Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tại các trại nuôi cá ngựa ở Ba Làng, Sông Lô (thành phố Nha Trang - tỉnh Khánh Hòa), cá ngựa bị nhiễm tác nhân gây bệnh Vibrio spp..
Vibrio spp. có tính đa hình cao, hệ thống định danh khá phức tạp. Sử dụng đặc điểm sinh hóa khó có thể định danh chính xác đến mức loài, đặc biệt đối với V. harveyi (Chatterjee và Haldar, 2012). Gene 16S rRNA và các housekeeping gene khác được sử dụng rộng rãi trong định danh Vibrio ở mức độ sinh học phân tử (Wiik và cs., 1995). Tuy nhiên công trình nghiên cứu của Wiik và cs. (1995) cho thấy rằng 16S rDNA không định danh được tất cả các loài Vibrio khác nhau. Kết quả định danh dựa trên đặc tính sinh hóa cho thấy chủng TNX-X1 có khả năng là V. harveyi (89%), V. vulnificus (88%), V. parahemolyticus (86%), V. campbelli (88%). Tuy nhiên, trong 4 vi khuẩn nói trên, cho đến nay hiện chỉ có V. harveyi và V. vulnificus được biết đến có khả năng phát sáng (FDA, 1998). Dựa trên gene 16S rRNA, chủng TNX-X1 tương đồng với các chủng V. harveyi, V. rotiferianus, V. campbelli. Tổng hợp các thông tin nói trên, mặc dù TNX-X1 có khả năng là Vibrio harveyi, cần tiến hành thêm một số kỹ thuật khác để định danh được chính xác và tin cậy hơn.
Tại các trại nuôi trong khu vực thành phố đều có các biện pháp xử lý bể, xử lý nguồn nước đầu vào, chọn con giống khỏe mạnh; có chế độ thay nước và vệ sinh phù hợp nhưng vẫn xảy ra tình trạng nhiễm bệnh. Được biết, thức ăn chính của cá ngựa nuôi là tép Mysidaceae, Artemia, Copepoda được vớt ngoài tự nhiên. Do vậy, thức ăn có thể là nguồn gốc của tác nhân gây bệnh trên cá ngựa. Báo cáo của Tendencia (2004) cũng đã công bố trong nguồn thức ăn chính của cá ngựa tại Philippines là các nhóm Ascetes spp. có lượng lớn vi khuẩn phát sáng.
V. harveyi đã được xác định là tác nhân gây bệnh phát sáng ở trai ngọc
Pinctada maxima, tôm sú Penaeus monodon và tôm he Nhật bản Penaeus japonicus. Hiện cũng đã có một số công bố về Vibrio harveyi gây bệnh trên cá ngựa
ở Philippines và Ấn Độ (Tendencia, 2004; Raj và cs., 2010). Kết quả thí nghiệm của chúng tôi, một lần nữa khẳng định V. harveyi có khả năng gây bệnh không những trên tôm mà còn ảnh hưởng đến sức sống của cá ngựa.
3.2.2 Độc lực của các chủng phân lập đƣợc
Kết quả cảm nhiễm chủng vi khuẩn phân lập được có thể khẳng định tác nhân gây bệnh lở loét, mòn da trên cá ngựa đen Hippocampus kuda trong điều kiện thí nghiệm giống với các biểu hiện bệnh trên cá ngựa tại các trại nuôi trong khu vực thành phố Nha Trang. Cá ngựa sau khi cảm nhiễm chủng TNX-X1 và chủng YR-X2 ở các nồng độ khác nhau, cá xuất hiện triệu chứng bệnh như da nhợt nhạt, da cá bị ăn mòn tại vị trí tiêm rồi lan dần tới các vùng khác, đặc biệt có nhớt trên vùng tiêm, vùng đuôi hoặc toàn thân. Ngoài ra, tiến hành cảm nhiễm ở những nồng độ khác nhau cho tỉ lệ chết, thời gian chết và biểu hiện bệnh khác nhau.
Trong nghiên cứu này, LD50 trên cá ngựa (1-2g) được xác định là 5 x 106 CFU/cá (chủng TNX-X1) và 3.0 x 105 CFU/cá (chủng YR-X2) tại cùng vị trí tiêm là vây ngực và trong cùng thời gian 12 ngày. Như vậy, độc lực chủng YR-X2 cao hơn chủng TNX-X1.
Hiện cũng đã có một số công bố về Vibrio harveyi gây bệnh trên cá ngựa ở Tây Ban Nha (Alcaide và cs., 2001), Philippines (Tendencia, 2004) và Ấn Độ (Raj và cs., 2010). Alcaide và cs. (2001) đã chứng minh chủng V. harveyi là tác nhân gây bệnh chính trên cá ngựa Hippocampus sp., đồng thời xác định LD50 của V. harveyi
là 104 CFU/cá (cá thí nghiệm có trọng lượng trung bình 4g). Cá có biểu hiện bệnh trong thời gian từ 1-7 ngày. Raj và cs. (2010) công bố chủng V.harvey phân lập từ cá ngựa nuôi có liều gây chết 50% trên cá ngựa đen H.kuda là 4 x 104 CFU/cá (cá thí nghí nghiệm có trọng lượng trung bình 4.41 -6g). Trong nghiên cứu của chúng tôi, LD50 do TNX-X1 gây ra trên cá ngựa là 5 x 106 CFU/cá, cá biểu hiện bệnh trong thời gian 1 - 12 ngày. Như vậy độc lực của chủng TNX-X1 thấp hơn so với chủng V. harveyi được Alcaide và cs. (2001); Raj và cs. (2010) phân lập từ cá ngựa bệnh tại Tây Ban Nha và Ấn Độ.
Độc tính của YR-X2 cao hơn TNX-X1, tuy nhiên, vì số lượng mẫu bệnh phẩm đưa về phòng thí nghiệm ít (n=5) nên chưa thể đưa ra các thảo luận sâu hơn.
3.2.3 Khả năng mẫn cảm với kháng sinh
Các chủng vi khuẩn (TNX-X1 và YR-X2) có cùng đặc điểm đa kháng với các loại kháng sinh ampicillin, cefadroxil, cefalexin. Ngoài ra, chủng TNX-X1 còn kháng với cefadroxil, amoxicilin, chloramphenicol; chủng YR-X2 kháng với tetracillin, chloramphenicol, doxycyclin. Điều này cho thấy khả năng đa kháng kháng sinh ở vi khuẩn phát sáng Vibrio TNX-X1 và chủng Vibrio YR-X2 là một mối nguy cần được quan tâm.
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu và thảo luận có thể đi đến kết luận sau: - Phân lập được 5 nhóm Vibrio và xác định 2 chủng Vibrio (TNX-X1 và YR-X2) gây bệnh trên cá ngựa đen.
- Sử dụng Kit API 20E kết hợp với sử dụng phần mềm ABIS định danh 2 chủng
Vibrio TNX-X1 và YR-X2. Đồng thời, bằng kỹ thuật sinh học phân tử (dựa trên trình tự gene16S rDNA) bước đầu định danh chủng vi khuẩn TNX-X1 là Vibrio harveyi.
- Xác định độc lực gây bệnh trên cá ngựa đen Hippocampus kuda của chủng TNX-X1 là 5 x 106 CFU/cá, chủng YR-X2 là 3.0 x 105 CFU/cá .
- Xác định khả năng nhạy cảm với 9 loại kháng sinh của 2 chủng Vibrio (TNX-X1 và YR-X2) phân lập được.
4.2 Kiến nghị
Vì thời gian tiến hành thí nghiệm ngắn, nghiên cứu vẫn chưa hoàn chỉnh nên vẫn còn một số kiến nghị sau:
- Đoạn 16S rDNA của chủng TNX-X1 cần được đưa lên Genbank.
- Tiếp tục định danh chủng vi khuẩn YR-X2 bằng kỹ thuật sinh học phân tử (16S rDNA).
- Ngoài nhóm vi khuẩn Vibrio gây bệnh, nên tiếp tục triển khai nghiên cứu khảo sát sự hiện diện của tác nhân gây bệnh khác (như nấm) trên cá ngựa đen
Hippocampus kuda và cá ngựa gai Hippocampus spinosissimus.
- Số lượng cá ngựa gai (Hippocampus spinosissimus) bệnh (n=5) quá ít, không đủ ý nghĩa, nên tiếp tục nghiên cứu ở số lượng mẫu lớn hơn.
- Dự kiến tiếp tục tiến hành định danh vi khuẩn dựa trên giải trình tự bộ gene, điều hòa biểu hiện gene ở 2 chủng vi khuẩn đã xác định có độc tính (liên kết với đại học Tromson).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Tuyết Nga (1991), Thành phần hóa học chủ yếu của loài cá Ngựa đen (H. kuda) vùng biển Nha Trang – Khánh Hoà Viện Hải Dương học Nha Trang. 2. Hoàng Tùng, Trịnh Thị Trúc Ly, Bùi Thị Hồng Hạnh (2011), Thành phần sinh
hóa của cá ngựa đen (Hippocampus kuda) và tác dụng kích thích sinh tinh ở chuột bạch, Bộ môn Khoa học Thủy sản, Trường Đại học Quốc tế – ĐHQG TPHCM.
3. Khắc Lâm (2012), Một số bệnh do vi khuẩn gây ra trên tôm nuôi,
NinhThuanTech.
4. Phạm Hồng Sơn (2005), Vi sinh vật thú y, Nhà xuất bản Đại học Huế. 5. Sách đỏ Việt Nam (2007), Bộ Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, tr. 31.
6. Trương Sĩ Kỳ (1994), Đặc điểm sinh học và kỹ thuật nuôi cá ngựa, Nhà xuất bản Nông nghiệp - Hà Nội, tr. 44.
7. Trương Sĩ Kỳ (2000), Kỹ thuật nuôi cá ngựa ở biển Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp - Hà Nội.
8. Trương Sĩ Kỳ, Đoàn Thị Kim Loan (1994), Đặc điểm sinh sản của cá ngựa đen (H. kuda) sống ở cửa sông Cửa Bé, Tuyển tập Nghiên cứu Biển.
9.. Trương Sỹ Kỳ, Đỗ Hữu Hoàng (2006), Ảnh hưởng của thức ăn lên sự tăng trưởng của cá ngựa đen (Hippocampus kuda) trong điều kiện thí nghiệm, Tuyển tập Báo cáo Khoa học Hội nghị khoa học “Biển Đông – 2000”: 481 – 490.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
1. Alcaide E, Gil-saz C, Sanjuán E, Esteve D, Amaro C, Silveira L (2001), Vibrio harveyi causes disease in seahorse Hippocampus sp., Journal of Fish Diseases, 24, pp. 311 - 313.
2. Austin B, Austin DA (1993), Control of bacterial fish diseases in: Bacterial fish pathogens, Diseases in farmed and wild fish, II edition, Ellis Horwood Ltd, pp. 350 - 373.
3. Austin B, Austin DA (2007), Bacterial fish pathogens: diseases of farmed and wild fish, Chichester: Springer, pp.594.
4. Austin B, Stuckey LF, Robertson PAW, Effendi I, Griffith DRW (1995), A probiotic strain of Vibrio alginolyticus effective in reducing diseases caused by Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum and Vibrio ordalii, pp. 93 - 96. 5. Balcazar JL, Lee NM, Pintado J, Planas M (2010), Phylogenetic
characterisation and insitu detection of bacterial communities associated with seahorse (Hippocampus guttulatus) in captivity, Applied Microbiology, 33, pp. 71 - 77.
6. Balcázar JL, Planas M, Pintado J (2011), Novel Mycobacterium species in seahorses with tail rot, Emerging Infectious Diseases, pp. 1770 - 1772.
7. Barrow GI, Feltham RKA (2004), Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria, Cambridge University Press.
8. Baumann P, Schubert RHW (1984), Family II Vibrionaceae. In Krieg N.R. and Holt J.G. (eds.), Bergey's manual of systematic bacteriology, Williams & Wilkins Co., Baltimore/London.
9. Bleeker P (1852), Bijdragc tot de kennis dcr icthyologischc fauna van Singapore, Natuurkundip'lid.schnj Lioor Nederlandsch,3, pp. 82 - 83.
10. Bloch ME (1790), Cultured Aquatic species Information Programme: Lates caalcarifer, FAO.
11. Bombardini C, Florio D, Fichtel L, Fioravanti ML (2006), The main disease of Syngnathidae in captivity, Ittiopatologia, 3, pp. 205 - 211.
12. Chatterjee S, Haldar S (2012), Vibrio related diseases in aquaculture and development of rapid and accurate identification methods, J Marine Sci Res Dev S1.
13. Cheung PJ, Nigrelli RF, Ruggieri GD (1980), Studies on the morphology of Uronema marinum Dujardin (Ciliatea: Uronematidae) with a description of the histopathology of the infection in marine fishes, Journal of Fish Diseases 3, pp. 295 - 303.
14. Dempsey AC, Kitting CL, Rosson RA (1989), Bacterial variability among individual penaeid shrimp digestive tracts, Crustaceana, pp. 267- 278.
15. FDA (1998), "Glowing" seafood, U.S. Food and Drug Administration - Seafood Products Research Center.
16. Foster SJ, Vincent ACJ (2004), The life history and ecology of seahorses, Hippocampus spp.: implications for conservation and management., Journal of Fish Biology.
17. Fritzsche RA (1980), Revision of the Eastern Pacific Syngnathidae (Pisces: Syngnathiformes), including both recent and fossil forms, Proceedings of the California Academy of Science,42(6), pp. 181 - 227.
18. Glenn S, Bosmans J, Humphrey J (2007), Nothern Territory Barramundi Handbook, pp. 80.
19. Hilomen-Garcia G (1999), AQD's marine ornamental fish project, SEAFDEC Asian Aquaculture 21, pp. 31- 38.
20. Huys G, D'Haene K, Swings J (2002), Influence of the culture medium on antibiotic susceptibility testing of food-associated lactic acid bacteria with the agar overlay disc diffusion method, Letters in Applied Microbiology, 34, pp. 402 - 406.
21. Huys G, Dhert P, Robles R (2001), Search for beneficial bacterial strains for turbot (Scophthalmus maximus L) larviculture, Aquaculture,193, pp. 25 - 37.
22. Karunasagar I, Pai R, Malathi GR, Karunasagar I (1994), Mass mortality of Penaeus monodon larvae due to antibiotic-resistant Vibrio harveyi infection, Aquaculture,128, pp. 203 - 209.
23. Kim YM, Lee BH, Lee SH, Lee TS (1990), Distribution of Vibrio vulnificus in seawater of Kwangan Beach, Pusan.Korea. Bulletin oJthe Korean Fisheries Society,22, pp. 385 - 390.
24. Lavilla-Pitogo CR, Baticados MCL, Cruz-Lacierda ER (1990), Occurrence of luminous bacterial disease of Penaeus monodon larvae in the Philippines, Aquaculture 91, pp. 1-13.
25. Leach WE, Nodder RP (1814), Zoological miscellany; being descriptions of new, or interesting animals, Annales de sciences naturelles, Paris (Zool.).
26. Leano EM, Lavilla-Pitogo CR, Paner MG (1998), Bacterial flora in the hepatopancreas of pond-reared Penaeus monodon juveniles with luminescent Vibriosis, Aquaculture,164, pp. 367-374.
27. Lee (1997), Alkaline serine protease is an exotoxin of Vibrio alginolyticus in kuruma prawn, Penaeus japonicus, Current Microbiology,34, pp. 110 - 117. 28. Lin Q, Lin J, Lu J, Li B (2008), Biochemical Composition of Six Seahorse
Species, Hippocampus sp., from the Chinese Coast, Journal of the World Aquaculture Society,39, pp. 225 - 234.
29. Lin Q, Lin J, Wang C (2009), Biochemical composition of the wild and cultured seahorses, Hippocampus kuda, Bleeker and Hippocampus trimaculatus, Leach, Aquaculture Research,40, pp. 710 - 719.
30. Lourie SA, Foster SJ, Cooper EWT, Vincent ACJ (2004), A guide to the identification of Seahorses, Project Seahorse and TRAFFIC North America. 31. Lourie SA, Vincent ACJ, Hall HJ (1999), Seahorses: An identification guide to
the world’s species and their conservation, Project seahorse, London, UK, pp. 214.
32. Madigan M, Martinko J (2005), Brock Biology of Microorganisms, Prentice Hall.
33. Martins ML, Mouriño JLP, Fezer GF, Buglione Neto CC, Garcia P, Silva BC, Jatobá AS, Vieira FN (2010), Isolation and experimental infection with Vibrio alginolyticus in the sea horse, Hippocampus reidi Ginsburg, 1933 (Osteichthyes: Syngnathidae) in Brazil, Brazilian Journal of Biology, pp. 205 - 209.
34. McFarland J (1907), The nephelometer:an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines, JAMA,14, pp. 1176 - 1178.
35. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (2007), Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, Washington DC. Man. Clin. Microbiol.,
9th Edition, 2260.
36. Murugan A, Dhanya S, Sreepada RA, Rajagopal S, Balasubramanian T (2009),
Breeding and massscale rearing of three spotted seahorse, Hippocampus trimaculatus, Leach under captive conditions, Aquaculture,290, pp. 87 - 96. 37. NCCLS (2000), Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for
Bacteria that Grow Aerobically: Approved Standard, Clinical and Laboratory Standards Institute, National Committee for Clinical Laboratory Standards. 38. Ortigosa Moo, Esteve C, Pujalte MJ (1989), Vibrio species in seawater and
mussels: abundance and numerical taxonomy, Systematic and Applied Microbiology,12, pp. 316 - 325.
39. Oxley APA, Shipton W, Owens L, Mckay D (2002), Bacterial flora from the gut of the wild and cultured banana prawn, Penaeus merguiensis, Journal of Applied Microbiology,93, pp. 214 - 223.
40. Panchayuthapani D (1997), A survey of shrimp diseases in India, In: T.W. Flegel and I.H. MacRae (eds.), Diseases in Asian Aquaculture III. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila.
41. Pass DA, Dybdahl R, Mannion MM (1987), Investigations into the causes of mortality ofthe pearl oyster, Pinctada maxima (Jamson), in Western Australia, Aquaculture,65, pp. 149 -169.
42. Pedersen K, Austin B, Austin DA, Larsen JL (1999), Vibriosis associated with mortality in cultured plaice Pleuronectes platessa fry, Acta Veterinary Scandinavia,40, pp. 263 - 270.
43. Project Seahorse (1999), Studying the genetics of seahorses (in progress). 44. Project Seahorse (2006), Project Seahorse, Annual Report, University of
British Columbia, Canada, 20.
45. Raj ST, Lipton AP, Chauhan GS (2010), Characterization and infectivity evaluation of Vibrio harveyi causing white patch disease among captive reared seahorses, Hippocampus kuda, Journal of Marine Sciences,39, pp. 151-156. 46. Redacliff GL, Hornitzky M, Carson J, Petersen R, Zelski R (1993), Mortalities
of goldfish. Carassius auratus. associated with Vibrio cholerae infection, Journal oj Fish Diseases,16, pp. 517- 520.
47. Ringo E, Strom E, Tabachek JA (1995), Intestinal microflora of Salmonids: A review, Aquaculture Research 26, pp. 773 - 789.
48. Robert Hill (1997), Seahorses receive national protection., Media release. 49. Rujiwat A (2007), Thesis entitled Indentification of Vibrio cholera, Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio vulnificus by Multiplex Polymerase Chain Reaction, Mahidol University, ThaiLand.
50. Ryan KJ, Ray CG (2004), Sherris Medical Microbiology, McGraw Hill.
51. Ryua B, Zhong-Ji Q, Se-Kwon K (2010), Purification of a peptide from seahorse, that inhibits TPA-induced MMP, iNOS and COX-2 expression through MAPK and NF-κB activation, and induces human osteoblastic and chondrocytic differentiation, Chemico - Biological Interactions, 184, pp. 413 - 422.
52. Salin KR, Mohankumaran NC (2006), Resources and biodiversity of seahorses and the need for their conservation in India, Aquaculture Asia,10, pp. 3 - 8. 53. Seahorse culture (1998), Austasia Aquaculture, pp. 9 - 10.
54. Spanggaard B, Huber I, Nielsen J, Nielsen T, Appel KF, Gram L (2000), The microflora of rainbow trout intestine: a comparison of traditional and molecular identification, Aquaculture, pp. 1 - 15.
55. Sreepada RA, Desai UM, Naik S (2002), The plight of Indian seahorses: need for conservation and management, Current Science,82, pp. 377 - 378.
56. Tendencia EA (2002), Vibrio harveyi isolated from cage-cultured seabass Lates calcariJer Bloch in the Philippines, Aquaculture Research, 33, pp. 455 - 458.
57. Tendencia EA (2004), The first report of Vibrio harveyi infection in the sea horse Hippocampus kuda Bleekers 1852 in the Philippines, Aquaculture Research 35, pp. 1292 - 1294.
58. Thompson FL, Gevers D, Thompson CC, Dawyndt P, Naser S, Hoste B, Munn CB, Swings J (2005), Phylogeny and Molecular Identification of Vibrios on the Basis of Multilocus Sequence Analysis, Applied and Environmental Microbiology,71 (9), pp. 5107 - 5115.
59. Truong SK (1998), Prospects of community-based aquaculture in Vietnam. In: The marine biology of the south China sea III (ed. Morton B.), Hong Kong University Press, Hong Kong, pp. 465 - 474.
60. Vincent ACJ (1996), The International Trade in Seahorses, TRAFFIC International, Cambridge, UK, pp. 163.
61. Vincent ACJ, Clifton-Hadley RS (1989), Parasitic infection of the seahorse