Để có được những loài tảo có giá trị thuần chủng theo ý muốn, chúng ta tiến hành phân lập từ mẫu tảo tạp thu ngoài tự nhiên.
3.1.1. Phân lập bằng phương pháp pha loãng 3.1.1.1. Navicula sp.
- Sau 12 ngày tiến hành pha loãng mẫu tảo thu ngoài tự nhiên (đã nhân sinh khối) từ 10-1 đến 10-10, quan sát các đĩa petri ta thấy tảo bám trên các vật bám (lamen) có màu vàng nâu.
- Khi quan sát trên kính hiển vi, ta thu được kết quả như sau:
Đĩa có độ pha loãng 10-1: Quan sát thấy lẫn nhiều loài tảo khác. 10-2: Quan sát thấy lẫn nhiều loài tảo khác. 10-3: Độ thuần chủng 91,62% ± 3,2%.
10-4: Độ thuần chủng 97,05% ± 0,45%.
10-5 đến 10-10: Thuần chủng 100% Navicula sp.
- Tiến hành nhân sinh khối các đĩa có độ pha loãng từ 10-5đến 10-10.
Kết quả quá trình phân lập bằng phương pháp pha loãng cho thấy chỉ sau 12 ngày, từ đĩa 10-5 ta cũng đã thu được tảo Navicula sp. thuần chủng 100%.
Điều này có thể là do mật độ mẫu tảo ban đầu thấp, nếu pha loãng nhiều lần, đến
đĩa có độ pha loãng cao có thể sẽ không còn tế bào tảo nào trong đĩa tiếp theo. Bởi vì mục đích của việc pha loãng ở đây là làm sao đểđạt được 1 tế bào hay vài tế bào cùng loài trong một đĩa petri. Vì vậy, nếu mật độ tảo mẫu ban đầu thấp, hoặc loài được phân lập là loài chiếm ưu thế trong mẫu tự nhiên thì sẽ nhanh thu
được tảo thuần ởđộ pha loãng thấp hơn. Ởđĩa 10-4, 10-3 Navicula sp. cũng chiếm
ưu thế. Tuy nhiên, độ thuần chủng mới chỉ đạt: 97,05% (ở đĩa 10-4), 91,62% (ở đĩa 10-3). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả thí nghiệm của Blackburn (1990) [21] nhưng ông thu được tảo thuần chủng từ ống nghiệm có độ pha loãng cao hơn (10-6).
3.1.1.2. Nitzschia sp.
Khi phân lập Nitzschia sp. theo phuơng pháp pha loãng, kết quả thu được như sau:
Đĩa có độ pha loãng 10-1: Quan sát thấy lẫn nhiều loài tảo khác. 10-2: Quan sát thấy lẫn nhiều loài tảo khác. 10-3: Thuần chủng: 92,02% ± 2,5%
10-4 và 10-5
: Thuần chủng 100% Nitzschia sp.
Sau 15 ngày pha loãng Nitzschia sp., ta thu được tảo thuần chủng 100% từ đĩa có độ pha loãng 10-4. Đĩa có độ pha loãng 10-3, độ thuần chủng cũng đạt 92,02%. Đây là tỉ lệ thuần chủng tương đối cao. Điều này là do mật độ mẫu ởđĩa 10-2 (khi pha loãng Navicula sp.) thấp hơn mẫu thu ngoài tự nhiên đã nhân sinh khối. Vì vậy, thí nghiệm được pha loãng đến đĩa có độ pha loãng 10-5 và đạt
được độ thuần chủng cao ngay từđĩa có độ pha loãng 10-3. Tuy nhiên, thời gian
để thu được tảo thuần chủng khi pha loãng Nitzschia sp. lâu hơn so với Navicula
sp., đó là do mật độ tảo Nitzschia sp. ở trong mỗi đĩa petri thấp hơn so với
Navicula sp.. Tảo Nitzschia sp. có màu nhạt hơn ở các đĩa petri pha loãng để
phân lập chúng.
3.1.2. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch 3.1.2.1 Navicula sp. 3.1.2.1 Navicula sp.
Sau 4 ngày, quan sát, ta thấy xuất hiện các quần lạc có màu vàng nâu mọc rải rác trên đĩa thạch.
Hình 3.3. Quần lạc tảo mọc trên các đĩa thạch.
Đưa lên kính hiển vi quan sát và đếm các quần lạc Navicula sp., ta có kết quả: - Số quần lạc tảo trung bình/đĩa petri: 102 quần lạc/đĩa.
- Số tế bào tảo trung bình/quần lạc: 16 tb/quần lạc.
Dùng que cấy tròn lấy các quần lạc chuyển qua ống nghiệm chứa 1 ml nước đã bổ sung dinh dưỡng. Tuy nhiên, do đĩa petri nuôi cấy cũng lẫn một số
Chlamydomonas. Vì vậy, khi chuyển qua các ống nghiệm, tảo đạt độ thuần chủng chưa cao: 80,37% ±3,62%.
Hình 3.4. Tảo chuyển sang các ống nghiệm
Nuôi tảo trong ống nghiệm trong thời gian 1 tuần, lọc lấy dịch tảo và cấy lại trên các đĩa thạch, ta thu được tảo Navicula sp. có độ thuần chủng: 93,57% ±
2,30%. Trong quá trình nuôi, quan sát thấy một sốđĩa thạch có hiện tượng nhiễm khuẩn.
Như vậy, ta thấy phương pháp pha loãng tảo Navicula sp. đạt độ thuần chủng cao hơn và dễ tiến hành hơn. Với phương pháp pha loãng, tảo Navicula sp.có thể đạt độ thuần chủng 100%, còn phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch, tảo Navicula sp. thu được có độ thuần chủng không cao bằng, thao tác nhiều hơn và thời gian cũng lâu hơn. Mặt khác, sử dụng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch có thể bị nhiễm khuẩn. Do đó, chúng ta cần tiến hành làm sạch tảo bằng kháng sinh như phương pháp phân lập của một số nơi trên thế giới đang áp dụng (Úc). Như vậy, cùng một loài tảo Navicula sp. thì phân lập bằng phương pháp pha loãng cho kết quả cao hơn phương pháp phân lập trên môi trường thạch.
3.1.2.2. Nitzschia sp.
Tiến hành pha môi trường thạch và phân lập tương tự như Navicula sp...
Tuy nhiên, sau 6 ngày mới thấy xuất hiện quần lạc tảo Nitzschia sp. cũng có màu nâu vàng mọc rải rác trên đĩa thạch.
- Số lượng quần lạc tảo trung bình trên đĩa thạch: 57 quần lạc/đĩa. - Số tế bào tảo trung bình: 9 tb/quần lạc
Đưa các đĩa petri lên kính hiển vi quan sát, dùng que cấy lấy các quần lạc tảo Nitzschia sp. chuyển qua các ống nghiệm có chứa 1 ml nước đã bổ sung môi trường dinh dưỡng. Nuôi sau một tuần, quan sát trên kính hiển vi độ thuần chủng
đạt: 78,20% ± 3,7%.
Tiến hành lọc lấy dịch tảo từ các ống nghiệm và cấy lại trên đĩa thạch mới. Chuyển các quần lạc qua ống nghiệm mới ta thu được tảo có độ thuần chủng cao hơn: 91,27% ± 1,53%. Điều này cũng phù hợp với kết quả thí nghiệm của Blackburn (1990) [21] khi phân lập một số loài tảo khác.
Qua kết quả trên ta thấy, với cùng một phương pháp phân lập nhưng mỗi loài khác nhau thì số quần lạc xuất hiện ở mỗi đĩa và số lượng tế bào trên mỗi quần lạc cũng khác nhau. Ởđây, ta thấy số lượng quần lạc trên đĩa thạch và số tế bào có
ở mỗi quần lạc khi phân lập Navicula sp. đều lớn hơn khi phân lập Nitzschia sp..
Điều này phụ thuộc vào mật độ ban đầu của mỗi loài tảo có trong mẫu tảo nuôi cấy và sự thích nghi của mỗi loài khi phân lập bằng môi trường thạch. Nhưng sau khi phân lập cả 2 loài Navicula sp. và Nitzschia sp. bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch, tiến hành phân lập lại lần thứ hai, tảo đạt độ thuần chủng tương
đối cao. Tuy nhiên, tảo cũng chưa đạt được độ thuần chủng 100%. Điều này có thể
là do loại thạch Platapiantong của Thái Lan chưa phù hợp để phân lập 2 loài tảo này. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, các đĩa thạch chưa được bọc parafin xung quanh nên một sốđĩa thạch có hiện tượng bị nhiễm nấm, vi khuẩn.
Như vậy, 2 loài tảo Silic lông chim sống đáy Navicula sp. và Nitzschia sp. khi phân lập bằng phương pháp pha loãng đều cho kết quả thu được tảo thuần nhanh hơn, và độ thuần chủng cũng cao hơn (100%) rất nhiều so với phương
pháp nuôi cấy trên môi trường thạch. Điều này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Halarry và ctv (1982) [19] cho rằng phương pháp phân lập bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch chỉ phù hợp với các loài tảo Silic nước ngọt và tảo Lục. Tóm lại, phân lập bằng phương pháp pha loãng là phương pháp phân lập thích hợp cho 2 loài tảo này.
3.2. Lưu giữ tảo trong các điều kiện khác nhau
Sau khi phân lập được một loài tảo thuần chủng, ta phải tiến hành lưu giữ để duy trì tảo giống trước khi đem ra nuôi sinh khối. Để tảo sinh trưởng tốt sau khi lưu giữ thì môi trường dinh dưỡng, các yếu tố sinh thái và thời gian lưu giữ
phải phù hợp với mỗi loài tảo là vấn đề rất cần thiết. Do đó, để xác định điều kiện lưu giữ thích hợp, tiến hành bố trí các lô thí nghiệm cho mỗi loài tảo Navicula sp. và Nitzschia sp.
3.2.1. Navicula sp.
3.2.1.1. Lưu giữ tảo trong môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau
Để xác định môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp cho
Navicula sp., 4 lô thí nghiệm lưu giữ tảo trong môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ
khác nhau đã được bố trí. Sau khi lưu giữ tảo trong khoảng thời gian 2 tuần, đưa ra nuôi sinh khối trở lại trong các bình nón có thể tích 500 ml, thu được kết quả như
sau (bảng 3.1 và hình 3.5):
Ở cả 4 lô, tảo đều lên đẹp và quan sát thấy có màu vàng nâu đặc trưng, đặc biệt ở lô 2 và lô 4. Ở tất cả các lô thí nghiệm, mật độ tảo đạt cực đại vào ngày nuôi thứ 6 - thứ 7.
Quan sát mật độ tế bào tảo Navicula sp. ở lô 1, ta thấy tảo đạt mật độ cực
đại ở ngày nuôi thứ 6 (20,96 x 104 tb/ml), và mật độ cực đại này thấp hơn so với lô 2 có cùng môi trường dinh dưỡng lưu giữ là môi trường HBM-95 nhưng ở
nhiệt độ thấp hơn (7oC). Mặt khác, tảo còn tàn nhanh chóng chỉ sau 9 ngày nuôi. Còn ở lô 2, đến ngày thứ 6 tảo đạt cực đại (39,46 x 104 tb/ml), pha cân bằng và pha tàn lụi kéo dài, đến ngày thứ 11 tảo mới tàn. Tốc độ sinh trưởng ngày ở lô này cũng cao, đặc biệt là 3 ngày đầu và cao nhất vào ngày thứ 3 (0,97). Khi dùng
phương pháp kiểm định thống kê, thấy sự sai khác có ý nghĩa (P<0,05) về mật độ
tế bào cực đại giữa 2 lô thí nghiệm: Tảo cùng lưu giữ trong môi trường HBM-95 nhưng với thời gian lưu giữ 25oC và 7oC (độ tin cậy 95%).
Bảng 3.1. Sự sinh trưởng của tảo Navicula sp. (N x 104 tb/ml) được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau.
Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4
Thời gian (ngày) N µ N µ N µ N µ 1 2,00 0,00 2,00 0,00 2,00 0,00 2 0,00 2 3,25 ± 0,16 0,49 5,14 ± 0,19 0,94 3,42 ± 0,13 0,54 5,25 ± 0,21 0,97 3 6,3 ± 0,21 0,66 13,58 ± 0,13 0,97 6,46 ± 0,32 0,64 15,43 ± 0,15 1,08 4 9,55 ± 0,83 0,42 25,67 ± 0,13 0,64 10,78 ± 0,34 0,51 28,38 ± 1,04 0,61 5 12,33 ± 0,32 0,26 34,83 ± 0,76 0,31 14,97 ± 1,26 0,33 36,65 ± 0,20 0,26 6 20,96 ± 0,15a 0,53 39,46 ± 0,97b 0,12 19,65 ± 0,45 0,27 40,72 ± 0,29 0,11 7 16,26 ± 0,92 -0,25 36,36 ± 1,25 -0,08 24,57 ± 0,98c 0,22 43,27 ± 0,31d 0,06 8 12,78 ± 0,53 -0,24 32,39 ± 0,94 -0,12 16,63 ± 0,20 -0,39 39,08 ± 0,38 -0,10 9 10,93± 0,72 -0,16 25,57 ± 0,27 -0,24 9,18 ± 0,52 -0,59 32,54 ± 0,54 -0,18 10 tàn 14,09 ± 0,85 -0,6 tàn 24,11 ± 0,47 -0,30 11 tàn 17,69 ±0,95 -0,31 12 tàn Ghi chú:
- Số liệu được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Các chữ cái viết kèm bên trên thể
hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05).
- Lô 1: Lưu giữở môi trường dinh dưỡng HBM-95, nhiệt độ 25oC.
- Lô 2: Lưu giữở môi trường dinh dưỡng HBM-95, nhiệt độ 7oC.
- Lô 3: Lưu giữở môi trường dinh dưỡng F2, nhiệt độ 25oC.
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Thời gian (ngày) Mật độ (vạn tb/ml) Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4
Hình 3.5. Diễn biến mật độ tế bào tảo Navicula sp. được đưa ra nuôi sinh khối sau khi lưu giữở môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ khác nhau.
Ở lô 4, tảo có tốc độ tăng trưởng ngày rất cao và cao nhất vào ngày thứ 3 (1,08). Tốc độ sinh trưởng này cũng cao hơn so với 3 lô còn lại. Tuy ở lô này, đến ngày thứ 7 tảo mới đạt cực đại (43,27 x 104 tb/ml) nhưng pha cân bằng và pha tàn lụi kéo dài, đến ngày 11 mật độ tảo còn cao và đạt 17,69 x 104 tb/ml. Mặt khác, mật
độ cực đại này cũng là mật độ cao nhất so với mật độ cực đại ở tất cả các lô khác. So với lô 3, ta thấy cùng lưu giữ trong môi trường F2, nhưng với nhiệt độ lưu giữ khác nhau thì ở lô 4, sự sinh trưởng của tảo tốt hơn rất nhiều. Ở lô 3, tảo lưu giữở nhiệt
độ 25oC đạt mật độ cực đại (24,57 x 104 tb/ml) rất thấp so với lô 4. Tốc độ tăng trưởng của tảo Navicula sp. cao nhất vào ngày thứ 3 và đạt 0,64. Tảo ở lô này tàn lụi chỉ sau 9 ngày nuôi. Khi dùng phương pháp kiểm định thống kê, với độ tin cậy 95%, ta thấy sự sai khác có ý nghĩa (P<0,05) về mật độ cực đại giữa 2 lô này.
Như vậy, ta thấy ở 2 lô thí nghiệm 2 và 4, lưu giữở nhiệt độ 7oC tảo đều
đạt mật độ cực đại cao và pha cân bằng cũng kéo dài hơn nhiều so với tảo lưu giữ ở nhiệt độ 25oC. Điều này có thể là do ở nhiệt độ 7oC, tảo chỉ duy trì sự phát triển
rất chậm nên khi đem nuôi sinh khối thì phát triển tốt hơn. Còn tảo được lưu giữ ở nhiệt độ 25oC, phát triển mạnh hơn, dễ tàn lụi hơn nên khi đem nuôi sinh khối tảo không còn sinh trưởng tốt nữa. Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng, giúp ta có thể lựa chọn được nhiệt độ lưu giữ tảo thích hợp, hạn chế sựảnh hưởng của nhiệt độ lưu giữđến sinh trưởng của tảo khi đem ra nuôi sinh khối trở
lại.
Ở lô 3, mật độ tảo cực đại có cao hơn lô 1 nhưng không đáng kể. Tốc độ
tăng trưởng cũng khác nhau. Sau 9 ngày nuôi, tảo ở cả 2 lô đều tàn. Khi kiểm
định thống kê thấy sự sai khác có ý nghĩa (P<0,05) về mật độ tế bào cực đại ở 2 lô này. Tương tự như 2 lô: lô 2 và lô 4, mật độ cực đại của Navicula sp. ở lô 4 cao hơn lô 2, pha cân bằng và pha tàn lụi cũng dài hơn, và cũng thấy có sự sai khác có ý nghĩa (P<0,05) trong thống kê. Như vậy, các lô thí nghiệm lưu giữ ở
cùng một nhiệt độ nhưng môi trường dinh dưỡng lưu giữ khác nhau thì sự sinh trưởng của tảo cũng khác nhau. Điều này, chứng tỏ môi trường dinh dưỡng lưu giữ cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tảo khi nuôi sinh khối trở lại.
Tóm lại, nhiệt độ lưu giữ có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tảo khi nuôi sinh khối, và nhiệt độ lưu giữ thích hợp cho loài tảo Navicula sp. này là 7oC. Môi trường dinh dưỡng dùng để lưu giữ cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tảo. Qua thí nghiệm này, ta thấy môi trường dinh dưỡng F2 là môi trường lưu giữ
thích hợp hơn đối với Navicula sp.
3.2.1.2. Lưu giữ tảotrong khoảng thời gian khác nhau
Cũng như môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ, thời gian lưu giữ
cũng có thểảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tảo khi nhân sinh khối trở lại. Do
đó, chúng ta cũng cần chú ý đến thời gian lưu giữ mỗi loài tảo để hạn chế ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của chúng ở lần sản xuất tiếp theo. Để xác định thời gian lưu giữ thích hợp cho loài tảo Navicula sp., 2 lô thí nghiệm lưu giữ được thực hiện ở 2 khoảng thời gian khác nhau (2 tuần và 4 tuần), với môi trường dinh dưỡng lưu giữ là môi trường dinh dưỡng F2 và ở nhiệt độ 7oC (môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ lưu giữ thích hợp nhất đã xác định ở thí nghiệm trên).
Đưa tảo ra nhân sinh khối trở lại trong các bình nón thể tích 500 ml, sự sinh trưởng của Navicula sp. thể hiện rõ qua bảng 3.2. Ở cả 2 lô, tảo đạt cực đại vào ngày