phân lập, bảo quản, nghiên cứu một số điều kiện thích hợp cho nuôi trồng tảo n.oculata

Trong đó tảo Nanochloropsis Oculata là loài hiện nay có rất nhiều ứng dụng thực tiễn nên chúng là đối tượng đang được chú ý đặc biệt trong nuôi trồng nhằm thu sinh khối: làm thức ăn cho

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS Lưu Thị Ngọc Huyền, Phó trưởng Bộ Môn Sinh Học Phân Tử, Viện Di Truyền Nông Nghiệp – Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn Cô là người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Tôi xin gửi đến thầy, Th.S Lê Phương Chung lời cảm ơn sâu sắc nhất Thầy đã truyền cho tôi những kiến thức, chỉ hướng đi tốt nhất trong công việc cũng như tận tụy hướng dẫn tôi trong học tập để đồ án của tôi được hoàn thiện Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ: Ban Giám Hiệu, Ban Giám Đốc Viện cùng các thầy cô giáo trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường Đại học Nha Trang, các anh chị trong Viện Di Truyền Nông Nghiệp – Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này

Cuối cùng tôi gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè Chính họ

là nguồn cổ vũ, động viên, là chỗ dựa để tôi có thể hoàn thành đồ án

Sinh Viên

Nguyễn Thị Thu Thủy

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Giới thiệu chung về vi tảo 2

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi tảo 3

1.2.1 Trên thế giới 3

1.2.2 Trong nước 4

1.2.3 Giá trị dinh dưỡng của vi tảo 6

1.2.4 Ứng dụng của vi tảo 7

1.2.5 Loài tảo N.Oculata 11

1.2.5.1 Vị trí phân loại tảo N Oculata 11

1.2.5.2 Đặc điểm hình thái 11

1.2.5.3 Đặc điểm sinh lý 12

1.2.5.4 Đặc điểm sinh hóa 12

1.2.5.5 Đặc điểm sinh trưởng 14

1.2.5.6 Thành phần dinh dưỡng và vai trò của tảo N.Oculata 15

1.2.5.7 Một số yếu tố ảnh hưởng của đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N Oculata 17

1.2.5.8 Tình hình nghiên cứu về tảo N Oculata 20

CHƯƠNG 2VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Vật liệu nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Phân lập tảo N.Oculata 26

2.3.2 Môi trường nuôi tảo 28

2.3.3 Phương pháp lưu giữ và bảo quản giống tảo 28

2.3.3.1 Lưu giữ trên môi trường thạch 29

2.3.3.2 Lưu giữ giống trên môi trường lỏng 30

2.3.4 Xác định các điều kiện tối ưu để nuôi cấy tảo N.Oculata 30

2.3.4.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến 30

2.3.4.2 Phương pháp xác định mật độ tảo 32

2.3.4.3 Xác định nhiệt độ tối ưu 33

2.3.4.4 Xác định cường độ ánh sáng tối ưu .34

2.3.4.5 Xác định độ mặn tối ưu .35

2.3.4.6 Xác định chu kỳ chiếu sáng tối ưu 36

CHƯƠNG 3KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả phân lập tảo N.Oculata .38

3.2 Lưu giữ, bảo quản và nhân giống tảo N Oculata 39

3.2.1 Lưu giữ và bảo quản giống 39

3.2.2 Nhân giống các cấp 40

3.3 Ảnh hưởng của các điều kiện tối ưu đến sinh trưởng, phát triển của tảo N.Oculata 41

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 41

3.3.2 Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng 45

3.3.3 Ảnh hưởng của độ mặn 48

3.3.4 Ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54

1 Kết luận 54

2 Đề xuất 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần sinh hóa của một số loài tảo 7

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của môi trường F/2 28

Bảng 3.1: Mật độ tảo cực đại ở các mức nhiệt độ khác nhau 44

Bảng 3.2: Mật độ tảo cực đại ở cường độ ánh sáng khác nhau 47

Bảng 3.3: Mật độ tảo cực đại ở độ mặn khác nhau 49

Bảng 3.4: Mật độ tảo cực đại ở chu kỳ chiếu sáng khác nhau 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh của N.Oculata qua kính hiển vi 11

Hình 1.2: Thành phần acid béo của các nhóm lipid chính trong Nannochloropsis sp.13 Hình1.3 Đường cong sinh trưởng của vi tảo N.Oculata 15

Hình 1.4 Các đối tượng sử dụng thức ăn là vi tảo biển 16

Hình 2.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến 31

Hình 2.2 Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của tảo N Oculata 34

Hình 2.3 Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N Oculata 35

Hình 2.4 Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của độ mặn đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N Oculata 36

Hình 2.5 Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của độ dài chiếu sáng đến sinh trưởng và phát triển của tảo N Oculata 37

Hình 3.1 Quá trình phân lập giống tảo thuần N.Oculata đã được phân lập 38

Hình 3.2 Lưu giữ tảo trên môi trường thạch nghiêng và môi trường lỏng trong tủ lạnh (A và B) hoặc trong môi trường lỏng ánh sáng yếu ở nhiệt độ 25oC (C và D).40 Hình 3.3 Tảo giống các cấp 41

Hình 3.4 Biến động mật độ trung bình tảo N Oculata theo nhiệt độ 43

Hình 3.5 Biến động mật độ tảo N Oculata theo cường độ ánh sáng 45

Hình 3.6 Lô thí nghiệm nuôi tảo tại các cường độ ánh sáng khác nhau 46

Hình 3.7 Biến động mật độ tảo N Oculata theo độ mặn khác nhau 48

Hình 3.8 Lô thí nghiệm nuôi tảo ở các độ mặn khác nhau 25‰ (A), 30‰ (B) và 35‰ (C) 50

Hình 3.9 Biến động mật độ tảo N Oculata theo chu kỳ chiếu sáng khác nhau 51

MỞ ĐẦU

Trên thế giới, vi tảo biển đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học và kinh doanh sản xuất thủy sản Tảo biển ngày càng trở nên quan trọng, chúng đóng góp khoảng 40-50% lượng oxy trong khí quyển hay là lượng oxy trong quá trình hô hấp của sinh vật Tảo biển là nguồn gốc tạo ra cacbon hóa thạch trong dầu thô và khí gas tự nhiên Bên cạnh đó, tảo biển là nguồn thức ăn chính của hầu hết các loài sinh vật biển [27]

Tại Việt Nam công nghệ nuôi tảo còn quá lạc hậu, chỉ theo các phương pháp cổ truyền, bán liên tục như nuôi kín trong bịch nylon, nuôi hở trong bể

xi măng, bể sợi thủy tinh chắc chắn không đảm bảo về mặt số lượng lẫn chất lượng con giống…đã và đang làm hạn chế quy mô và công suất của các trại sản xuất giống Việc nuôi không ổn định, rủi ro do bị nhiễm bẩn và tàn lụi đột ngột, mật độ thấp là những vấn đề tồn tại đối với bất kỳ hoạt động nuôi sinh khối các loài vi tảo đơn bào hiện nay Vì vậy, cần phải có giải pháp về kỹ thuật nuôi nhằm ổn định việc nuôi, đảm bảo chất lượng tảo tốt

Người ta đã nghiên cứu một số loài vi tảo biển nuôi trồng để thu sinh

khối đạt giá trị cao như: Chlorella, Nanochloropsis Oculata, Dunaliella,

Spirulina Trong đó tảo Nanochloropsis Oculata là loài hiện nay có rất nhiều

ứng dụng thực tiễn nên chúng là đối tượng đang được chú ý đặc biệt trong nuôi trồng nhằm thu sinh khối: làm thức ăn cho tôm, các loài động vật hai mảnh vỏ hay là một nguồn nguyên liệu mới trong ngành công nghiệp sản xuất dầu sinh học, chế biến và sản xuất thực phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ phẩm… Nhưng vấn đề đặt ra là chưa có một công thức dinh dưỡng và điều kiện môi trường nuôi cấy cụ thể nào được đưa ra để áp dụng trong việc nuôi

loại tảo này Vì vậy mà tôi thực hiện đề tài: "Phân lập, bảo quản, nghiên

cứu một số điều kiện thích hợp cho nuôi trồng tảo N.Oculata"

Mục tiêu của đề tài là phân lập, bảo quản và nghiên cứu các điều kiện thích

hợp để nuôi trồng loài tảo N.Oculata Từ đó đề xuất quy trình hoàn thiện nuôi sinh khối tảo N.Oculata

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về vi tảo

Vi tảo là những sinh vật xuất hiện sớm trên trái đất, trải qua hàng tỷ năm tiến hóa, được xem như là sinh vật có cấu trúc hình thái đa dạng nhất [33] Sự phân bố và nơi sống của vi tảo rất đa dạng, chúng có thể sống và phát triển ở các vùng ẩm ướt, thủy vực, biển sâu cho đến các vùng có băng tuyết và sa mạc nóng bức

Chúng có kích thước hiển vi mà mắt thường không nhìn thấy được và

có chứa ít nhất một loại sắc tố chlorophyll - chlorophyll 1 Là một cấu

thành quan trọng của các sinh vật phù du, tạo nên năng suất sơ cấp của thủy vực và giữ một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự phát triển của

hệ sinh thái [24]

Là sinh vật có khả năng quang hợp, tạo ra các sản phẩm hữu cơ từ các chất vô cơ (H2O, CO2) nhờ vào khả năng hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời [4] Do vậy, ở trong các thủy vực vi tảo tạo nên năng suất sơ cấp khởi đầu trong chuỗi thức ăn, nền đáy của tháp dinh dưỡng trong hệ sinh thái Không giống với thực vật bậc cao, vi tảo là những sinh vật đơn bào, tập đoàn hay dạng sợi phát triển đơn giản, hệ số vòng đời ngắn, tốc độ sinh trưởng nhanh,

sử dụng năng lượng ánh sáng cao và thành phần sinh hóa thay đổi theo thành phần dinh dưỡng và các yếu tố môi trường sống [25]

Hiện nay, trên trái đất có khoảng 20.000 loài vi tảo, trong số đó có một

số loài có giá trị kinh tế cao đã được dùng trong nuôi trồng thủy sản, chế biến

thực phẩm như: Chaetoceros, Scenedesmus, Chlorella, Spirulina Trước tiềm

năng đó, công nghệ vi tảo đang lôi cuốn sự chú ý của nhiều nhà khoa học tại nhiều nước trên thế giới, nhằm khai thác nguồn lợi to lớn của vi tảo phục vụ

cho con người [11],[15]

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng vi tảo

1.2.1 Trên thế giới

Việc nghiên cứu tảo có từ lâu đời, nó gắn liền với sự ra đời của kính

hiển vi quang học và việc tìm thấy tế bào đầu tiên do nhà tự nhiên học người Anh R.Hooke khám phá ra vào năm 1665 Tuy nhiên, mãi đến năm 1910,

Allen và Nelson lần đầu tiên đã nuôi tảo Silic để làm thức ăn cho một số động

vật không xương sống, mở ra một bước tiến mới trong quá trình nuôi trồng tảo [21]

Ngày nay công nghệ sinh học phát triển nhanh tạo một cuộc cách mạng trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, vật liệu mới và bảo vệ môi trường Ở phạm vi hẹp hơn chúng ta đang chứng kiến sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sản xuất vi tảo trên thế giới do nhiều ưu thế của

cơ thể so với thực vật bậc cao như vòng đời ngắn, năng suất cao, hiệu số sử dụng ánh sáng cao, công nghệ sản xuất không phức tạp, thích hợp với quy mô sản xuất công nghiệp

Khoảng 1/3 sinh khối thực vật trên thế giới là sinh khối tảo Trong tổng

số khoảng 25.000 loài vi tảo hiện nay có khoảng 50 loài được nghiên cứu tỉ

mỉ về mặt sinh hóa, sinh lý và sinh thái học Cho đến nay hàng loạt các công nghệ nuôi trồng, thu hoạch chế biến sinh khối tảo đang không ngừng được hoàn thiện , hạ giá thành và nâng cao chất lượng sinh khối [7]

Mặt khác sử dụng vi tảo đang được mở rộng trong các lĩnh vực khác nhau và được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu công nghệ sản xuất vi tảo đại trà

Vào đầu năm 1940 ở Đức bắt đầu có những thực nghiệm nuôi trồng đại

trà Chlorella sau khi người ta thấy tế bào tảo này có tới 50% protein trong

sinh khối khô và có khả năng tăng sinh khối gấp nhiều lần trong ngày [30]

Đầu những năm 1950 các nhà khoa học Mĩ đã bắt đầu nuôi đại trà tảo Chlorella

Năm 1953, các nhà khoa học Đức đã nghiên cứu khả năng dùng CO2, phế thải

của nhà máy công nghiệp vùng Rhur để nuôi trồng tảo Chlorella và

Scenedesmus acutus.Nghiên cứu này được giáo sư Soeder và cộng sự được tiếp

tục tiến hành trong nhiều năm sau đó Cũng loài tảo này, năm 1957, Tamiya và

cộng sự ở Viện Sinh học Tokugama (Tokyo) đã công bố các kết quả nuôi trồng

tảo Chlorella ở ngoài trời và cũng từ Chlorella họ chiết ra một hợp chất gọi là

“nhân tố sinh trưởng Chlorella” cùng với 15 loại vitamin khác nhau, được ứng

dụng rộng rãi trong y học [37]

Năm 1960 tại Tiệp Khắc các nhà khoa học đã xây dựng một mô hình nuôi

tảo đại trà Scenedesmus trên nền bể có độ nghiêng 30 và tạo dòng chảy nhờ bơm

kĩ thuật Cascade Mô hình bể này được ứng dụng thành công tại Rupite, Bungart- một địa danh có suối nước nóng nổi tiếng để sản xuất đại trà tảo

Chlorella và Scenedesmus Ở Nhật Bản đã sản xuất tảo Chlorella đạt sản lượng

1100 tấn/năm và Trung Quốc sản xuất 2798 tấn/năm tảo Spirulina để xuất khẩu Đầu năm 1960, vi khuẩn lam Spirulina lần đầu tiên được phát hiện tại

hồ Tchad, Châu Phi và nhanh chóng được các nhà khoa hcoj pháp nuôi đại trà Mehico

Năm 1996 - 1997, Nhật Bản nuôi N.Oculata làm thức ăn cho trùng bánh

xe rất phổ biến Tại Oxtraylia các loài tảo đơn bào như Tetraselmis sp, Palova

lutheri được nuôi phổ biến làm thức ăn cho động vật thân mềm [34]

Ngoài ra một số vi tảo khác như Dunaliella (có nguồn caroten và gliceron)

và Porphyridium (có nguồn polisaccarit và phycoerythrin) đã và đang được đưa

vào nuôi trồng với quy mô nhỏ

1.2.2 Trong nước

Tại Việt Nam, những nghiên cứu về tảo đã được thực hiện từ rất lâu, chủ

yếu về phân loại, điều tra thành phần trong các thủy vực nội địa

Đầu những năm 1960 giáo sư Nguyễn Hữu Thước và các cộng sự đã tiến

hành nhiều thí nghiệm sử dụng sinh khối Chlorella vào làm thức ăn một số

loài gia cầm, kích thích tăng trưởng của tằm con [6]

Những năm đầu 1970, sản xuất giống hải sản bắt đầu được quan tâm,

trạm nghiên cứu nuôi trồng thủy sản nước lợ Quý Kim - Hải Phòng đã kết

hợp thu nuôi sinh khối tảo Silic làm thức ăn cho ấu trùng tôm mang tính chất

phục vụ sản xuất là chính đồng thời tiến hành một số thí nghiệm nghiên cứu

cơ bản

Năm 1974 một số thí nghiệm nuôi tảo Skeletonema costatum trong điều

kiện phòng thí nghiệm được tiến hành ở trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang Cũng loài tảo này năm 1989 tại trung tâm nghiên cứu thủy sản III, Nguyễn Thị Xuân Thu và các cộng tác viên đã tiến hành một số thí nghiệm về

môi trường nuôi cấy tìm hiểu khả năng phát triển của Skeletonema costatum

và Chaetoceros sp, sử dụng Skeletonema costatum để ương ấu trùng tôm sú ở

giai đoạn Zoea [9] Cũng trong thời gian này, liên doanh Việt Nam - Oxtraylia

về sản xuất tôm giống, sử dụng Skeletonema costatum làm thức ăn cho ấu

trùng đạt kết quả tốt [6]

Dương Đức Tiến (1982) đã công bố 1389 loài tảo ở các thủy vực nội địa Việt Nam [37] Những nghiên cứu ứng dụng tảo trong sản xuất chỉ thực sự phát triển kể từ giữa thập kỷ 80 của thế kỷ 20, với thành công trong công trình

của Lê Viễn Chí về ứng dụng nuôi tảo Skeletonema costatum làm thức ăn

trong các trại sản xuất tôm giống ở Hạ Long [9]

Năm 1995, Hoàng Thị Bích Mai đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn, nhiệt độ ánh sáng, hàm lượng muối dinh dưỡng lên sinh trưởng, phát triển và

đưa ra quy trình nuôi hai loài tảo Skeletonema costatum và Chaetocerosp làm

thức ăn cho ấu trùng tôm sú Năm 1996, Lê Viễn Chí nghiên cứu một số đặc

điểm sinh học, công nghệ nuôi tảo Silic Skeletonema costatum làm thức ăn

cho ấu trùng tôm biển Trần Thị Tho và cộng sự (2000) đã tiến hành những thí

nghiệm nuôi đại trà Chlorella pyrenoidosan tại bể 10 m3 đối với môi trường

đạm vô cơ có bổ sung hữu cơ (0.4% bột cá) và dịch triết đất (1%).[7]

1.2.3 Giá trị dinh dưỡng của vi tảo

Tảo đóng góp nguồn sinh khối sơ cấp khổng lồ Việc nghiên cứu giá trị dinh dưỡng của tảo đang ngày càng được chú trọng Với kỹ thuật nuôi đơn giản, thời gian sản xuất hầu như quanh năm Sinh khối thu được có giá trị

dinh dưỡng cao với hàm lượng protein đạt 40 - 50%, Lipid (7,2 - 23%), Cacbohidrate (4,6 - 27%) [17], đầy đủ các axit amin đặc biệt là các axit amin

không thay thế, giàu các vitamin, các nguyên tố khoáng, các chất khoáng, các sắc tố và nhiều chất có hoạt tính sinh học khác [23]

Mười loại vitamin đã tìm thấy ở vi tảo, trong đó hàm lượng vitamin C và vitamin B12 là cao nhất, tiếp theo là các vitamin A, D, E, K Các vi tảo còn

được coi là nguồn giàu axít ascorbic (0,11 - 1,62% trọng lượng khô) [35]

Hàm lượng Protein trong mỗi tế bào vẫn được xem là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định giá trị dinh dưỡng của vi tảo dùng làm thức

ăn trong nuôi trồng thủy sản Protein cũng được chứng minh là thành phần nhạy cảm nhất với những biến động của môi trường nuôi hơn những thành phần cấu tạo tế bào khác.Đặc biệt vi tảo còn chứa axit béo không no Eicosapentaenoic axit (20: 5n-3, EPA) và Docosahexaenoic axit (22: 6n-3, DHA), các axit béo này rất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của ấu thể ở giai đoạn ban đầu

Bảng 1.1: Thành phần sinh hóa của một số loài tảo [8]

Hàm lượng các chất (% trọng lượng khô) Loài tảo

Protein Lipid Carbohydrat Tham khảo

Spirulina platensis 46 – 50 4 - 9 8 - 14 Tipnis (1960)

Nanochloropsis Oculata 35 18 7,8 Brown (1991)

Tetrselmis chui 31 10 12 Brown (1991)

Isochrysis galbana 20 23 12,9 Brown (1991)

1.2.4 Ứng dụng của vi tảo

Nói đến vi tảo, đặc biệt là vi tảo biển, đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới cho biết rằng tảo có vai trò rất quan trọng trong nghề nuôi trồng thủy sản đặc biệt ở giai đoạn ở ấu thể [33]

Bên cạnh đó, Tảo còn là mắt xích thức ăn đầu tiên của chuỗi thức ăn ngoài tự nhiên, chúng là thức ăn không thể thay thế cho giai đoạn ấu trùng và

trong suốt giai đoạn trưởng thành của động vật thân mềm Đối với ấu trùng giáp xác và ấu trùng một số loài cá, tảo cũng chính là thức ăn bắt buộc ở giai đoạn sớm

Ngoài vai trò làm thức ăn cho động vật thủy sản, tảo còn sản xuất ra lượng lớn khí ôxy hoà tan vào ban ngày góp phần làm ổn định nhiệt độ và pH trong môi trường của các ao,hồ khi tiến hành nuôi chung với động vật thủy sản Tảo còn được sản xuất đại trà để chiết suất các hoạt chất như: vitamine, lipid, các sắc tố (carotenoit, chlorophyll (a, b, c1, c2), phycobiliprotein), cacbohydrat, và một số chất chống ôxy hoá khác

Có thể nói rằng hiện nay, tảo được khai thác dưới góc độ là nguồn thức ăn dinh dưỡng cho người và thức ăn cho động vật, nguồn hóa chất và dược liệu, nguồn phân bón sinh học và đối tượng sinh học để xử lý môi trường Cụ thể một

số ứng dụng công nghệ vi tảo trong cuộc sống như:

* Nguồn thức ăn cho người và động vật :

- Sử dụng vi tảo cho người: Bất cứ một loại protein đơn bào nào cũng phải trải qua thử nghiệm nghiêm túc trên động vật trước khi trở thành sản phẩm thức

ăn của con người.Ví dụ: Sinh khối tảo Spirulina đã được Chmorro (1980) tiến

hành thử nghiệm độc tố ngắn hạn và trường diễn, nghiên cứu ảnh hưởng đến khả năng sinh sản, sinh trưởng và khả năng điều tiết sữa Lượng tảo tăng dần từ 10-

30 % khẩu phần ăn hàng ngày, sau 13 tuần thí nghiệm việc xét nghiệm mô học không cho thấy sự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm và đối chứng Theo dõi trong 80 tuần liên tục, sau đó 2 năm theo dõi khả năng tiết sữa và sinh sản ở

động vật ăn tảo Spirulina người ta cũng không nhận thấy [9]

- Sử dụng vi tảo cho động vật: Do thành phần dinh dưỡng cao vi tảo được xem là thức ăn bổ dưỡng cho chăn nuôi và thủy sản.Ỏ Việt Nam dùng tảo

Spirulina bổ sung vào thức ăn cho cá mè trắng, cá mè hoa, cá trắm cỏ, rô phi với

tỉ lệ 5% làm tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng của cá tăng lên Một hướng khác là

sử dụng sinh khối vi tảo làm nguồn bổ sung dinh dưỡng triển vọng vào nguồn nuôi tôm nhuyễn thể Cho đến nay chế độ thức ăn ở hầu hết các trại nuôi và sản xuất thủy sản là sự phối hợp thức ăn tươi sống như vi tảo và atermia Bên cạnh

đó nhiều loài được sử dụng dưới dạng sinh khối tươi và khô để làm thức ăn cho

ấu trùng tôm, cá con và nhuyễn thể như: Nannochloropsis Oculata, Isochrysis galbana, Skeletonema Costatum, Chaetocerospsis, [4]

*Nguồn hóa chất và dược liệu ứng dụng trong y học và thực phẩm :

Hiện nay thì công nghệ nuôi tảo ngày càng được phát triển Người ta nghiên cứu các cơ sở sinh lý, sinh hóa và các kĩ thuật nuôi sinh khối một số loài

vi tảo ( Spirulina, Chlorella, Dunadiella, Chaetoceros ) làm thuốc, thực phẩm

chức năng và thức ăn tươi sống, nhân tạo cho nuôi trồng thủy sản Bên cạnh đó thì công nghệ nuôi trồng và sử dụng tảo đang ngày càng phát triển mạnh mẽ đặc biệt là việc sử dụng tảo để sản xuất sản phẩm chức năng có giá trị như:

Tảo xoắn (Spirulina) rất giàu protei ,các vitamin nhóm B, hàm lượng vitamin

B12 cao gấp 2 lần trong gan bò, aroten cao gấp 10 lần trong củ cà rốt Ngoài

ra tảo xoắn còn chứa các khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt ) và chất chống oxy hoá: betacaroten và carotenoid Đặc biệt kẽm và các acid amin có trong tảo xoắn giúp tăng cường khả năng hoạt động tình dục ở nam giới, làm cân bằng dinh dưỡng, tổng hợp các chất nội sinh, tăng hormon và điều hòa sinh

lý, khiến cho người đàn ông có một "sức mạnh" tự nhiên, bền vững Với phụ

nữ, ngoài tác động làm tăng rõ rệt hormon nữ, Tảo xoắn còn giúp giảm cân, làm đẹp da và giảm nếp nhăn bằng cách “trong uống ngoài thoa” Với những giá trị dinh dưỡng và sinh học đặc biệt như thế Tảo xoắn được coi là thực phẩm chức năng, một thức ăn cho sức khoẻ, đặc biệt có tác dụng rất tốt cho người cao tuổi

*Nguồn phân bón sinh học

Phân bón chứa nitơ được coi là yếu tố hạn chế trong sản xuất lương thực Người ta dự báo nhu cầu phân bón của các nước đang phát triển khoảng gần 100 triệu tấn/năm trong đó 30% là phân nitơ Với việc cố định nitơ từ khồn khí, tảo có vai trò rất quan trọng trong chu trình biến đổi nitơ.Hiện nay trên thế giới đang chú ý đến việc sử dụng tảo Lam để cố định đạm Nhiều các tác giả( De Singh, Watanabe, Venkataraman ) đã chỉ ra rằng: ở cánh đồng lúa

và đất nhiệt độ tảo Lam là yếu tố chủ yếu tạo nên sự căn bằng đạm và sự màu

mỡ của đất đai Tảo năng cao hiệu quả của Azotobacter, kích thích sự phát triển của các loài vi khuẩn Azotobacter, Clostridium Như vậy tảo đã khích lệ

hệ vi sinh vật cố định đạm

*Tảo trong xử lý nước thải

Theo Wilde & Beneman(1997) đã nghiên cứu một số chủng vi tảo đã qua chọn lọc có tiềm năng rất lớn trong việc giảm ô nhiễm kim loại nặng trong nước thải công nghiệp Việc phát triển cố định tế bào là bước đột phá quan trọng trong công nghệ này [36] Cho đến nay trên thị trường thế giới đã xuất hiện 2 chế phẩm Algasorb & AMT- Bioclaim dùng để loại bỏ kim loại nặng từ nước thải.Algasorb rất hiệu quả trong việc loại bỏ kim loại nặng với nồng độ thấp và ít bị ảnh hưởng bởi Ca2+ và Mg2+, trong khi AMT- Bioclaim

có khả năng loại tới 99% kim loại Pb, Cu, Zn, Cd từ dung dich [27]

1.2.5 Loài tảo N.Oculata

1.2.5.1 Vị trí phân loại tảo N Oculata

Theo nghiên cứu của Hibberd (1980) [24] tảo N Oculata được phân chia

theo các bậc phân loại như sau:

Giới: Chromista T Cavalier-Smith

Ngành: Heterokontophyta Moestrup

Lớp: Eustigmatophyceae Hibberd & Leedale Bộ: Eustigmatales Hibberd

Họ: Monodopsidaceae Hibberd Chi: Nannochloropsis Hibberd Loài: N.Oculata (Droop) Hibberd

1.2.5.2 Đặc điểm hình thái

Tảo Nannochloropsis Oculata là tảo đơn bào, lơ lửng trên môi trường

lỏng, không có khả năng di chuyển, kích thước nhỏ, dạng hình cầu hay elip

với đường kính từ 2 - 4µm N.Oculata có một lớp màng ngoài mỏng hiện diện

ở các giai đoạn nhất định trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào Thành tế bào trong suốt và không tạo hình dạng xác định, tế bào có một lớp đơn các sắc tố

diệp lục màu xanh vàng, là sắc tố đặc trưng của lớp Eustigmatophyceae,

không có lớp màng nhầy bên ngoài Thể sắc tố quang hợp hình trứng, được bao bọc bởi 2 lớp màng trong đó lớp màng ngoài dính liền với màng nhân [24]

Hình 1.1 Hình ảnh của N.Oculata qua kính hiển vi

Do những loài này đều có kích thước nhỏ, hình cầu không di động, không biểu hiện bất kỳ các điểm đặc trưng về hình thái học, khó phân biệt được dưới kính hiển vi điện tử hoặc kính hiển vi quang học nên phân loại những loài này bằng phương pháp hình thái học rất khó, do đó phải dựa trên

kỹ thuật di truyền bằng việc phân tích các trình tự gen Chi tảo này khác biệt với những chi tảo khác là không có chlorophyll b và c [27], nhưng có khả năng tạo một số loại sắc tố có hàm lượng cao là astaxanthin, zeaxanthin và

canthaxanthin [20]

1.2.5.3 Đặc điểm sinh lý

Nannochloropsis sp là một chi thuộc dạng phiêu sinh vật tự dưỡng,

trong tế bào có các hợp chất chlorophylls [24] N.Oculata là loài vi tảo sống

tối ưu trong môi trường nước mặn, tuy nhiên đôi khi cũng hiện diện trong môi trường nước ngọt hay nước lợ [26] Hình dạng của loài tảo này thường không

thay đổi hoặc thay đổi không đáng kể trong các môi trường này N.Oculata có

khả năng thích nghi khá rộng ở các dải nhiệt độ và độ mặn khác nhau Đặc biệt, chúng có thể thích nghi tốt trong điều kiện nhiêt độ thấp [20] Điều kiện

sinh trưởng tốt nhất của N.Oculata khoảng 20 - 25oC và độ mặn khoảng 22 -

29‰ [29],[27]

Ở nước ta, N.Oculata thường phân bố chủ yếu ở các vùng biển có nhiệt

độ từ 20 - 30oC và độ mặn dao động trong khoảng 20 - 30‰ Tuy vậy, chúng

được ghi nhận là phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 25°C, độ mặn 25‰ trong môi

trường có pH khoảng 7,5 - 8,5 [10]

1.2.5.4 Đặc điểm sinh hóa

Thành phần sinh hóa bên trong của tế bào phụ thuộc rất nhiều vào điều

kiện sống, đặc biệt là thành phần dinh dưỡng của môi trường Mỗi loài của chi

N.Oculata có thành phần sinh hóa khác nhau tùy theo nơi sống , nhu cầu dinh

dưỡng, tính đặc trưng của loài đó[14],[23]

Hình 1 2: Thành phần acid béo của các nhóm lipid chính trong

Nannochloropsis sp [33]

Khi điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, N.Oculata thường có khuynh hướng

đầu tiên sẽ chuyên hóa carbon thành protein[31].Tuy nhiên, dưới các điều kiện thay đổi khác nhau, tế bào vi tảo bị kích ứng, sẽ có nhiều carbon được chuyên hóa thành lipid và carbohydrate Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sẽ tác động lên thành phần lipid và các acid béo có trong tế bào vi tảo

[27] Các acid béo chủ yếu có trong N.Oculata là C14:0, C16:0, C16:1, C20:4

và C20:5 Ngoài ra cũng có sự hiện diện của một số acid béo phụ khác như C18:0, C18:1, C18:2 và C18:4 Các acid béo này tồn tại ở ba dạng lipid trong

tế bào vi tảo, đó là galactolipid, phospholipid và lipid trung tính Galactolipid

của N.Oculata giàu các acid béo C20:5 và C20:4, kết hợp với C16:0 và C16:1, một lượng nhỏ C14:0 Lipid trung tính của Nannochloropsis sp thì

chủ yếu là các triacylglycerol, gồm các acid béo C16:0 và C16:1, một ít acid

béo C14:0 và C18:0 Phospholipid của N.Oculata giàu C16:1, một lượng đáng

kể C18:1 và C18:4[4]

Đồ thị trên chứng tỏ rằng Nannochloropsis Oculata là loài vi tảo quang

tự dưỡng phù hợp cho việc sản xuất acid eicosapentaenoic (C20:5; EPA) Vì

vậy, Nannochloropsis Oculata được xem là nguồn acid béo chưa bão hòa C3

quan trọng cho con người [4].Dưới các điều kiện môi trường khác nhau, tỷ lệ các thành phần lipid và acid béo trong tế bào vi tảo có thể thay đổi[35]

1.2.5.5 Đặc điểm sinh trưởng

Trong điều kiện thuận lợi của môi trường về dinh dưỡng, ánh sáng, độ mặn và nhiệt độ, các loài vi tảo sinh sản theo kiểu phân cắt tế bào, do vậy số lượng tế bào tăng lên một cách nhanh chóng Theo Lavens & Sorgeloos

(1996) [25],sự sinh trưởng của vi tảo N.Oculata cũng giống như các loài vi

tảo khác, được đặc trưng bởi 5 giai đoạn (pha):

Pha thích nghi (I): pha này vi tảo bắt đầu làm quen với môi trường nuôi, hấp

thụ chất dinh dưỡng và bắt đầu phân chia tế bào nhưng số lượng tế bào tăng chậm

Pha logarit(II): hay còn gọi là pha tăng trưởng theo hàm số mũ số lượng

tế bào tăng theo cấp số nhân Vi tảo ở giai đoạn này hấp thụ dinh dưỡng mạnh Mật độ vi tảo tăng trưởng theo hàm logarit

Pha giảm tốc độ sinh trưởng(III): pha này môi trường dinh dưỡng có

chiều hướng giảm mạnh cùng với mật độ tế bào cao sẽ làm tốc độ sinh sản giảm tuy vậy số lượng tế bào vẫn còn tăng

Pha cân bằng(IV): hay còn gọi là pha ổn định, là khi vi tảo đạt mật độ

cực đại và số lượng ổn định

Pha suy vong(V): hay còn gọi là pha sụp đổ, là sau khi vi tảo đạt mật độ

cực đại, khả năng sinh sản giảm dần và số lượng tảo giảm một cách rõ rệt, chất lượng nước xấu đi, các chất dinh dưỡng cạn kiệt tới mức không thể duy trì được sự sinh trưởng [24]

Hình1 3 Đường cong sinh trưởng của vi tảo N.Oculata

Qua các giai đoạn phát triển của vi tảo cho thấy: để nuôi vi tảo có hiệu quả thì ta cần kéo dài sự phát triển của vi tảo ở pha thứ II vì trong pha này vi tảo sinh trưởng tốt nhất và có chất lượng cao hơn các pha khác Cuối pha III đầu pha IV tuy đạt được mật độ vi tảo cao nhất nhưng chất lượng lại giảm do tính tiêu hoá của tế bào bị suy giảm và có thể có một số bất lợi cho tiêu hoá của vật nuôi [25]

1.2.5.6 Thành phần dinh dưỡng và vai trò của tảo N.Oculata

a Thành phần dinh dưỡng

Tảo N.Oculata có thành phần dinh dưỡng phong phú Thành phần và

hàm lượng dinh dưỡng trung bình các chất có trong sinh khối tảo là: 37,6% carbonhydrat; 44% protein thô; 18,4% tổng chất béo [32].Thành phần carotenoid bao gồm: violaxanthin 51%; vaucheri xanthin 26%; carotene 11% và các caratenoid khác chiếm 12% [24] Hàm lượng các chất khoáng có trong 100g tảo khô: K(533mg), Na(659mg), Ca(972mg), Mg(361mg), Zn(103mg), Fe (136mg)… Không có kim loại nặng gây độc như: Cd, Hg Thành phần và hàm

lượng các loại axít béo không no khá cao (tính theo % trọng lượng khô): [16:1n - 7] chiếm 4,7%, [18:1n-9] chiếm 3,8%, [20:5n-3] chiếm 2,2%…[28] Hàm lượng

vitamin E có trong tảo N.Oculata cao hơn nhiều lần so với các loài tảo

Dunaliella, Tetraselmis suecica, là những loài vốn được sử dụng làm nguồn

cung vitamin E [19]

b Vai trò của tảo N.Oculata

Tảo N.Oculata nói riêng và các loài vi tảo nói chung có vai trò rất quan

trọng trong hệ sinh thái thủy vực Ngoài chức năng cung cấp oxy và thức ăn sơ

cấp cho cá và các động vật thủy sinh khác - góp phần bảo vệ môi trường nuôi

thủy sản bằng cách tiêu thụ bớt lượng muối khoáng dư thừa, vi tảo này còn đóng góp vai trò khá quan trọng trong nhiều lĩnh vực khác của cuộc sống Vai trò đầu tiên và quan trọng của loài vi tảo này là làm thức ăn cho ấu trùng cá biển, nhuyễn thể (ngao, sò huyết, hầu…), luân trùng Chúng được sử dụng trong ương nuôi giai đoạn ấu trùng, ấu thể và cả giai đoạn đầu của cá thể

trưởng thành [12] Trong sản xuất giống thủy sản, nuôi sinh khối tảo N

Oculata được xem là một khâu quan trọng và đã được ứng dụng rộng rãi trong

các trại giống

Hình 1.4 Các đối tượng sử dụng thức ăn là vi tảo biển [24]

Tảo N Oculata là một trong những loài tảo có thể được sử dụng như một

dạng thực phẩm chức năng, các sản phẩm làm đẹp da, chống lão hóa da, phòng chống ung thư[19].Trong nông nghiệp và môi trường, vi tảo này còn là một công cụ sinh học đắc lực để cải tạo đất, tạo phân bón, làm sạch nước đặc

biệt là nguồn nước thải N - P, không những thế chúng còn có khả năng hấp

thụ CO2 rất tốt, làm giảm hiệu ứng nhà kính [7] Ngoài ra, có một điều lý thú

nữa về vai trò của tảo N Oculata chính là khả năng tạo nên dầu sinh học

(biodiesel) - là nguyên liệu chuyển hóa thành diesel phục vụ nhu cầu năng

lượng cho con người [2]

1.2.5.7 Một số yếu tố ảnh hưởng của đến sự sinh trưởng và phát triển

của tảo N Oculata

a Yếu tố nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của các loài vi

tảo nói chungvà N.Oculata nói riêng Nó ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa

và thành phần axít béo của vi tảo Hầu hết các loài tảo có thể sống trong

khoảng 16 - 30oC, nếu nhiệt độ cao hơn 35oC thì tảo sẽ chết và thấp hơn sẽ

chậm phát triển Tảo N.Oculata có khả năng thích nghi với sự biến động nhiệt

độ rộng 2 - 39oC Nhưng dải nhiệt tốt để phát triển tối ưu thì khá hẹp 20 -

25oC [25] Nhiệt độ phù hợp để phát triển quần thể vi tảo N.Oculata trong

khoảng 20 - 30oC, nhiệt độ tối ưu là 25oC [10] Nhìn chung, nhiệt độ ảnh

hưởng lên vi tảo N.Oculata bởi 2 yếu tố chính: nhiệt độ tác động lên cấu trúc

tế bào và nhiệt độ ảnh hưởng lên tốc độ phản ứng trao đổi chất của tảo [7] Trong quá trình sản xuất đại trà việc lựa chọn thời điểm nuôi trồng thích hợp

là rất cần thiết, quyết định đến năng suất sinh khối của tảo

b Yếu tố ánh sáng

Ánh sáng là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong đời sống thực vật nói chung và của vi tảo nói riêng Ánh sáng là nguồn năng lượng

cho quá trình quang hợp, giúp tảo hấp thụ carbon vô cơ để chuyển hóa thành các hợp chất hữu cơ cần thiết để duy trì và phát triển cơ thể như protein, đường, lipid

Cũng giống như các loài vi tảo khác, ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp lên

sinh trưởng và phát triển của tảo N.Oculata và được xem xét ở các khía cạnh:

cường độ ánh sáng và chu kỳ sáng tối

Cường độ ánh sáng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp của vi tảo Cường độ ánh sáng thấp, tế bào vi tảo sinh trưởng và phát triển chậm, ngược lại cường độ chiếu sáng mạnh thì sự sinh trưởng và phát triển của tảo sẽ diễn ra nhanh hơn và tảo sẽ đạt được mật độ cao hơn Tuy nhiên, cường độ ánh sáng quá mạnh có thể ức chế quá trình quang hợp của tảo, ức chế sự sinh trưởng của tế bào Cường độ chiếu sáng cao hay thấp phụ thuộc vào thể tích nuôi, ở thể tích nhỏ thì cường độ ánh sáng cần thiết khoảng

1000 lux, nhưng ở thể tích nuôi lớn hơn thì khoảng 5000 – 10000 lux [25] Các sản phẩm tổng hợp được trong quang hợp phụ thuộc nhiều vào chu

kỳ chiếu sáng Mặc dù nuôi trồng vi tảo phát triển bình thường dưới ánh sáng

tự nhiên Nhưng tùy theo mục đích thu hoạch tảo mà chu kỳ chiếu sáng sẽ được điều chỉnh cho phù hợp Chu kỳ chiếu sáng nhân tạo trong nuôi sinh khối để cho năng suất cao thì tối thiểu là 18 giờ sáng mỗi ngày [25]

c Yếu tố độ mặn

Độ mặn là một trong những nhân tố tác động mạnh đến đời sống của các

loài vi tảo nói chung và N.Oculata nói riêng Nó ảnh hưởng trực tiếp lên quá

trình quang hợp và hô hấp của tế bào vi tảo Khi nồng độ muối giảm sẽ ức chế quá trình quang hợp, hô hấp tích lũy carbon và glucôzơ cũng bị hạn chế và làm giảm tốc độ sinh trưởng của vi tảo đồng thời kéo dài thời gian nuôi cấy Ngược lại, nồng độ muối cao thì tảo thường hay sốc và ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý của vi tảo như sự vận chuyển các chất qua màng và sự phân chia

tế bào bị dừng lại Nhìn chung, phổ chịu muối của vi tảo là rất rộng Tảo

N.Oculata cũng thuộc loài rộng muối thích ứng trong khoảng 10 - 35‰ [8]

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về phạm vi ảnh hưởng của độ mặn lên sự phát triển của vi tảo này Tuy những nghiên cứu này đều khẳng định

được phổ chịu muối của N.Oculata là rộng, nhưng khoảng phát triển tối ưu thì

có sự chênh lệch Trong nghiên cứu của Phạm Thị Lam Hồng (1999), tảo

N.Oculata phát triển tốt nhất ở 30 - 35‰, nhưng cũng có thể phát triển ở 10 -

35‰ Ở độ mặn 30 - 35‰ tảo có thể đạt mật độ cao nhất 8,8 x 106-9,3x106

tb/ml [8] Còn trong nghiên cứu của Lê Xân (2007), độ mặn phù hợp để phát

triển quần thể vi tảo N.Oculata trong khoảng 20 - 30‰, độ mặn tối ưu là 25‰ [10]

d Yếu tố dinh dưỡng

Dinh dưỡng ảnh hưởng trên cả phương diện số lượng và chất lượng của

tảo N.Oculata Các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tảo N.Oculata bao gồm: nhóm nitơ (một số hợp chất muối nitơ

như NaNO3, KNO3 ), nhóm phốt pho (một số hợp chất muối phốt pho NaH2PO4, KH2PO4), các nguyên tố vi lượng (hợp chất chứa Co, Cu, Fe…), vitamin (B6, B12, B1…) và một số nhóm chất khác

Nitơ chiếm từ 1- 10% trọng lượng khô tế bào tảo, nitơ là thành phần cơ

bản cấu tạo nên các loại protein, trong đó có protein cấu trúc và protein chức năng, hình thành các thành phần của thành, màng và tế bào tảo Ngoài ra, nitơ còn tham gia vào cấu tạo của nhiều loại vitamin B1, B2, B6, BP là thành phần quan trọng của hệ men oxy hóa khử và nhiều men quan trọng khác Tảo

N.Oculata không có khả năng cố định N2 mà chỉ có thể sử dụng nitơ dưới dạng NO-3 và NH+4 [7].Trong quá trình nuôi cần phải đảm bảo nhu cầu về hàm lượng muối nitơ cho vi tảo

Phốt pho được coi là chìa khóa của quá trình trao đổi chất Hàm lượng photpho không cần thiết phải cao, song nếu thiếu nó thì tảo không phát triển

được Bởi vì, phốt pho có tác dụng lên hệ keo ở dạng các ion, phốt pho ở dạng liên kết với các kim loại tạo nên hệ đệm đảm bảo cho pH của tế bào luôn xê

dịch trong một phạm vi nhất định (6 - 8) là điều kiện tốt cho các hệ men hoạt

động Phốt pho có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất và là yếu tố

giới hạn sinh trưởng Phốt pho cấu thành nên các co-enzym là lực khử của các

phản ứng sinh hóa và các axít nucleic [7]

Các nguyên tố vi lượng, vitamin được coi là không thay thế đối với sinh trưởng của tảo Các nguyên tố này tham gia vào hoạt động tế bào với tư cách

là thành phần hoặc co-factor của enzym Chúng còn là yếu tố quan trọng

trong hệ truyền điện tử quang hợp và cần cho tất cả các loài tảo [7]

Ngoài những yếu tố kể trên thì CO2 cũng là một yếu tố quan trọng cần cho quá trình hô hấp và quang hợp của vi tảo Nó là yếu tố ổn định độ pH

trong môi trường nước Trong điều kiện môi trường có pH ở ngưỡng từ 5 -

8,5, tảo sử dụng carbon vô cơ dưới dạng H2CO3, CO2, HCO3¯… Tuy nhiên khi

pH quá cao (từ 10 - 12) sẽ làm ức chế sinh trưởng của tảo, thì CO2 vô cơ hầu như không được tảo sử dụng Do đó cần phải có biện pháp bổ sung CO2 khi nuôi đại trà [7]

1.2.5.8 Tình hình nghiên cứu về tảo N Oculata

a Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Để phục vụ cho mục đích nuôi thủy sản, nhiều loài vi tảo trong đó có N

Oculata đã được nghiên cứu và nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm hoặc ở

quy mô sản xuất thử nghiệm Theo Wendy & Kevan (1991), ở Hoa Kỳ các

loài tảo Thalasiossira pseudomonas, Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros

mulleri, N.Oculata, Chlorella minutissima… được nuôi để làm thức ăn cho

luân trùng, ấu trùng hai mảnh vỏ, ấu trùng tôm và cá theo phương thức nuôi từng đợt hoặc bán liên tục trong những bể composite 2m3- 25m3 [12]

Okauchi (2004) đã nghiên cứu đánh giá vai trò tích cực của vi tảo

N.Oculata trong ương nuôi luân trùng làm thức ăn cho ấu trùng cá biển Tác

giả đã tiến hành với 4 lô thí nghiệm nuôi ấu trùng cá được bổ sung luân trùng

và N.Oculata với mật độ 5- 10x 105 tb/ml Riêng bốn lô đối chứng chỉ bổ

sung luân trùng mà không bổ sung N.Oculata Kết thúc thí nghiệm, nồng độ

các nitơ vô cơ (NH4 -N và NO3- N) và phốt pho vô cơ (PO4- P) trong các lô đối chứng tăng lên từ 1,5 - 2,0 lần so với các lô thí nghiệm Đồng thời số

lượng luân trùng và trứng của chúng ở lô thí nghiệm cao hơn so với ở lô đối chứng Hơn nữa, luân trùng trong các lô thí nghiệm có hàm lượng

eicosapentaenoic axít (EPA) và các axit béo không no khác (n- 3HUFA) cao

hơn so với các lô đối chứng Từ kết quả thí nghiệm, cho thấy việc bổ sung vi

tảo N.Oculata vàotrong nước nuôi sẽ mang lại hiệu quả tích cực trong việc

duy trì chất lượng nước và tăng cường chất dinh dưỡng cho luân trùng [28] Converti & cs (2009) tiến hành nghiên cứu về sự ảnh hưởng của nhiệt độ

lên mức độ sinh trưởng và hàm lượng lipid đối với N.Oculata nhằm ứng dụng

cho việc nuôi cấy loài vi tảo này phục vụ cho sản xuất biodiesel Trong

nghiên cứu này Converti cũng đã thiết lập các thí nghiệm nuôi cấy N

Oculata tại các nhiệt độ 15oC, 20oC và 25oC trong môi trường F/2 của Guirllard, sử dụng nguồn cung cấp carbon là CO2 có sẵn trong không khí với tốc độ sục khí khoảng 300ppm và nguồn cung cấp nitơ là NaNO3 Các mẻ nuôi tự dưỡng thực hiện trong 14 ngày dưới ánh sáng liên tục có mật độ dòng photon là 70µE/m2s Kết quả đưa ra, tại 25oC năng suất lipid của N Oculata

đạt giá trị cao nhất, có thể lên đến 12,19mg/lít/ngày và cho hàm lượng C18:1 (nguyên liệu rất phù hợp để sản xuất biodiesel) cao hơn hẳn so với 2 ngưỡng nhiệt độ còn lại mà vẫn đạt giá trị năng suất cao nhất [18]

Trong nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ của

nitơ đến việc tích lũy vitamin E của N.Oculata, Durmaz Y & cs đã nhận định

sự suy giảm nồng độ nitơ sẽ dẫn đến sự tăng tích lũy vitamin E nhưng lại giảm tỉ lệ sinh trưởng của vi tảo, sự khác biệt rõ ràng về thành phần và số

lượng của vitamin E của tảo N.Oculata được cho là phụ thuộc vào các yếu tố

như nguồn nitơ, nồng độ và pha sinh trưởng của tảo [19]

Nghiên cứu của Seiffert & cs (2001) về khả năng tích lũy carotenoid và

vitamin E của vi tảo biển N.Oculata và Chaetoceros calcitras và phương

pháp RP-HPLC đã được sử dụng để xác định khả năng tích lũy carotenoid và

vitamin của cả 2 loại tảo Dạng bột khô, tảo N.Oculata được xác định có độ

tích lũy sinh học cao nhất đối với b-cariotene (28,0±0,6g/kg) tiếp đến là dạng chiết khô của C calcitras (16,9-17g/kg) và dạng bột khô C calcitras

(15,6±0,1g/kg) Đối với lycopene thì dạng dịch chiết khô của N.Oculata có

khả năng tích lũy sinh học cao nhất (42,6±1,1g/kg) [33]

Trên thế giới, một số mô hình nuôi sinh khối tảo đã được tiến hành nuôi

trong các túi PE có thể tích 100 - 150L hoặc trong các cột thủy tinh hình trụ

trong (nuôi theo mẻ và liên tục), hệ thống các ao ngoài trời hình chữ nhật, hình tròn có thể tích 8m3-300m3, hệ thống ao luân hồi Các hệ thống này tuy đơn giản nhưng lại hạn chế mật độ tế bào khi nuôi [36]

Hiện nay, trên thế giới có 4 kiểu thiết kế khác nhau cho hệ thống nuôi kín quang phản ứng sinh học: hệ thống ống dẫn, hệ thống vành khuyên, hệ thống vành khuyên, hệ thống tấm, hệ thống bảng Các hệ thống này đều hoạt động theo cùng một nguyên lý và ưu điểm đều là năng suất mật độ cao, ít tốn công lao động không bị nhiễm tạp trong quá trình nuôi, tảo thu đạt chất lượng cao [16]

b Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở nước ta, những năm gần đây vi tảo N.Oculata được sử dụng rộng rãi

trong nuôi trồng thủy sản, nên đã có nhiều nghiên cứu về nó nhưng chỉ dừng

ở mức ứng dụng trong thủy sản

Như trong nghiên cứu về quy trình công nghệ nhân nhanh sinh khối ban đầu vi tảo biển làm thức ăn tươi sống cho ấu trùng thủy sản kinh tế của Trần Văn Tựa (2002) thì kết quả ban đầu cho thấy mật độ nhân nhanh vi tảo trong

phòng thí nghiệm có thể đạt tới 50 -150x106 tb/ml [14]

Ở nghiên cứu về ảnh hưởng của độ mặn, nhiệt độ và mật độ ban đầu để

phát triển quần thể vi tảo biển Isochrisis galbana và N.Oculata cho sinh sản cá

biển của Lê Xân (2007) Kết quả cho thấy nhiệt độ phù hợp cho 2 vi tảo trên là

từ 20 - 30oC, và nhiệt độ tốt nhất là 25oC Độ mặn trong khoảng 20 -30‰, độ mặn tối ưu là 25‰ Mật độ ban đầu trong khoảng 2- 5x106 tb/ml [10]

Trong nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn, ánh sáng và tỉ lệ thu hoạch lên

một số đặc điểm sinh học và thành phần sinh hóa của 2 loài vi tảo N.Oculata (Droop) Hibberd 1981 và Chaetoceros muelleri Lemmerman 1898 trong điều

kiện phòng thí nghiệm của Phạm Thị Lam Hồng (1999) đã kết luận tảo

N.Oculata có thể phát triển ở từ 10- 35‰ nhưng chúng có ngưỡng thích nghi

tốt nhất ở 30 - 32‰ [8]

Cái Ngọc Bảo Anh (2009) nghiên cứu về sinh trưởng quần thể tảo

N.Oculata được nuôi trong môi trường F/2 có điều chỉnh mật độ và dạng

muối nitơ, đã đưa ra mô hình nuôi thử nghiệm sinh khối tảo N.Oculata trong

các túi nilon thể tích 50L bằng môi trường F/2 Trong đó, nguồn nitơ được cung cấp dưới dạng NaNO3 hoặc (NH4)2SO4 với hàm lượng nguyên tố nitơ được điều chỉnh ở các mức 0,5: 1,0 (đối chứng): 1,5: 2,0 lần so với nồng độ

F/2 chuẩn nhằm đánh giá mật độ tảo và thời gian đạt đến pha cân bằng, tốc độ sinh trưởng và quần thể và lượng phân bón sử dụng Kết quả cho thấy, khi giảm ½ lượng nitơ so với môi trường F/2 tiêu chuẩn, mật độ tế bào tảo ở thời điểm pha cân bằng thấp hơn đáng kể so với 3 mức phân bón còn lại Việc gia tăng thêm hàm lượng nitơ (1,5 và 2 lần) không làm thay đổi đáng kể mật độ tảo so với F/2 tiêu chuẩn Không có sự sai khác trong việc thay thế nuôi NaNO3 bằng (NH)4SO4 trong môi trường tiêu chuẩn Như vậy, hàm lượng nitơ dưới dạng NaNO3 trong môi trường F/2 là hoàn toàn phù hợp với nhu cầu

dinh dưỡng của N.Oculata trong điều kiện sản xuất tại Việt Nam, có thể thay

thế nitơ dưới dạng NaNO3 bằng (NH4)SO4 trong môi trường F/2 với nồng độ 58,2 mg/l sẽ thu được mật độ tế bào (23,54x 106tb/ml) không sai khác so với F/2 tiêu chuẩn vào ngày nuôi thứ bảy [3]

Bùi Bá Trung (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ ban đầu và tỉ

lệ thu hoạch lên sinh trưởng vi tảo N.Oculata trong hệ thống ống dẫn trong

suốt nước chảy liên tục Hệ thống nuôi bao gồm 10 ống thủy tinh trong suốt, quá trình nuôi luôn ở mức độ thích hợp Thí nghiệm về các mật độ ban đầu khác nhau ảnh hưởng lên sinh khối của quần thể tảo đã đạt được thực hiện Mật độ ban đầu thích hợp nhất được xác định là 8 x 106 tb/ml với mật độ cực đại đạt đến 61,07 x 106 tb/ml, đây là một mật độ rất cao khi sinh sản với các

hệ thống nuôi N.Oculata khác nhau ở Việt Nam như túi nilon, bể composit

Trong nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ thu hoạch lên sinh khối quần thể tảo

đã cho thấy ở tỉ lệ thu hoạch 10% thể tích nuôi, sinh trưởng quần thể tảo ít bị ảnh hưởng nhất [1]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 2/2012 đến tháng 6/2012

- Địa điểm: + Bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp

+ Bộ môn Công nghệ Sinh học Tảo - Viện Nghiên cứu Hải sản

2.2 Vật liệu nghiên cứu

+ Máy sục khí, dây dẫn khí loại nhỏ

+ Máy đo quang phổ

*Nước biển tự nhiên dùng để nuôi tảo

Nước dùng trong nuôi tảo là mẫu nước được lấy từ Hạ Long đem về, sau

đó được lọc qua màng lọc Sau khi lọc xong ta để lắng 1 tuần, tiến hành khử

trùng, lấy nước đem đi nuôi cấy tảo

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập tảo N.Oculata

Chủng tảo N.Oculata sử dụng trong nghiên cứu được thu thập và phân

lập từ nước biển Hạ Long

Việc phân lập tảo được làm qua các bước sau:

Lấy mẫu ở biển Kiểm tra các điều kiện (nhiệt độ, pH, độ mặn )

Lọc mẫu Nuôi bằng cách bổ sung môi trường F/2 vào nước biển

Cấy chuyền nhiều lần trên môi trường thạch F/2( pha loãng các tỉ lệ khác nhau để thu được khuẩn lạc, kết hợp soi trên kính hiển vi để xác định loài)

Phân lập được chủng tảo N.Oculata thuần

Thuyết minh quy trình

Thu mẫu là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu bất kỳ sinh vật nào

Không giống các sinh vật khác như vi nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn Đối với tảo thì khi thu mẫu phải dùng lưới vớt sinh vật phù du có kích thước lỗ phù hợp theo mục đích sử dụng và kích thước của vi tảo, hoặc có thể dùng màng lọc sinh học để thu mẫu tảo, tuy nhiên không nên để mẫu tảo quá lâu mới đem đi

phân lập Mẫu tảo sau khi thu, tiến hành kiểm tra các điều kiện như nhiệt độ, độ

mặn, ánh sáng, pH để đảm bảo cho tảo có thể sống trong phòng thí nghiệm Người

ta có thể dùng một số dụng cụ sau để kiểm tra các thông số trên như:

Sử dụng nhiệt kế thủy ngân chia vạch (0 - 100oC) (Đức) để xác định chính xác ngưỡng nhiệt độ thí nghiệm

Sử dụng máy đo đa thông số YSI (Mỹ) để đo pH Cụ thể đưa máy đo thông số vào nguồn nước cần kiểm tra Sau thời gian ngắn, máy hiển thị thông

số pH của môi trường nuôi

Sử dụng khúc xạ kế S/mill - e, Atago (Nhật Bản) để đo độ mặn nước biển

Cụ thể nhỏ 1- 2 giọt nước trong mẫu nước cần xác định độ mặn lên mặt kính Rồi

đưa kính ra nơi sáng quan sát và kết quả được hiển thị qua ống nhòm ngay sau đó

Sử dụng lux kế (Nhật Bản) xác định cường độ ánh sáng Đưa bộ phận cảm ứng ánh sáng của lux kế vào nơi cần đo cường độ ánh sáng Thông số cường độ sáng sẽ hiển thị trên màn hình

Tiến hành lọc mẫu , thu tảo sạch không có vi khuẩn và loại bỏ các loài vi tảo khác có trong nước biển bằng cách sử dụng màng lọc Thông thường thì

đối với tảo N.Oculata người ta thường sử dụng màng lọc có kích thước 5

micromet Sau khi lọc mẫu, thu lấy dung dịch đã chảy qua màng lọc, bổ sung môi trường F/2 vào dung dịch và bắt đầu sục khí ngay để các tế bào tảo

N.Oculata phát triển Sau 2 - 3 tuần, khi thấy dung dịch dần có màu xanh đặc

trưng của tảo N.Oculata, tiến hành cấy trên môi trường thạch F/2 Mẫu tảo

được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, theo chiều hướng giảm dần nhằm làm giảm mật độ tế bào tảo để khi nuôi cấy các khuẩn lạc thưa trên môi trường thạch, dễ dàng trong khi phân lập Có thể pha loãng theo các tỉ lệ 1:5:10:20:50:100 lần để cấy và so sánh

Mẫu tảo sau khi được pha loãng cho vào đĩa petri có bổ sung thành phần dinh dưỡng là môi trường F/2 Dùng que cấy chang gạt dàn đều trên khắp bề mặt môi trường thạch cho đến khi dung dịch tảo khô đi trên mặt thạch Tảo được nuôi trong điều kiện thích hợp ánh sáng 4000 lux với thời gian chiếu sáng 12/24h, sau 14-20 ngày thì mọc thành khuẩn lạc

Khuẩn lạc tảo dạng tròn có màu xanh lục mọc trên bề mặt môi trường thạch cũng lẫn các khuẩn lạc tạp nhiễm Dựa vào hình thái màu sắc và một số tính chất hóa sinh để chọn khuẩn lạc mong muốn Sau khi xác định được khuẩn lạc, dùng que cấy vi khuẩn tách khuẩn lạc cho vào lọ có kích thước nhỏ

đựng môi trường dịch thể Quá trình phân lập được lặp lại nhiều lần cho đến khi xác định được loài thuần khiết dựa vào quan sát trên kính hiển vi và một

số tính chất khác Các khuẩn lạc tảo sẽ phát triển trong 15 đến 20 ngày, sau thời gian đó, một khuẩn lạc của loài tảo mong muốn được tách ra và cấy lại trong một ống mới Quá trình này được lặp lại nhiều lần để thu được một dòng tảo thuần

2.3.2 Môi trường nuôi tảo

Môi trường thích hợp để nuôi tảo N Oculata là môi trường F/2 ( theo

Guillard 1975), môi trường được bổ sung các thành phần như bảng sau:

Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của môi trường F/2

2.3.3 Phương pháp lưu giữ và bảo quản giống tảo

Giữ giống là biện pháp bảo quản kỹ thuật nhằm giữ giống gốc để chủ động trong quá trình sản xuất Việc chọn tảo giống để giữ và nuôi sinh khối

rất quan trọng phải đảm bảo giống sạch không nhiễm tạp vì thế tất cả các thao tác kỹ thuật trong cấy và giữ giống tảo đều phải đảm bảo vô trùng

Có hai cách để lưu giữ giống tảo: - Lưu giữ trên môi trường thạch

- Lưu giữ trên môi trường lỏng

2.3.3.1 Lưu giữ trên môi trường thạch

a) Chuẩn bị

- Tất cả dụng cụ phải được hấp sấy tiệt trùng trước khi sử dụng

- Chuẩn bị 15 g agar/1 lít để làm môi trường nuôi cấy

- Môi trường F/2 đã được khử trùng (theo công thức trên)

- Sử dụng nước biển đã lọc để chuẩn bị môi trường F/2 (không có vitamin) hoặc có thể pha môi trường F/2 theo kiểu dung dịch gốc (không có vitamin), sau đó bổ sung vào nước biển (đã khử trùng) theo tỷ lệ

- Vitamin được bổ sung vào môi trường F/2 theo tỷ lệ sau khi khử trùng (để nguội đến 450C) Cho môi trường vào ống nghiệm đã tiệt trùng, có nắp đậy và để nghiêng, đợi cho môi trường nguội hoàn toàn Các thao tác này được tiến hành trong điều kiện vô trùng, tránh nhiễm khuẩn

b) Pha môi trường agar

Pha môi trường agar 1.5% (pha 1.5 gam agar trong 100 ml nước), đun hoà tan agar trên ngọn lửa Bunsen khi thấy agar tan hết đem hấp tiệt trùng ở

121 0C, 1 atm trong 20 phút, để nhiệt độ xuống còn 50 – 60 0C, cho vitamine vào lắc đều rồi đổ ra đĩa Petri (đã khử trùng) với thể tích agar bằng 1/3 thể tích đĩa Petri Sau đó để nguội agar trong tủ cấy vô trùng Mọi thao tác tiến hành trong điều kiện vô trùng Để 30 phút – 1h cho thạch đông lại

c) Tiến hành cấy

Tảo giống được cấy trên môi trường F/2 có bổ sung agar (nồng độ agar 1,5%) Dùng que cấy hơ trên ngọn lửa đèn cồn, đợi cho que cấy nguội, lấy một ít tảo giống cấy ziczac trên bề mặt thạch nghiêng trong ống nghiệm Tảo

nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng 1500 lux với chu kỳ chiếu sáng là 10h:14h, nhiệt độ 18oC Sau 7 - 10 ngày, tảo mọc trên mặt thạch Kiểm tra các quần lạc tảo thuần khiết, chọn ống nghiệm hoặc đĩa thạch nào có khuẩn lạc tảo lên đẹp sau để lưu giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 – 5oC, hạn chế ánh sáng [9]

2.3.3.2 Lưu giữ giống trên môi trường lỏng

a) Môi trường nuôi

+ Nước biển đã khử trùng

+ Môi trường dinh dưỡng F/2

b) Phương pháp cấy tảo từ môi trường thạch sang môi trường lỏng

Chọn trên đĩa thạch có tảo phát triển tốt dùng que cấy tròn lấy tảo giống

từ đĩa thạch (chọn đường cấy có tảo phát triển tốt nhất) và cho vào ống nghiệm đựng 10 ml nước biển có chứa môi trường dinh dưỡng, lắc đều bằng máy lắc, đậy kín nắp ống nghiệm và gián kín bằng giấy parapin

c) Phương pháp lưu giữ giống

Dịch tảo thuần được thu nuôi ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng của tảo đạt tốt nhất được lấy làm nguồn giống lưu giữ, mật độ ban đầu 8x105 -

1x106 tb/ml Tảo được nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng yếu có cường độ 750 -

1000 lux, nhiệt độ 15 - 20oC Định kỳ 1 tuần chuyển giống 1 lần [5]

2.3.4 Xác định các điều kiện tối ưu để nuôi cấy tảo N.Oculata

2.3.4.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến

Để xây dựng quy trình nuôi sinh khối N Oculata cần dựa trên kết quả

thu được từ những nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (nhiệt độ, cường độ chiếu sáng, độ mặn, ánh sáng) lên sinh trưởng và phát

triển của tảo N Oculata Từ đó xây dựng quy trình nuôi phù hợp cho N

Oculata trong điều kiện phòng thí nghiệm