- Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh và các thuốc thử dùng trong các phản ứng sinh hóa: APW (Alkaline Peptone Water), TCBS (Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose), KIA (Kligler Iron Agar), Marine Agar (của hãng Himedia - Ấn Độ) (Phụ lục 1). Tryptone Water, MR - PV, thanh thử oxidase…(của hãng Merk - Đức). - Kit API 20E (BioMérieux – Pháp), máy đo độ đục Densimat (BioMérieux - Pháp), máy định danh vi khuẩn mini API (BioMérieux - Pháp).
- Một số dụng cụ và thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm: Đĩa petri, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm, giá ống nghiệm, tủ cấy, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, máy vortex, …
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phân lập vi sinh vật
Bốn mươi mẫu cá ngựa bệnh (H. kuda n =35 và H. spinosissimus n = 5)có dấu hiệu lờ đờ, lở loét trên da (Hình 1.6 và 1.7) từ trại nuôi ở Sông Lô, Ba Làng được thu nhận và chuyểnmẫu vào trong túi nylon có bơm ôxy về phòng thí nghiệm. Tiến hành phân lập vi khuẩn sau 1-2h nhận mẫu.
Tiến hành rửa cá bằng nước muối sinh lý vô trùng. Dùng que cấy vòng lấy mẫu bệnh phẩm ở vùng da cá ngựa cấy ria lên TCBS (Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose) Agar, Nutrient Agar (NA) có bổ sung NaCl đạt nồng độ 3% và Marine Agar (MA). Do kích thước của cá ngựa bệnh phẩm nhỏ (1-2g ± 0,44g, chiều dài khoảng 5 cm ± 0,88cm) (Phụ lục 2), việc xác định vị trí của các nội quan
rất khó khăn. Vì vậy, tiếp tục rửa cá bằng nước muối sinh lý vô trùng, sau đó mổ cá bằng dao mổ và kéo tiệt trùng, đặt que cấy vòng vào trong ruột cá để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy ria lên TCBS Agar, Nutrient Agar (NA) có bổ sung NaCl đạt nồng độ 3% và Marine Agar (MA) theo phương pháp của Tendencia (2004), Raj và cs. (2010). Tất cả các đĩa sau khi cấy ủ ở nhiệt độ 280C trong 24 giờ. Các khuẩn lạc khác nhau trên đĩa TCBS và các khuẩn lạc phát sáng trên môi trường NA, MA sẽ được làm thuần và kiểm tra các đặc tính sinh hóa. Một số vi khuẩn phát triển trên môi trường NA và MA được bảo quản lạnh sâu (glycerol, -70°C) trong trường hợp cần tiến hành thêm các nghiên cứu khác.
Quy trình xác định chủng vi khuẩn Vibrio được thể hiện ở Hình 2.1.
Hình 2.1: Sơ đồ xác định chủng vi sinh vật Mẫu cá ngựa bệnh Phân lập vi sinh vật Lập kháng sinh đồ Xác định độc lực Định danh Dựa trên các đặc điểm sinh hóa
2.3.2 Giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hóa
Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được chọn để định danh vi khuẩn (Bảng 3.1) dựa theo các chỉ tiêu chẩn đoán vi khuẩn Vibrio gây bệnh ở thủy sản của (Pedersen và cs., 1999). Dựa vào nguyên lý, mỗi loại vi khuẩn có một số đặc tính sinh hóa khác nhau bao gồm đặc tính chuyển hóa các loại đường, khả năng sinh các hợp chất trung gian, khả năng sinh hơi…Với các chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành giám định các đặc tính sinh hoá của vi khuẩn gồm khả năng biến dưỡng các loại đường lactose, glucose, sucrose, khả năng sinh H2S, sinh hơi và các phản ứng catalase, urease, … bằng cách sử dụng bộ kit API 20E (Phụ lục 3) và kết hợp với một số phản ứng sinh hóa khác (lactose, oxydase, khả năng phát triển ở các nồng độ NaCl khác nhau (0%, 1%, 3%, 6%, 8%, 10%), khả năng di động, tính nhạy cảm với O/129 (2,4-diamino-6,7-di-isopropyl-pteridine phosphate) và polymyxin để định danh vi sinh vật mục tiêu.
Đồng thời các chủng vi khuẩn được kiểm tra hình thái và tính chất bắt màu bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow và Feltham, 2004) soi dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần.
Các kết quả sinh hóa sẽ được đọc dựa theo phần mềm của KIT API-20E và phần mềm ABIS (http://www.tgw1916.net/bacteria_logare.html).
2.3.3 Định danh vi khuẩn dựa trên trình tự gene 16S rDNA (16S ribosomal RNA gene)
DNA của vi khuẩn được tách chiết bằng Chelex (Biorad, USA) theo quy trình của nhà sản xuất. Lấy khuẩn lạc của vi khuẩn cho vào eppendort có chứa chelex 10%. Đặt vào bể ổn nhiệt ở 950C trong 10 phút. Tiến hành ly tâm 5000 vòng trong 5 phút. Sau đó, hút 200µl cho vào ống eppendorf và vortex.
Đoạn gene 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi: 27 F (5'AGATTTGATCCTGGCTCAG3') và 1492 R (5'GGTTACCTTGTTACGACTT3') (Weisburg và cs., 1991). Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25µl với các thành phần như sau : Buffer có MgCl2- 10x (2,5µl), DNA (2-20ng), mỗi mồi (0,1µM), dNTP (0,1mM mỗi loại), Dream Taq
Polymerase (1,25U). Chu kì nhiệt của phản ứng được thực hiện theo chu trình của nhà sản xuất Taq polymearase và nhiệt độ bắt cặp là 500C trong 1 phút.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TBE 1X, ở 85V. Sau 10 phút, tiến hành đọc kết quả.
Gởi sản phẩm đi giải trình tự (công ty Nam Khoa, thành phố Hồ Chí Minh). Các trình tự được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm Sequencher 4.1.4 và được so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
2.4 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
Thí nghiệm được thực hiện trên các bể thủy tinh (10L, kích thước bể 23,5cm x
20,5cm x 20cm), có sục khí. Các bể được khử trùng bằng chlorine, rửa lại bằng nước sạch. Cho vào mỗi bể 8L nước đã được khử rùng bằng chlorine nồng độ 30ppm, sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine. Nhiệt độ nước thích hợp cho cá ngựa khoảng 28 – 300C, pH dao động từ 7,5 – 7,7. Cá được cảm nhiễm có trọng lượng khoảng 1-2 g/con, khoảng 2-3 tháng tuổi, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt. Bố trí ngẫu nhiên 20 con/bể và để cá thích nghi dần với môi trường trong bể khoảng 1 tuần. Thí nghiệm được bố trí gồm các nghiệm thức: (1) đối chứng tiêm nước muối sinh lý (0,05 ml/cá); (2 - 5) tiêm vi khuẩn ở các dãy mật độ khác nhau. Chủng vi khuẩn phân lập từ cá ngựa bệnh nuôi tăng sinh trên môi trường NA có bổ sung NaCl 3% ủ ở 280C trong 24 giờ. Tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ khác nhau để thử nghiệm độc tính. Sau đó, tiêm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn với các nồng độ khác nhau từ 2.5x108 đến 105 CFU/ml (xác định bằng máy đo độ đục để đạt 0.5McFarland, kiểm chứng tổng số vi khuẩn bằng phương pháp đếm đĩa) vào phần vây ngực cá. Theo dõi liên tục biểu hiện của cá ngựa trong khoảng 15 ngày. Các nghiệm thức được lặp lại 2 lần. Dựa trên tỷ lệ cá chết, xác định LD50 theo phương pháp của Wardlaw (1985).
Hình 2.2: Cá ngựa đen được gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm vây ngực 2.5 Lập kháng sinh đồ
Tính nhạy của vi khuẩn với các loại thuốc kháng sinh được xác định theo phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch (Huys và cs., 2002). E. coli ATCC 25922 được dùng làm chủng tham chiếu. Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cấy lên môi trường NA 3% NaCl ở 28°C trong vòng 24 ± 2 giờ. Quan sát sự đồng nhất về hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc. Lấy khuẩn lạc ở mỗi đĩa NA sau 24 ± 2 giờ nuôi, cho vào ống nghiệm có chứa 5 ml dung dịch 0,85 % NaCl để tạo dung dịch vi khuẩn có độ đục tương ứng với dung dịch chuẩn 0,5 McFarland tương đương với 2-2,5 x 108 CFU/ml (McFarland, 1907; Murray và cs., 2007). Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn, ép vào thành ống nghiệm để loại bớt dịch vi khuẩn trong tăm bông, trang đều lên bề mặt của đĩa thạch có môi trường Muller Hinton Agar (MHA). Sau 15 phút, 9 loại đĩa kháng sinh bao gồm tetracycline 30µg (TE30), ampicillin 10µg (AM10), chloramphenicol 30µg (C30), amoxicilin 25µg (AMX25), cefadroxil 30µg (CD30), doxycyclin 30µg (D30), rifampin 5µg (RA5), cefaclor 25µg (CEC25), cefalexin 30µg (CL30) được đặt lên trên môi trường thạch, ủ ở 28°C trong giờ. Đường kính vòng vô trùng được đo bằng mm, chủng vi khuẩn trên đĩa MHA tương ứng sẽ được xác định là kháng (R), nhạy (S) hay trung gian (I) với kháng sinh thử nghiệm dựa theo hướng dẫn Ủy Ban Quốc gia về Tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàn - National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2000) (Phụ lục 4).
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả
3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn
Từ các mẫu cá ngựa đen H. kuda và cá ngựa gai H. spinosissimus có biểu hiện bệnh phân lập được 56 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường TCBS, Nutrient agar 1 - 3% NaCl và môi trường Marine Agar. Qua kết quả quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái, sinh lý và một số đặc tính sinh hoá, 56 chủng vi khuẩn phân lập được, chia thành 5 nhóm chính (Phụ lục 5):
Trên cá ngựa đen (H. kuda):
- Nhóm 1(9 chủng - nhóm HR): sau 18 – 24h nuôi cấy, khuẩn lạc màu vàng, tròn, bóng trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm. Glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose; phát triển được ở nồng độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%.
- Nhóm 2 (8 chủng - nhóm SH ): sau 18 – 24h nuôi cấy, khuẩnlạc màu vàng, nhăn, lõm ở tâm trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm.Glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose; phát triển được ở nồng độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%.
- Nhóm 3 (6 chủng - nhóm G): sau 18 – 24h nuôi cấy,khuẩn lạc màu xanh, tròn, bóng trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm.Glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose; phát triển được ở nồng độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%.
- Nhóm 4 (28 chủng - nhóm TNX): sau 18 – 24h nuôi cấy, khuẩn lạc màu xanh, tròn, bóng trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm sau 18 – 24h nuôi cấy; phát sáng trên môi trường TCBS và môi trường NA + NaCl 3%. Glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose, không sinh H2S; phát triển được ở nồng độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%.
Trên cá ngựa gai (H. spinosissimus):
- Nhóm 5 (6 chủng – nhóm YR): Tất cả các khuẩn lạc đều có màu vàng, tròn, bóng trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm sau 18 – 24h nuôi cấy; glucose, oxidase, indole đều dương tính, không lên men đường lactose; phát triển được ở nồng độ muối 3%, 6%; không phát triển ở nồng độ muối 0%, 8%.
Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu các chủng vi khuẩn có tần suất bắt gặp nhiều nhất gây bệnh trên cá ngựa đen và cá ngựa gai. Trên cá ngựa đen H. kuda
(n=35), nghiên cứu chủng G và chủng TNX - chiếm đa số trong vi khuẩn được phân lập từ cá vào tháng 8 – 12 tại Khánh Hòa với tần số bắt gặp là 50% và chủng G (10,7%). Chủng YR (100%) là chủng được phát hiện trên cá ngựa gai H. spinosissimus (n=5).
Đặc điểm sinh hóa, sinh lý và hình thái của 2 chủng vi khuẩn phân lập được từ cá ngựa được trình bày ở Bảng 3.1. Cả hai chủng TNX và YR có chung một số đặc điểm: Gram âm, hình que ngắn, di động, oxidase, catalase và phản ứng lên men glucose, galactose, mannitol đều dương tính…. TNX có khuẩn lạc màu xanh trên môi trường TCBS, đường kính 2 – 2,5mm sau 18 – 24h nuôi cấy. YR cho khuẩn lạc màu vàng trên môi trường TCBS. Đặc biệt là cả 2 chủng đều nhạy cảm với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129, 150 μg) là hợp chất giúp phân biệt vi khuẩn Vibrio và Aeromonas (West và cs., 1986).
Chủng TNX có thể phát sáng, tuy nhiên khả năng phát sáng chỉ quan sát được khoảng 8h nuôi cấy. Kéo dài thời gian nuôi cấy, khả năng phát sáng yếu dần. Ngoài ra, trên môi trường NA có bổ sung NaCl 3%, chủng TNX phát sáng mạnh hơn so với trên môi trường Marine Agar (MA).
Trong nhóm TNX, YR và G chọn ngẫu nhiên chủng TNX-X1; YR-X2; G-X1 để nghiên cứu độc tính của vi khuẩn (chủng G-X1 được xác định không có độc tính nên chúng tôi không trình bày kết quả theo sau).
Hình 3.1: a) Chủng TNX-X1 trên môi trường TCBS
Hình 3.1: b) Chủng TNX-X1 phát sáng trên môi trường NA + NaCl 3%
Bảng 3.1: Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng vi khuẩn TNX-X1 và YR-X2
Đặc điểm TNX-X1 YR-X2
Nhuộm Gram Âm Âm
Hình dạng Que ngắn Que ngắn Di động + + Lactose - - Catalase + + Oxidase + + Tính chịu muối 0% NaCl 3% NaCl 6% NaCl 8% NaCl 10% NaCl - + + - - - + + - - Nhiệt độ 4°C 28°C 37°C 42°C - + + + - + + +
Khả năng sinh hơi - -
TCBS agar G Y Phát sáng + - ONPG - - ADH - - LDC - + ODC - + Citrate - + H2S - - Urease + + TDA - - Indole + + VP - - Gelatine + + Glucose + + Mannitol + +
Inositol - - Sorbitol - + Rhamnose - - Sucrose - + Melibinose - - Amygladine + + Arabinose - + O/129 (0.5µg) S S Polymyxin (3000IU) S S
+ dương tính; - âm tính; G = green; Y = yellow; S = nhạy cảm. Dựa vào đặc điểm sinh hóa, chủng TNX-X1 và YR-X2 là Vibrio spp.
Kết quả định danh dựa trên đặc điểm hóa sinh bằng kit API-20E cho kết quả: TNX-X1 có khả năng là V. haryei, V. vulnificus, V. parahemolyticus, V. campbelli; Kết hợp các đặc điểm sinh hóa từ kit API-20E và các đặc điểm khác, sử dụng phần mềm ABIS cho kết quả chủng TNX-X1 có thể là V. harveyi (89%), V. vulnificus
(88%), V. parahemolyticus (86%), V. campbelli (88%). Tuy nhiên, trong 4 vi khuẩn kể trên, cho đến nay hiện chỉ có V. harveyi và V. vulnificus là được biết đến có khả năng phát sáng (FDA, 1998).
Kết quả định danh dựa trên đặc điểm hóa sinh bằng kit API-20E cho kết quả: YR-X2 có khả năng là V. anguillarum, V. alginolyticus. Kết hợp các đặc điểm sinh hóa từ kit API-20E và các đặc điểm khác, sử dụng phần mềm ABIS ra kết quả chủng chủng YR-X2 có khả năng là V. anguillarum (90%), V. alginolyticus (89%).
3.1.2 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
Ở cá ngựa nhỏ (1-2g ± 0,44g, khoảng 2-3 tháng tuổi), liều gây chết 50% (LD50) của chủng TNX-X1 được xác định là 5 x 106 CFU/cá, chủng YR-X2 là 3.0 x
105 CFU/cá. Cá sau khi cảm nhiễm có biểu hiện tương tự cá bệnh nhận từ các trại cá ngựa: cá xuất hiện các triệu chứng bệnh như da nhợt nhạt, đặc biệt da cá bị ăn mòn tại vị trí tiêm rồi lan dần tới các vùng khác; có nhớt trên vùng tiêm hoặc toàn thân (Hình 3.3). Ở mật độ vi khuẩn quá cao cá gần như không có biểu hiện và chết trong
vòng 1-2 ngày. Với mật độ thấp hơn, biểu hiện bệnh rõ ràng và thời gian chết từ 1 – 12 ngày. Tỷ lệ chết tích lũy theo ngày và kết quả cảm nhiễm trên cá ngựa đen (H. kuda) và cá ngựa gai (H. spinosissimus) được thể hiện ở Hình 3.4; Bảng 3.2 , Hình 3.5; Bảng 3.3 và Hình 3.6.
Hình 3.3: a) Biểu hiện của cá ngựa sau khi b) Biểu hiện của cá ngựa sau khi
cảm nhiễm chủng TNX-X1 cảm nhiễm chủng YR-X2
Hình 3.4: Tỷ lệ cá chết tích luỹ (%) theo thời gian cảm nhiễm 2 chủng vi khuẩn
TNX-X1 và YR-X2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Tỷ lệ chết tích lũy (% )
Thời gian cảm nhiễm (ngày)
YR-X2 _ 1,25 x 10^6 CFU/cá YR-X2 _ 6,25 x 10^5 CFU/cá YR-X2 _ 3,13 x 10^5 CFU/cá YR-X2 _ 1,56 x 10^5 CFU/cá YR-X2 _ 7,81 x 10^4 CFU/cá TNX-X1 _ 1,25 x 10^7 CFU/cá TNX-X1 _ 6,25 x 10^6 CFU/cá TNX-X1 _ 3,13 x 10^6 CFU/cá TNX-X1 _ 1,56 x 10^6 CFU/cá Đối chứng (NaCl 0,85%)
Bảng 3.2: Kết quả cảm nhiễm chủng TNX-X1 trên cá ngựa đen H. kuda % cá chết Nồng độ tiêm (CFU/cá thể) Lần 1 Lần 2 Trung bình 1.25 x 107 80% 80% 80% 6.25 x 106 70% 50% 60% 3.13 x 106 35% 45% 40% 1.56 x 106 15% 5% 10%
Hình 3.5: LD50 do chủng vi khuẩn TNX-X1 gây ra trên cá ngựa đen (H. kuda) sau khi cảm nhiễm. y = 33.182ln(x) - 460.23 R² = 0.9888 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0.00E+00 5.00E+06 1.00E+07 1.50E+07
Tỷ lệ chế t ( % ) Nồng độ tiêm (CFU/cá) LD 50 = 5 x 10 6 (C FU /cá)
Bảng 3.3: Kết quả cảm nhiễm chủng YR-X2 trên cá ngựa đen H. kuda % cá chết Nồng độ tiêm (CFU/cá thể) Lần 1 Lần 2 Trung bình 1.25 x 106 100% 100% 100% 6.25 x 105 75% 65% 70% 3.13 x 105 45% 55% 50% 1.56 x 105 25% 15% 20% 7.8 x 104 10% 10% 10%