Để xây dựng quy trình nuôi sinh khối N. Oculata cần dựa trên kết quả thu được từ những nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (nhiệt độ, cường độ chiếu sáng, độ mặn, ánh sáng) lên sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata. Từ đó xây dựng quy trình nuôi phù hợp cho N. Oculata trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Hình 2.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến.
Thuyết minh quy trình nuôi:
Tảo giống được chuyển từ môi trường thạch sang môi trường lỏng trong các bình tam giác 250mL. Nuôi và nhân sinh khối vi tảo với mật độ tế
bào từ 105 đến 106 tế bào/ml. Giống tảo phải phát triển đồng nhất, không nhiễm tạp, không tàn lụi. Sau đó tiến hành nhân giống theo: nhân giống cấp 1, nhân giống cấp 2 và nhân giống trung gian . Các điều kiện chung trong
nhân giống cấp 1, 2 và trung gian: môi trường dinh dưỡng F/2, thể tích tảo
giống bằng 1/5 thể tích dung dịch (dung dịch bao gồm nước biển và môi
trường dinh dưỡng F/2), độ mặn 25‰, nhiệt độ 25oC, chu kỳ chiếu sáng là 12h:24h.
- -Nhân giống cấp 1: tảo giống nuôi ở thể tích 50 - 100ml được cấy chuyển sang bình tam giác 250 - 500ml. Giống tảo được nuôi trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, cường độ chiếu sáng 1500 - 2000 Lux, thời gian chiếu
sáng 12/24 và được lắc đều 2 lần/ ngày. Sau 7 - 8 ngày nuôi, tiến hành nhân giống cấp 2.
- Nhân giống cấp 2: Tảo giống nuôi ở thể tích 250 - 500 ml được cấy chuyển sang bình nhựa ở thể tích 750 - 1000 ml. Giống được nuôi trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux, và được sục khí với tốc độ nhẹ. Sau 7 - 8 ngày nuôi, tiến hành nhân giống trung gian.
- Nhân giống trung gian: Tảo giống nuôi ở thể tích 750 - 1000ml được cấy chuyển sang bình nhựa với dung tích là 3,75 - 5L. Sục khí với tốc độ vừa phải 24/24h. Giống được nuôi trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, cường độ chiếu
Tảo giống Nhân giống Xác định các điều
như ( nhiệt độ,cường độ ánh sáng, độ mặn, chu kỳ chiếu sáng). Xác định mật độ tảo sau 10 ngày Lựa chọn thông số thích hợp
sáng 2500 - 3500 lux, thời gian chiếu sáng 12/24. Sau 7 ngày, giống được chuyển sang nuôi sinh khối. Sử dụng nguồn giống này để thực hiện các thí nghiệm.
- Nhân sinh khối trong phòng thí nghiệm: Tảo giống từ giai đoạn trung gian sẽ chuyển sang nuôi ở thể tích 10L. Mật độ giống ban đầu: 3.5 – 4.0x 106 tb/ml. Giống được nuôi trong điều kiện khác nhau để tìm ra các điều kiện tối
ưu cho tảo phát triển. Sau 10 ngày thì lấy mẫu tảo và tiến hành đếm để xác
định mật độ tảo cực đại đạt được .Từ đó lựa chọn được các thống số nhiệt độ,
độ mặn, ánh sáng, cường độ chiếu sáng thích hợp để cho tảo N.Oculata phát triển tốt nhất.
2.3.4.2. Phương pháp xác định mật độ tảo
a. Phương pháp tiến hành
Mẫu tảo được đựng trong ống falcon có thế tích 15ml và được cố định bằng formol 10%. Chu kỳ lấy mẫu: 24h/lần.
Chuẩn bị các ống ependof. Hút ra 450 µl và cho vào 50 µl formaldehit. Khuấy đều trong 5 - 10 phút để cố định.
Xác định mật độ tế bào: Xác định mật độ tế bào bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer (Đức), dùng vật kính 40 để quan sát.
Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào. Đậy lamelle lên 2 khu vực có kẻ ô đếm. Đưa buồng đếm lên kính hiển vi, lắc mẫu cho đều dùng pipet nhỏ mẫu cần xác định vào khe buồng đếm chỗ lá kính đậy lên, dung dịch theo mao dẫn lan khắp ô đếm. Để
yên buồng đếm trong khoảng 5 phút để tế bào tảo lắng xuống. Đếm tế bào tảo
ở 5 ô trung bình của khu vực đếm hồng cầu (4 ô ở bốn góc và 1 ô giữa). trong mỗi ô trung bình đếm cả 16 ô nhỏ. Trong mỗi ô nhỏ, đếm tất cả những hồng cầu nằm gọn trong ô và những hồng cầu nằm ở cạnh trên và cạnh trái.
+ Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm hồng cầu là một miếng kính dày hình chữ nhật, mặt trên có 2 khu vực có kẻ ô đếm dưới kính hiển vi , buồng đếm được chia thành 9 ô vuông lớn, mỗi ô có diện tích 1mm2. Ô chính giữa được sử dụng để đếm được chia thành 25 ô trung bình, mỗi ô trung bình
- Mỗi buồng đếm có các Block: A, B, C, D, và E.
- Mỗi Block: A, B, C, D được chia làm 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vuông có diện tích 1 mm2, sâu 0.1 mm nên thể tích của mỗi ô sẽ là 0.1 mm3
Nếu đếm tảo trong mỗi 4 ô này là thì mật độ tảo là: d(tb/ml)= x 104 (tb/ml)
- Riêng Block E được chia làm 25 ô vuông nhỏ, mỗi ô có thể tích là 1/25 x 0.1 mm3 (0.004 mm3 = 0.000004 ml = 4 x 10-6 ml), mỗi ô vuông nhỏ lại
được chia làm 16 ô vuông nhỏ hơn.
Nếu đếm tảo trong mỗi ô nhỏ (trong 25 ô vuông) là thì mật độ tảo là: d(tb/ml) = /V=X/4 x 106 (tb/ml)
Trong đó:
d: mật độ tế bào (tb/ml).
: số tế bào trung bình của 1 ô (bằng tổng số tế bào đếm được/số ô đếm). V: thể tích của ô đếm.
b. Phương pháp theo dõi tốc độ phát triển của tảo
+ Hàng ngày đếm mật độ tảo.
+ Dùng buồng đếm hồng cầu để đếm số lượng tế bào tảo trực tiếp dưới kính hiển vi nhằm xác định được thời gian phát triển của các pha.
+ Tổng kết số liệu và vẽ đồ thị tăng trưởng của các tảo N. Oculata.
2.3.4.3 Xác định nhiệt độ tối ưu
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ tế bào vi tảo: 3,5 - 4,0 x106 tb/ml; + Cường độ ánh sáng: 3500 lux;
+ pH: 7.5-8.5
+ Độ mặn : 25‰.
+ Thời gian chiếu sáng: 12:24 (giờ). + Sục khí liên tục.
+ Sử dụng môi trường f/2: tỷ lệ 1ml/1L nước biển. + Thể tích nuôi: 10L.
Hình 2.2. Sơ đồ xác định sựảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata
2.3.4.4 Xác định cường độ ánh sáng tối ưu.
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ tế bào vi tảo: 3,5 - 4,0 x106 tb/ml;
+ Nhiệt độ: 250C; + pH: 7.5-8.5
+ Độ mặn: 25‰.
+ Thời gian chiếu sáng: 12:24 (giờ). + Sục khí liên tục
+ Sử dụng môi trường f/2: tỷ lệ 1ml/1L nước biển. + Thể tích nuôi: 10L. Tảo giống Nhân giống Xác định mật độ tảo Lựa chọn được nhiệt độ thích hợp Nhiệt độ 25ºC Nhiệt độ 28ºC Nhiệt độ 22ºC Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3
Hình 2.3. Sơ đồ xác định sựảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata.
2.3.4.5 Xác định độ mặn tối ưu.
Điều kiện thí nghiệm :
+ Mật độ tế bào vi tảo: 3,5 - 4,0 x106 tb/ml. + Nhiệt độ: 250C.
+ pH: 7.5-8.5
+ Cường độ chiếu sáng: 4000 Lux. + Sục khí liên tục.
+ Thời gian chiếu sáng: 12:24 (giờ).
+ Sử dụng môi trường f/2: tỷ lệ 1ml/1L nước biển. + Thể tích nuôi: 10L. Tảo giống Nhân giống Xác định mật độ tảo sau 10 ngày Lựa chọn được cường độ ánh sáng thích hợp 3000 lux 4000 lux 2000 lux Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3
Hình 2.4. Sơ đồ xác định sựảnh hưởng của độ mặn đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata
2.3.4.6 Xác định chu kỳ chiếu sáng tối ưu.
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ ban đầu: 3,5 - 4x106 tb/ml. + Nhiệt độ: 25ºC.
+ Cường độ chiếu sáng: 4000 lux.
+ pH: 7.5 – 8.5 + Độ mặn: 25‰.
+ Sục khí liên tục.
+ Môi trường dinh dưỡng: f/2 (tỷ lệ 1ml/1L nước biển).
+ Thể tích nuôi: 10L.
Tảo giống
Nhân giống
Xác định mật độ tảo sau 10 ngày Độ mặn 25 ‰ Độ mặn 28 ‰ Độ mặn 22‰ Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lựa chọn được độ mặn thích hợp
Hình 2.5. Sơ đồ xác định sự ảnh hưởng của độ dài chiếu sáng đến sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata
Tảo giống
Nhân giống
Xác định mật độ tảo sau 10 ngày
Lựa chọn được chu kỳ chiếu sáng thích hợp
20h: 4h 24h: 0h 16h: 8h Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập tảo N.Oculata.
Quá trình phân lập tảo từ lúc lẫy mẫu về cho đến khi thu được chủng tảo
thuần khiết được ghi lại ở hình 3.1.
Hình 3.1. Quá trình phân lập giống tảo thuần N.Oculata đã được phân lập A. Dung dịch nước biển + F/2 sau khi đã lọc qua màng lọc 5micromet
B. Quá trình cấy tảo được lặp lại nhiều lần
C. Quá trình nuôi tảo trên đĩa để thu khuẩn lạc
D.Giống tảo thuần N.Oculata đã được phân lập
Phân lập tảo N.Oculata bằng phương pháp pha loãng rồi cấy trên môi
trường dinh dưỡng có thạch. Tảo sẽ hình thành các khuẩn lạc từ một tế bào
A B
ban đầu mang màu sắc, đặc điểm của loài. Các hộp petri chứa tảo được đặt trong điều kiện ánh sáng yếu từ 600-1000 lux, nhiệt độ thấp từ 17-220 C. Sau 2 tuần khi các khuẩn lạc vi tảo đã hình thành rõ, dùng micropipet để phân lập dưới kính hiển vi. Cho mẫu tảo lên lam kính, dùng kính hiển vi soi và cố định
tế bào. Sau đó dùng micropipet hút tế bào đã xác định, cho vào lọ có kích thước nhỏ đựng môi trường dịch thể để nuôi. Lượng môi trường dịch thể chỉ
cần 20-30 cm3 . Sau nửa tháng dưới điều kiện ánh sáng, nhiệt độ như trên, môi trường sinh trưởng bắt đầu có màu xanh đặc trưng của loài. Quá trình được
lặp lại nhiều lần (7-10 lần) để phân lập được giống tảo thuần N.Oculata như
trong hình 3.1.
3.2. Lưu giữ, bảo quản và nhân giống tảo N. Oculata 3.2.1.Lưu giữ và bảo quản giống 3.2.1.Lưu giữ và bảo quản giống
Áp dụng theo phương pháp lưu giữ và bảo quản tảo giống của Dương
Tiến Đức [5] chúng tôi thu được kết quả lưu giữ và bảo quản tảo giống N. Oculata như sau:
- Tảo giống N. Oculata được lưu giữ trong môi trường thạch nghiêng có thể đạt khoảng 5 - 6 tháng mới phải cấy chuyển mà vẫn giữ được chất lượng
giống tốt.
- Tảo giống được lưu giữ trong môi trường lỏng phải cấy truyền định kỳ
1lần/tuần thì sau khoảng 6 - 8 lần cấy truyền, tương ứng với 6 - 8 tuần lưu giữ
thì chất lượng giống suy giảm dần, tảo lắng đáy nhiều. Cách lưu giữ này tốn môi trường, thời gian chăm sóc nhiều, nhưng có ưu điểm cung cấp giống nhanh chóng.
Hình 3.2. Lưu giữ tảo trên môi trường thạch nghiêng và môi trường lỏng trong tủ lạnh (A và B) hoặc trong môi trường lỏng ánh sáng yếu ở nhiệt
độ 25oC (C và D). 3.2.2.Nhân giống các cấp
Thực hiện theo phương pháp nhân giống của Helm M. M. (2004) [22]. Kết quả nhân nuôi tảo N. Oculata giống các cấp đạt được như sau:
Ở các cấp nhân giống, sau 7 ngày nuôi dung dịch tảo đều có màu xanh nõn chuối (màu sắc đặc trưng của tảo N. Oculata,). Qua quá trình quan sát
dưới kính hiển vi, các tế bào tảo phát triển đồng đều, đạt tiêu chuẩn về chất lượng và số lượng để nhân chuyển giống sang các cấp cao hơn.
- Nhân giống cấp 1 sau 4 ngày nhân nuôi, mật độ tảo đạt 12 - 14x106 tb/ml.
- Nhân giống cấp 2 sau 6 ngày nhân nuôi, mật độ tảo đạt 18 - 22x106 tb/ml.
- Nhân giống cấp trung gian sau 7 ngày nhân nuôi, mật độ tảo đạt 24 -
C D
28x106tb/ml.
Hình 3.3. Tảo giống các cấp
(A. Giống cấp 1, B. Giống cấp 2, C. Giống trung gian)
Từ nguồn tảo nhân giống trung gian trên được chúng tôi sử dụng làm nguồn tảo giống ban đầu cho các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một
số yếu tố môi trường lên sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata.
3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện tối ưu đến sinh trưởng, phát triển của tảo N.Oculata. tảo N.Oculata.
3.3.1.Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến hình thái, chức
năng sinh lý và khả năng sinh sản của vi tảo nói chung và loài N.Oculata nói riêng. Vì vậy, để tìm được nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và phát triển của vi tảo N. Oculata, trong nghiên cứu này đã tiến hành thử nghiệm nuôi ở các
Hình 3.4. Biến động mật độ trung bình tảo N. Oculata theo nhiệt độ
Từ hình 3.4 và phụ lục 5, ta thấy pha thích nghi ở các nhiệt độ 22oC, 25oC và 28oC đều kéo dài khoảng 10-11 ngày nuôi. Trong giai đoạn này, mật độ tảo tăng chậm. Sau 10 ngày nuôi mật độ tảo bắt đầu có xu hướng tăng
nhanh chóng. Cụ thể, mật độ tảo ở 22oC đạt 27,03 x106 tb/ml, ở 25oC là 47,39x106 tb/ml và ở 280 C đạt 35,11x106 tb/ml. Lúc này mật độ tảo đã chuyển sang pha tăng trưởng, xu hướng tăng của mật độ tảo ở các lô thí
nghiệm bắt đầu phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ.
Ở nhiệt 25oC là mức nhiệt độ tảo có sự phát triển và thích nghi tốt nhất.
Sau 10 ngày nuôi tảo đạt mật độ 47,39x106 tb/ml. Sang ngày thứ 12 mật độ
tảo nhảy vọt lên 55,19x106 tb/ml. Pha tăng trưởng của điều kiện nhiệt độ này kéo dài tới ngày thứ 16, mật độ tảo đạt được 71,17 x106 tb/ml thì tảo chuyển
sang pha cân bằng. Mật độ tảo đạt ngưỡng cực đại trên 70 x106 tb/ml . Tuy nhiên do sự thay đổi về nhiệt độ đã làm cho mật độ tảo có sự thay đổi rõ rệt.
Sau ngày 16, mật độ tảo giảm dần và bắt đầu chuyển sang pha tàn lụi.
Ở pha tăng trưởng của 2 nhiệt độ: 22oC và 28oC mật độ tảo cũng tăng nhưng không tăng đột biến như ở 25oC. Mật độ tảo ở pha tăng trưởng ở 28oC hầu như luôn cao hơn và thời gian để đạt tới pha cân bằng nhanh hơn ở 22oC
0 10 20 30 40 50 60 70 80 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 M ậ t đ ộ ( tr . tb / m l) Ngày
Biến động mật độ tảo N. Oculata theo nhiệt độ
(ở 28oC là 14 ngày và ở 22oC là 19 ngày). Tuy nhiên, mật độ đạt cực đại ở
28oC lại thấp hơn ở 22oC (ở 28oC mật độ cực đại đạt 47,81x106 tb/ml và 22oC mật độ cực đại đạt 52,18 x106 tb/ml).
Khi phân tích ANOVA một nhân tố về mật độ cực đại sẽ đánh giá chính xác hơn nữa ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và phát triển đến vi tảo này. Điều này được thể hiện ở bảng dưới đây:
Bảng 3.1: Mật độ tảo cực đại ở các mức nhiệt độ khác nhau Lô thí nghiệm
22oC 25oC 28oC
Mật độ cực đại
(x106 tb/ml) 52,18a±1,0 71,7b±0,67 47,81c±0,71
a, b, c, Trong cùng một hàng, các giá trị trung bình có ký tự viết lên trên khác nhau thì sai
khác có ý nghĩa (P<0,05),± độ lệch chuẩn (SD)
Kết quả trình bày trong bảng 3.1 cho thấy: Ở các nhiệt độ khác nhau thì mật độ tảo đạt cực đại cũng khác nhau. Kết quả phân tích ANOVA một nhân
tố (P< 0,05) về mật độ cực đại ở các nhiệt độ 22oC, 25oC, 28oC có sự sai
khác thống kê về mật độ cưc đại giữa các mức nhiệt độ.
Dựa trên các kết quả thu được và qua phân tích ANOVA một nhân tố
(Phụ lục 5), chúng tôi nhận thấy rằng, N. Oculata tuy là loài có khả năng thích
nghi với phổ nhiệt độ rộng. Nhưng trong khoảng nhiệt độ thí nghiệm (20oC -
28oC) ta thấy nhiệt độ càng cao thì mức độ sinh trưởng của loài tảo này càng hạn chế. Nhiệt độ phù hợp cho sinh trưởng và phát triển là 20 - 30oC (P<0,05),