cá ngựa bệnh được thu nhận vào tháng 8 đến tháng 12 năm 2012

2.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

- Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh và các thuốc thử dùng trong các phản ứng sinh hóa: APW (Alkaline Peptone Water), TCBS (Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose), KIA (Kligler Iron Agar), Marine Agar (của hãng Himedia - Ấn Độ) (Phụ lục 1) Tryptone Water, MR - PV, thanh thử oxidase…(của hãng Merk - Đức)

- Kit API 20E (BioMérieux – Pháp), máy đo độ đục Densimat (BioMérieux - Pháp), máy định danh vi khuẩn mini API (BioMérieux - Pháp)

- Một số dụng cụ và thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm: Đĩa petri, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm, giá ống nghiệm, tủ cấy, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, máy vortex, …

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập vi sinh vật

Bốn mươi mẫu cá ngựa bệnh (H kuda n =35 và H spinosissimus n = 5)có

dấu hiệu lờ đờ, lở loét trên da (Hình 1.6 và 1.7) từ trại nuôi ở Sông Lô, Ba Làng được thu nhận và chuyểnmẫu vào trong túi nylon có bơm ôxy về phòng thí nghiệm Tiến hành phân lập vi khuẩn sau 1-2h nhận mẫu

Tiến hành rửa cá bằng nước muối sinh lý vô trùng Dùng que cấy vòng lấy mẫu bệnh phẩm ở vùng da cá ngựa cấy ria lên TCBS (Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose) Agar, Nutrient Agar (NA) có bổ sung NaCl đạt nồng độ 3% và Marine Agar (MA) Do kích thước của cá ngựa bệnh phẩm nhỏ (1-2g ± 0,44g, chiều dài khoảng 5 cm ± 0,88cm) (Phụ lục 2), việc xác định vị trí của các nội quan

rất khó khăn Vì vậy, tiếp tục rửa cá bằng nước muối sinh lý vô trùng, sau đó mổ

cá bằng dao mổ và kéo tiệt trùng, đặt que cấy vòng vào trong ruột cá để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy ria lên TCBS Agar, Nutrient Agar (NA) có bổ sung NaCl đạt nồng độ 3% và Marine Agar (MA) theo phương pháp của Tendencia (2004), Raj

và cs (2010) Tất cả các đĩa sau khi cấy ủ ở nhiệt độ 280C trong 24 giờ Các khuẩn lạc khác nhau trên đĩa TCBS và các khuẩn lạc phát sáng trên môi trường

NA, MA sẽ được làm thuần và kiểm tra các đặc tính sinh hóa Một số vi khuẩn phát triển trên môi trường NA và MA được bảo quản lạnh sâu (glycerol, -70°C) trong trường hợp cần tiến hành thêm các nghiên cứu khác

Quy trình xác định chủng vi khuẩn Vibrio được thể hiện ở Hình 2.1

Xác định độc lực

Định danh

Dựa trên các đặc điểm sinh hóa

Bằng 16S rDNA

2.3.2 Giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hóa

Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được chọn để định danh vi khuẩn

(Bảng 3.1) dựa theo các chỉ tiêu chẩn đoán vi khuẩn Vibrio gây bệnh ở thủy sản của

(Pedersen và cs., 1999) Dựa vào nguyên lý, mỗi loại vi khuẩn có một số đặc tính sinh hóa khác nhau bao gồm đặc tính chuyển hóa các loại đường, khả năng sinh các hợp chất trung gian, khả năng sinh hơi…Với các chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành giám định các đặc tính sinh hoá của vi khuẩn gồm khả năng biến dưỡng các loại đường lactose, glucose, sucrose, khả năng sinh H2S, sinh hơi và các phản ứng catalase, urease, … bằng cách sử dụng bộ kit API 20E (Phụ lục 3) và kết hợp với một số phản ứng sinh hóa khác (lactose, oxydase, khả năng phát triển ở các nồng độ NaCl khác nhau (0%, 1%, 3%, 6%, 8%, 10%), khả năng di động, tính nhạy cảm với O/129 (2,4-diamino-6,7-di-isopropyl-pteridine phosphate) và polymyxin để định danh vi sinh vật mục tiêu

Đồng thời các chủng vi khuẩn được kiểm tra hình thái và tính chất bắt màu bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow và Feltham, 2004) soi dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần

Các kết quả sinh hóa sẽ được đọc dựa theo phần mềm của KIT API-20E và phần mềm ABIS (http://www.tgw1916.net/bacteria_logare.html)

2.3.3 Định danh vi khuẩn dựa trên trình tự gene 16S rDNA (16S ribosomal RNA gene)

DNA của vi khuẩn được tách chiết bằng Chelex (Biorad, USA) theo quy trình của nhà sản xuất Lấy khuẩn lạc của vi khuẩn cho vào eppendort có chứa chelex 10% Đặt vào bể ổn nhiệt ở 950C trong 10 phút Tiến hành ly tâm 5000 vòng trong 5 phút Sau đó, hút 200µl cho vào ống eppendorf và vortex

Đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi: 27 F (5'AGATTTGATCCTGGCTCAG3') và 1492 R (5'GGTTACCTTGTTACGACTT3') (Weisburg và cs., 1991) Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25µl với các thành phần như sau : Buffer có MgCl2-10x (2,5µl), DNA (2-20ng), mỗi mồi (0,1µM), dNTP (0,1mM mỗi loại), Dream Taq

Polymerase (1,25U) Chu kì nhiệt của phản ứng được thực hiện theo chu trình của nhà sản xuất Taq polymearase và nhiệt độ bắt cặp là 500C trong 1 phút

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE 1X, ở 85V Sau 10 phút, tiến hành đọc kết quả

Gởi sản phẩm đi giải trình tự (công ty Nam Khoa, thành phố Hồ Chí Minh) Các trình tự được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm Sequencher 4.1.4 và được so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)

Thí nghiệm được thực hiện trên các bể thủy tinh (10L, kích thước bể 23,5cm x 20,5cm x 20cm), có sục khí Các bể được khử trùng bằng chlorine, rửa lại bằng

nước sạch Cho vào mỗi bể 8L nước đã được khử rùng bằng chlorine nồng độ 30ppm, sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine Nhiệt độ nước thích hợp cho

cá ngựa khoảng 28 – 300C, pH dao động từ 7,5 – 7,7 Cá được cảm nhiễm có trọng lượng khoảng 1-2 g/con, khoảng 2-3 tháng tuổi, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt Bố trí ngẫu nhiên 20 con/bể và để cá thích nghi dần với môi trường trong bể khoảng 1 tuần Thí nghiệm được bố trí gồm các nghiệm thức: (1) đối chứng tiêm nước muối sinh lý (0,05 ml/cá); (2 - 5) tiêm vi khuẩn ở các dãy mật độ khác nhau Chủng vi khuẩn phân lập từ cá ngựa bệnh nuôi tăng sinh trên môi trường NA có bổ sung NaCl 3% ủ ở 280C trong 24 giờ Tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau để thử nghiệm độc tính Sau đó, tiêm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn với các nồng

độ khác nhau từ 2.5x108

đến 105 CFU/ml (xác định bằng máy đo độ đục để đạt 0.5McFarland, kiểm chứng tổng số vi khuẩn bằng phương pháp đếm đĩa) vào phần vây ngực cá Theo dõi liên tục biểu hiện của cá ngựa trong khoảng 15 ngày Các nghiệm thức được lặp lại 2 lần Dựa trên tỷ lệ cá chết, xác định LD50 theo phương pháp của Wardlaw (1985)

Hình 2.2: Cá ngựa đen được gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm vây ngực 2.5 Lập kháng sinh đồ

Tính nhạy của vi khuẩn với các loại thuốc kháng sinh được xác định theo

phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch (Huys và cs., 2002) E coli ATCC 25922

được dùng làm chủng tham chiếu Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cấy lên môi trường NA 3% NaCl ở 28°C trong vòng 24 ± 2 giờ Quan sát sự đồng nhất về hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc Lấy khuẩn lạc ở mỗi đĩa NA sau 24 ± 2 giờ nuôi, cho vào ống nghiệm có chứa 5 ml dung dịch 0,85 % NaCl để tạo dung dịch vi khuẩn có độ đục tương ứng với dung dịch chuẩn 0,5 McFarland tương

ủ ở 28°C trong giờ Đường kính vòng vô trùng được đo bằng mm, chủng vi khuẩn trên đĩa MHA tương ứng sẽ được xác định là kháng (R), nhạy (S) hay trung gian (I) với kháng sinh thử nghiệm dựa theo hướng dẫn Ủy Ban Quốc gia về Tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàn - National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2000) (Phụ lục 4)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả

3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn

Từ các mẫu cá ngựa đen H kuda và cá ngựa gai H spinosissimus có biểu

hiện bệnh phân lập được 56 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường TCBS, Nutrient agar 1 - 3% NaCl và môi trường Marine Agar Qua kết quả quan sát

và phân tích các đặc điểm hình thái, sinh lý và một số đặc tính sinh hoá, 56 chủng vi khuẩn phân lập được, chia thành 5 nhóm chính (Phụ lục 5):

Trên cá ngựa đen (H kuda):

- Nhóm 1(9 chủng - nhóm HR): sau 18 – 24h nuôi cấy, khuẩn lạc màu vàng, tròn, bóng trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm Glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose; phát triển được ở nồng độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%

- Nhóm 2 (8 chủng - nhóm SH ): sau 18 – 24h nuôi cấy, khuẩnlạc màu vàng, nhăn, lõm ở tâm trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm.Glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose; phát triển được ở nồng độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%

- Nhóm 3 (6 chủng - nhóm G): sau 18 – 24h nuôi cấy,khuẩn lạc màu xanh, tròn, bóng trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm.Glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose; phát triển được ở nồng độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%

- Nhóm 4 (28 chủng - nhóm TNX): sau 18 – 24h nuôi cấy, khuẩn lạc màu xanh, tròn, bóng trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm sau 18 – 24h nuôi cấy; phát sáng trên môi trường TCBS và môi trường NA + NaCl 3% Glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose, không sinh H2S; phát triển được ở nồng độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%

Trên cá ngựa gai (H spinosissimus):

- Nhóm 5 (6 chủng – nhóm YR): Tất cả các khuẩn lạc đều có màu vàng, tròn, bóng trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm sau 18 – 24h nuôi cấy; glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose; phát triển được ở nồng

độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%

Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu các chủng vi khuẩn có tần suất bắt gặp

nhiều nhất gây bệnh trên cá ngựa đen và cá ngựa gai Trên cá ngựa đen H kuda (n=35), nghiên cứu chủng G và chủng TNX - chiếm đa số trong vi khuẩn được phân

lập từ cá vào tháng 8 – 12 tại Khánh Hòa với tần số bắt gặp là 50% và chủng G

(10,7%) Chủng YR (100%) là chủng được phát hiện trên cá ngựa gai H spinosissimus (n=5)

Đặc điểm sinh hóa, sinh lý và hình thái của 2 chủng vi khuẩn phân lập được

từ cá ngựa được trình bày ở Bảng 3.1 Cả hai chủng TNX và YR có chung một số đặc điểm: Gram âm, hình que ngắn, di động, oxidase, catalase và phản ứng lên men glucose, galactose, mannitol đều dương tính… TNX có khuẩn lạc màu xanh trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm sau 18 – 24h nuôi cấy YR cho khuẩn lạc màu vàng trên môi trường TCBS Đặc biệt là cả 2 chủng đều nhạy cảm với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129, 150 μg) là hợp chất giúp phân biệt vi

khuẩn Vibrio và Aeromonas (West và cs., 1986)

Chủng TNX có thể phát sáng, tuy nhiên khả năng phát sáng chỉ quan sát được khoảng 8h nuôi cấy Kéo dài thời gian nuôi cấy, khả năng phát sáng yếu dần Ngoài ra, trên môi trường NA có bổ sung NaCl 3%, chủng TNX phát sáng mạnh hơn so với trên môi trường Marine Agar (MA)

Trong nhóm TNX, YR và G chọn ngẫu nhiên chủng TNX-X1; YR-X2; G-X1

để nghiên cứu độc tính của vi khuẩn (chủng G-X1 được xác định không có độc tính nên chúng tôi không trình bày kết quả theo sau)