Chủng tảo N.Oculata sử dụng trong nghiên cứu được thu thập và phân lập từ nước biển Hạ Long.
Việc phân lập tảo được làm qua các bước sau:
Lấy mẫu ở biển
Kiểm tra các điều kiện (nhiệt độ, pH, độ mặn....)
Lọc mẫu
Nuôi bằng cách bổ sung môi trường F/2 vào nước biển
Cấy chuyền nhiều lần trên môi trường thạch F/2( pha loãng các tỉ lệ khác nhau để thu được khuẩn lạc, kết hợp soi trên kính hiển vi để xác định loài)
Phân lập được chủng tảo N.Oculata thuần
Thuyết minh quy trình
Thu mẫu là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu bất kỳ sinh vật nào. Không giống các sinh vật khác như vi nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn....Đối với tảo
thì khi thu mẫu phải dùng lưới vớt sinh vật phù du có kích thước lỗ phù hợp
theo mục đích sử dụng và kích thước của vi tảo, hoặc có thể dùng màng lọc
sinh học để thu mẫu tảo, tuy nhiên không nên để mẫu tảo quá lâu mới đem đi
phân lập. Mẫu tảo sau khi thu, tiến hành kiểm tra các điều kiện như nhiệt độ, độ
mặn, ánh sáng, pH để đảm bảo cho tảo có thể sống trong phòng thí nghiệm.Người
ta có thể dùng một số dụng cụ sau để kiểm tra các thông số trên như:
Sử dụng nhiệt kế thủy ngân chia vạch (0 - 100oC) (Đức) để xác định
chính xác ngưỡng nhiệt độ thí nghiệm.
Sử dụng máy đo đa thông số YSI (Mỹ) để đo pH. Cụ thể đưa máy đo
số pH của môi trường nuôi.
Sử dụng khúc xạ kế S/mill - e, Atago (Nhật Bản) để đo độ mặn nước biển. Cụ thể nhỏ 1- 2 giọt nước trong mẫu nước cần xác định độ mặn lên mặt kính. Rồi
đưa kính ra nơi sáng quan sát và kết quả được hiển thị qua ống nhòm ngay sau đó.
Sử dụng lux kế (Nhật Bản) xác định cường độ ánh sáng. Đưa bộ phận cảm ứng ánh sáng của lux kế vào nơi cần đo cường độ ánh sáng. Thông số cường độ sáng sẽ hiển thị trên màn hình.
Tiến hành lọc mẫu , thu tảo sạch không có vi khuẩn và loại bỏ các loài vi tảo khác có trong nước biển bằng cách sử dụng màng lọc. Thông thường thì
đối với tảo N.Oculata người ta thường sử dụng màng lọc có kích thước 5 micromet. Sau khi lọc mẫu, thu lấy dung dịch đã chảy qua màng lọc, bổ sung
môi trường F/2 vào dung dịch và bắt đầu sục khí ngay để các tế bào tảo
N.Oculata phát triển. Sau 2 - 3 tuần, khi thấy dung dịch dần có màu xanh đặc
trưng của tảo N.Oculata, tiến hành cấy trên môi trường thạch F/2. Mẫu tảo
được pha loãng ở các nồng độ khác nhau, theo chiều hướng giảm dần nhằm làm giảm mật độ tế bào tảo để khi nuôi cấy các khuẩn lạc thưa trên môi trường thạch, dễ dàng trong khi phân lập. Có thể pha loãng theo các tỉ lệ
1:5:10:20:50:100 lần để cấy và so sánh.
Mẫu tảo sau khi được pha loãng cho vào đĩa petri có bổ sung thành phần
dinh dưỡng là môi trường F/2. Dùng que cấy chang gạt dàn đều trên khắp bề
mặt môi trường thạch cho đến khi dung dịch tảo khô đi trên mặt thạch. Tảo
được nuôi trong điều kiện thích hợp ánh sáng 4000 lux với thời gian chiếu sáng 12/24h, sau 14-20 ngày thì mọc thành khuẩn lạc.
Khuẩn lạc tảo dạng tròn có màu xanh lục mọc trên bề mặt môi trường thạch cũng lẫn các khuẩn lạc tạp nhiễm. Dựa vào hình thái màu sắc và một số
tính chất hóa sinh để chọn khuẩn lạc mong muốn. Sau khi xác định được khuẩn lạc, dùng que cấy vi khuẩn tách khuẩn lạc cho vào lọ có kích thước nhỏ
đựng môi trường dịch thể. Quá trình phân lập được lặp lại nhiều lần cho đến
khi xác định được loài thuần khiết dựa vào quan sát trên kính hiển vi và một số tính chất khác. Các khuẩn lạc tảo sẽ phát triển trong 15 đến 20 ngày, sau thời gian đó, một khuẩn lạc của loài tảo mong muốn được tách ra và cấy lại trong một ống mới. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để thu được một dòng tảo thuần.
2.3.2. Môi trường nuôi tảo
Môi trường thích hợp để nuôi tảo N. Oculata là môi trường F/2 ( theo
Guillard 1975), môi trường được bổ sung các thành phần như bảng sau:
Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của môi trường F/2
STT Thành Phần Hàm lượng (g/l) 1 NaNO3 0.075 2 NaH2PO4 .H2O 0.05 3 Na2SiO3 .9H2O 0.018 4 CuSO4.5H2O 1.10-5 5 Na2EDTA.2 H2O 4.36.10-3 6 Na2MoO4 .2H2O 0.6.10-5 7 ZnSO4.7H2O 2.2.10-5 8 CoCl2. 6H2O 1.1.10-5 9 FeCl3. 6H2O 3.15.10-3 10 Thiamine HCl 0.1.10-3 11 Biotin 0.2.10-3 12 Vitamin B12 0.1.10-5
2.3.3. Phương pháp lưu giữ và bảo quản giống tảo
Giữ giống là biện pháp bảo quản kỹ thuật nhằm giữ giống gốc để chủ động trong quá trình sản xuất. Việc chọn tảo giống để giữ và nuôi sinh khối
rất quan trọng phải đảm bảo giống sạch không nhiễm tạp vì thế tất cả các thao tác kỹ thuật trong cấy và giữ giống tảo đều phải đảm bảo vô trùng.
Có hai cách để lưu giữ giống tảo: - Lưu giữ trên môi trường thạch. - Lưu giữ trên môi trường lỏng.
2.3.3.1. Lưu giữ trên môi trường thạch a) Chuẩn bị a) Chuẩn bị
- Tất cả dụng cụ phải được hấp sấy tiệt trùng trước khi sử dụng. - Chuẩn bị 15 g agar/1 lít để làm môi trường nuôi cấy.
- Môi trường F/2 đã được khử trùng (theo công thức trên).
- Sử dụng nước biển đã lọc để chuẩn bị môi trường F/2 (không có vitamin) hoặc có thể pha môi trường F/2 theo kiểu dung dịch gốc (không có
vitamin), sau đó bổ sung vào nước biển (đã khử trùng) theo tỷ lệ.
- Vitamin được bổ sung vào môi trường F/2 theo tỷ lệ sau khi khử trùng
(để nguội đến 450C). Cho môi trường vào ống nghiệm đã tiệt trùng, có nắp
đậy và để nghiêng, đợi cho môi trường nguội hoàn toàn. Các thao tác này
được tiến hành trong điều kiện vô trùng, tránh nhiễm khuẩn.
b) Pha môi trường agar
Pha môi trường agar 1.5% (pha 1.5 gam agar trong 100 ml nước), đun
hoà tan agar trên ngọn lửa Bunsen khi thấy agar tan hết đem hấp tiệt trùng ở
121 0C, 1 atm trong 20 phút, để nhiệt độ xuống còn 50 – 60 0C, cho vitamine vào lắc đều rồi đổ ra đĩa Petri (đã khử trùng) với thể tích agar bằng 1/3 thể tích đĩa Petri. Sau đó để nguội agar trong tủ cấy vô trùng. Mọi thao tác tiến
hành trong điều kiện vô trùng. Để 30 phút – 1h cho thạch đông lại.
c) Tiến hành cấy
Tảo giống được cấy trên môi trường F/2 có bổ sung agar (nồng độ agar
1,5%). Dùng que cấy hơ trên ngọn lửa đèn cồn, đợi cho que cấy nguội, lấy
nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng 1500 lux với chu kỳ chiếu sáng là 10h:14h, nhiệt độ 18oC. Sau 7 - 10 ngày, tảo mọc trên mặt thạch. Kiểm tra các quần lạc
tảo thuần khiết, chọn ống nghiệm hoặc đĩa thạch nào có khuẩn lạc tảo lên đẹp
sau để lưu giữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 – 5oC, hạn chế ánh sáng [9].
2.3.3.2. Lưu giữ giống trên môi trường lỏng a) Môi trường nuôi a) Môi trường nuôi
+ Nước biển đã khử trùng
+ Môi trường dinh dưỡng F/2
b) Phương pháp cấy tảo từ môi trường thạch sang môi trường lỏng
Chọn trên đĩa thạch có tảo phát triển tốt dùng que cấy tròn lấy tảo giống từ đĩa thạch (chọn đường cấy có tảo phát triển tốt nhất) và cho vào ống nghiệm đựng 10 ml nước biển có chứa môi trường dinh dưỡng, lắc đều bằng máy lắc, đậy kín nắp ống nghiệm và gián kín bằng giấy parapin.
c) Phương pháp lưu giữ giống
Dịch tảo thuần được thu nuôi ở cuối pha logarit khi sức sống và chất lượng
của tảo đạt tốt nhất được lấy làm nguồn giống lưu giữ, mật độ ban đầu 8x105 -
1x106 tb/ml. Tảo được nuôi giữ trong điều kiện ánh sáng yếu có cường độ 750 -
1000 lux, nhiệt độ 15 - 20oC. Định kỳ 1 tuần chuyển giống 1 lần [5].
2.3.4 Xác định các điều kiện tối ưu để nuôi cấy tảo N.Oculata
2.3.4.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến
Để xây dựng quy trình nuôi sinh khối N. Oculata cần dựa trên kết quả thu được từ những nghiên cứu về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường (nhiệt độ, cường độ chiếu sáng, độ mặn, ánh sáng) lên sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata. Từ đó xây dựng quy trình nuôi phù hợp cho N. Oculata trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Hình 2.1 Quy trình nuôi cấy dự kiến.
Thuyết minh quy trình nuôi:
Tảo giống được chuyển từ môi trường thạch sang môi trường lỏng trong các bình tam giác 250mL. Nuôi và nhân sinh khối vi tảo với mật độ tế
bào từ 105 đến 106 tế bào/ml. Giống tảo phải phát triển đồng nhất, không nhiễm tạp, không tàn lụi. Sau đó tiến hành nhân giống theo: nhân giống cấp 1, nhân giống cấp 2 và nhân giống trung gian . Các điều kiện chung trong
nhân giống cấp 1, 2 và trung gian: môi trường dinh dưỡng F/2, thể tích tảo
giống bằng 1/5 thể tích dung dịch (dung dịch bao gồm nước biển và môi
trường dinh dưỡng F/2), độ mặn 25‰, nhiệt độ 25oC, chu kỳ chiếu sáng là 12h:24h.
- -Nhân giống cấp 1: tảo giống nuôi ở thể tích 50 - 100ml được cấy chuyển sang bình tam giác 250 - 500ml. Giống tảo được nuôi trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, cường độ chiếu sáng 1500 - 2000 Lux, thời gian chiếu
sáng 12/24 và được lắc đều 2 lần/ ngày. Sau 7 - 8 ngày nuôi, tiến hành nhân giống cấp 2.
- Nhân giống cấp 2: Tảo giống nuôi ở thể tích 250 - 500 ml được cấy chuyển sang bình nhựa ở thể tích 750 - 1000 ml. Giống được nuôi trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux, và được sục khí với tốc độ nhẹ. Sau 7 - 8 ngày nuôi, tiến hành nhân giống trung gian.
- Nhân giống trung gian: Tảo giống nuôi ở thể tích 750 - 1000ml được cấy chuyển sang bình nhựa với dung tích là 3,75 - 5L. Sục khí với tốc độ vừa phải 24/24h. Giống được nuôi trong điều kiện ánh sáng nhân tạo, cường độ chiếu
Tảo giống Nhân giống Xác định các điều
như ( nhiệt độ,cường độ ánh sáng, độ mặn, chu kỳ chiếu sáng). Xác định mật độ tảo sau 10 ngày Lựa chọn thông số thích hợp
sáng 2500 - 3500 lux, thời gian chiếu sáng 12/24. Sau 7 ngày, giống được chuyển sang nuôi sinh khối. Sử dụng nguồn giống này để thực hiện các thí nghiệm.
- Nhân sinh khối trong phòng thí nghiệm: Tảo giống từ giai đoạn trung gian sẽ chuyển sang nuôi ở thể tích 10L. Mật độ giống ban đầu: 3.5 – 4.0x 106 tb/ml. Giống được nuôi trong điều kiện khác nhau để tìm ra các điều kiện tối
ưu cho tảo phát triển. Sau 10 ngày thì lấy mẫu tảo và tiến hành đếm để xác
định mật độ tảo cực đại đạt được .Từ đó lựa chọn được các thống số nhiệt độ,
độ mặn, ánh sáng, cường độ chiếu sáng thích hợp để cho tảo N.Oculata phát triển tốt nhất.
2.3.4.2. Phương pháp xác định mật độ tảo
a. Phương pháp tiến hành
Mẫu tảo được đựng trong ống falcon có thế tích 15ml và được cố định bằng formol 10%. Chu kỳ lấy mẫu: 24h/lần.
Chuẩn bị các ống ependof. Hút ra 450 µl và cho vào 50 µl formaldehit. Khuấy đều trong 5 - 10 phút để cố định.
Xác định mật độ tế bào: Xác định mật độ tế bào bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer (Đức), dùng vật kính 40 để quan sát.
Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào. Đậy lamelle lên 2 khu vực có kẻ ô đếm. Đưa buồng đếm lên kính hiển vi, lắc mẫu cho đều dùng pipet nhỏ mẫu cần xác định vào khe buồng đếm chỗ lá kính đậy lên, dung dịch theo mao dẫn lan khắp ô đếm. Để
yên buồng đếm trong khoảng 5 phút để tế bào tảo lắng xuống. Đếm tế bào tảo
ở 5 ô trung bình của khu vực đếm hồng cầu (4 ô ở bốn góc và 1 ô giữa). trong mỗi ô trung bình đếm cả 16 ô nhỏ. Trong mỗi ô nhỏ, đếm tất cả những hồng cầu nằm gọn trong ô và những hồng cầu nằm ở cạnh trên và cạnh trái.
+ Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu: Buồng đếm hồng cầu là một miếng kính dày hình chữ nhật, mặt trên có 2 khu vực có kẻ ô đếm dưới kính hiển vi , buồng đếm được chia thành 9 ô vuông lớn, mỗi ô có diện tích 1mm2. Ô chính giữa được sử dụng để đếm được chia thành 25 ô trung bình, mỗi ô trung bình
- Mỗi buồng đếm có các Block: A, B, C, D, và E.
- Mỗi Block: A, B, C, D được chia làm 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vuông có diện tích 1 mm2, sâu 0.1 mm nên thể tích của mỗi ô sẽ là 0.1 mm3
Nếu đếm tảo trong mỗi 4 ô này là thì mật độ tảo là: d(tb/ml)= x 104 (tb/ml)
- Riêng Block E được chia làm 25 ô vuông nhỏ, mỗi ô có thể tích là 1/25 x 0.1 mm3 (0.004 mm3 = 0.000004 ml = 4 x 10-6 ml), mỗi ô vuông nhỏ lại
được chia làm 16 ô vuông nhỏ hơn.
Nếu đếm tảo trong mỗi ô nhỏ (trong 25 ô vuông) là thì mật độ tảo là: d(tb/ml) = /V=X/4 x 106 (tb/ml)
Trong đó:
d: mật độ tế bào (tb/ml).
: số tế bào trung bình của 1 ô (bằng tổng số tế bào đếm được/số ô đếm). V: thể tích của ô đếm.
b. Phương pháp theo dõi tốc độ phát triển của tảo
+ Hàng ngày đếm mật độ tảo.
+ Dùng buồng đếm hồng cầu để đếm số lượng tế bào tảo trực tiếp dưới kính hiển vi nhằm xác định được thời gian phát triển của các pha.
+ Tổng kết số liệu và vẽ đồ thị tăng trưởng của các tảo N. Oculata.
2.3.4.3 Xác định nhiệt độ tối ưu
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ tế bào vi tảo: 3,5 - 4,0 x106 tb/ml; + Cường độ ánh sáng: 3500 lux;
+ pH: 7.5-8.5
+ Độ mặn : 25‰.
+ Thời gian chiếu sáng: 12:24 (giờ). + Sục khí liên tục.
+ Sử dụng môi trường f/2: tỷ lệ 1ml/1L nước biển. + Thể tích nuôi: 10L.
Hình 2.2. Sơ đồ xác định sựảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata
2.3.4.4 Xác định cường độ ánh sáng tối ưu.
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ tế bào vi tảo: 3,5 - 4,0 x106 tb/ml;
+ Nhiệt độ: 250C; + pH: 7.5-8.5
+ Độ mặn: 25‰.
+ Thời gian chiếu sáng: 12:24 (giờ). + Sục khí liên tục
+ Sử dụng môi trường f/2: tỷ lệ 1ml/1L nước biển. + Thể tích nuôi: 10L. Tảo giống Nhân giống Xác định mật độ tảo Lựa chọn được nhiệt độ thích hợp Nhiệt độ 25ºC Nhiệt độ 28ºC Nhiệt độ 22ºC Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3
Hình 2.3. Sơ đồ xác định sựảnh hưởng của cường độ chiếu sáng đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata.
2.3.4.5 Xác định độ mặn tối ưu.
Điều kiện thí nghiệm :
+ Mật độ tế bào vi tảo: 3,5 - 4,0 x106 tb/ml. + Nhiệt độ: 250C.
+ pH: 7.5-8.5
+ Cường độ chiếu sáng: 4000 Lux. + Sục khí liên tục.
+ Thời gian chiếu sáng: 12:24 (giờ).
+ Sử dụng môi trường f/2: tỷ lệ 1ml/1L nước biển. + Thể tích nuôi: 10L. Tảo giống Nhân giống Xác định mật độ tảo sau 10 ngày Lựa chọn được cường độ ánh sáng thích hợp 3000 lux 4000 lux 2000 lux Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3 Lần lặp 1 Lần lặp 1 Lần lặp 2 Lần lặp 3
Hình 2.4. Sơ đồ xác định sựảnh hưởng của độ mặn đến sự sinh trưởng và phát triển của tảo N. Oculata
2.3.4.6 Xác định chu kỳ chiếu sáng tối ưu.
Điều kiện thí nghiệm:
+ Mật độ ban đầu: 3,5 - 4x106 tb/ml.