phân lập acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất (achyranthes bidentata blume) và tinh chế làm chất chuẩn

Do đó, để kiểm tra cũng như giám sát chất lượng của các thành phẩm này, chúng tôi đã nghiên cứu chiết xuất acid oleanolic trong rễ cây ngưu tất dùng làm chất chuẩn phục vụ cho công tác k

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HỒ THỊ THU HƯƠNG

PHÂN LẬP ACID OLEANOLIC TỪ RỄ CÂY NGƯU TẤT

(Achyranthes Bidentata Blume) VÀ TINH CHẾ LÀM CHẤT CHUẨN

Chuyên ngành: Hóa Phân Tích

Mã số chuyên ngành: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN MAI

Tp Hồ Chí Minh, Năm 2012

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Ths Dược sĩ Phạm Thị Hồng Nhung, trưởng phòng khoa Kiểm nghiệm Mỹ Phẩm, cảm ơn chị đã giúp tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Và tôi xin chân thành cảm ơn các chị, các bạn đồng nghiệp viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh, và các bạn trong khoa Hóa đã nhiệt tình ủng hộ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

MS: Mass Spectroscopy

IR: Infrared Spectroscopy

NMR: Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

DEPT: Distortionless Enhancement By Polarization Transfer HMBC: Heteronuclear Multiple – Bond Correlation Spectroscopy HSQC: Heteronuclear Single – Quantum Correlation Spectroscopy COSY: Correlation Spectroscopy

TLC: Thin Layer Chromatography

HPLC: High Performance of Liquid Chromatography

UFLC: Ultra Fast of Liquid Chromatography

DMSO: Dimethyl Sulfoxid

C: chuẩn đối chiếu

NL: chuẩn nguyên liệu thu được

T: mẫu thử

DĐVN: dược điển Việt Nam

Danh mục các bảng

Bảng 1 Hàm lượng Oleanolic acid (OA) trong từng bộ phận khác nhau của cây

ngưu tất thay đổi theo thời gian

Bảng 2 Hiệu suất chiết acid oleanolic từ cao và dược liệu rễ cây ngưu tất

Bảng 3 Dữ liệu phổ của hợp chất 5 và acid oleanolic trong dung môi

Bảng 6 Kết quả thẩm định tính tương thích hệ thống của phương pháp với 6 lần

tiếm chuẩn đối chiếu và 6 lần tiêm chuẩn nguyên liệu

Bảng 7 Kết quả độ lặp của phương pháp với 6 mẫu thử tính toán dựa trên

phương trình tuyến tính của dung dịch chuẩn đối chiếu

Bảng 8 Kết quả độ lặp của phương pháp với 6 mẫu thử tính toán dựa trên

phương trình tuyến tính của dung dịch chuẩn nguyên liệu

Bảng 9 Kết quả độ đúng của phương pháp với dung dịch thêm vào là chuẩn đối

chiếu

Bảng 10 Kết quả độ đúng của phương pháp với dung dịch thêm vào là chuẩn

nguyên liệu

Bảng 11 Kết quả xác định hàm lượng acid oleanolic trong thuốc thử dựa trên

phương trình hồi quy của chất đối chiếu

Bảng 12 Kết quả xác định hàm lượng acid oleanolic trong thuốc thử dựa trên

phương trình hồi quy của chất chuẩn nguyên liệu

MỤC LỤC

Trang Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Mở đầu 1

Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Mô tả thực vật về cây ngưu tất 3

1.1.1 Phân loại và mô tả hình thái 3

1.1.2 Nơi sống và thu hái 4

1.1.3 Bộ phận dùng 4

1.1.4 Thành phần hóa học 5

1.1.5 Công dụng và tính vị 6

1.2 Sơ lược về saponin 9

1.3 Phản ứng thủy phân saponin 11

1.4 Acid oleanolic 12

1.5 Tình hình nghiên cứu 13

Chương 2-NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị 19

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Chuẩn bị mẫu dược liệu 20

2.3.2 Tối ưu quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất …21

2.3.3 Tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu được song song với chuẩn đối chiếu 23

2.3.4 Xây dựng qui trình phân tích và áp dụng xác định acid oleanolic trong mẫu thử bằng chuẩn oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn đối chiếu bằng phương pháp UV-VIS và HPLC 24

Chương 3-KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết quả chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất 26

3.2 Kết quả tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu được song song với chuẩn đối chiếu 30 3.3 Xây dựng phương pháp và thẩm định qui trình xác định acid oleanolic bằng phương pháp HPLC/PDA 39 3.4 Định lượng mẫu thử bằng phương pháp HPLC, với chuẩn nguyên liệu song song với chuẩn đối chiếu 45 Chương 4-KẾT LUẬN 50 Tài liệu tham khảo 51 Phụ lục

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1 Cây và bộ phận rễ của ngưu tất

Hình 2 Hình vi phẫu rễ cây ngưu tất

Hình 3 Sơ đồ chung về quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất

Hình 4 Kết quả khảo sát dung môi chiết

Hình 5 Kết quả khảo sát acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần

Hình 6 Kết quả khảo sát nồng độ acid

Hình 7 Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân

Hình 8: Kết quả khảo sát thời gian thủy phân

Hình 9 Kết quả kiểm tra các phân đoạn thu được

Hình 10 Quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất

Hình 11 Kết quả chấm sắc kí của NL1 với chuẩn acid oleanolic

Hình 12 Cấu trúc của hợp chất NL1

Hình 13 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (đường kẻ đậm) của hợp

chất NL1

MỞ ĐẦU

Việc sử dụng cây cỏ làm thuốc đã có từ rất lâu đời…, cây cỏ vừa gần gũi, thân thiện và dễ sử dụng, nên rất được người dân ưa dùng Có những loại thảo dược được xem là những cống phẩm quý hiếm như linh chi, nhân sâm ngàn năm…

Có rất nhiều vị danh y nổi tiếng như Hoa Đà ở Trung Hoa, Hải Thượng Lãn Ông ở Việt Nam thời phong kiến,… , họ đã nghiên cứu, và tìm ra những phương pháp chữa bệnh bằng những loài cây cỏ dại sống xung quanh chúng ta

Cho đến ngày nay, tiếp nối những gì người xưa để lại, khoa học nghiên cứu những thảo dược ngày càng mở rộng, kho thảo dược ngày càng đa dạng và phong phú

Khoa học hiện đại không chỉ quan tâm các tính năng dược lí, mà còn nghiên cứu chuyên sâu các thành phần hợp chất có trong từng bộ phận của cây, phân lập các hợp chất, mang lại nhiều giá trị to lớn

Nói đến ngưu tất, ít người biết cây dược liệu này có tác dụng hạ cholesterol máu và hạ huyết áp, một trong những căn bệnh phổ biến, xuất hiện

ở nhiều lứa tuổi, và là căn bệnh khó chữa hiện nay Loài cây này được du nhập

từ Trung Quốc, và hiện nay đã trồng thành công ở nước ta [1,3]

Acid oleanolic là sản phẩm thủy phân từ saponin có trong phần lớn thực vật như cây cỏ xước, hạt gấc, hoa tỳ bà,… và trong cây ngưu tất, đặc biệt có nhiều trong phần rễ của cây ngưu tất Nó có tác dụng bảo vệ tế bào gan, chống oxi hóa, chống tác nhân gây khối u.[4,5]

Trên thị trường đã đưa ra nhiều chế phẩm mà thành phần có saponin của

rễ cây ngưu tất, trong đó có chế phẩm dùng để làm thuốc hạ cholesterol máu cao

Điều đó thật đáng mừng, tuy nhiên, thuốc chữa bệnh phải ở hàm lượng cho phép, nếu hàm lượng quá cao sẽ ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe của người sử dụng

Do đó, để kiểm tra cũng như giám sát chất lượng của các thành phẩm này, chúng tôi đã nghiên cứu chiết xuất acid oleanolic trong rễ cây ngưu tất dùng làm chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm

Vì vậy, cần tìm ra phương pháp chiết đơn giản để có thể phân lập được acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất, và sử dụng như chất chuẩn để đánh giá những sản phẩm bán thành phẩm Nên tên đề tài của chúng tôi là “Phân lập acid

oleanolic từ rễ cây ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume) và tinh chế làm

chất chuẩn”

Với hai mục tiêu chính:

1 Phân lập chất acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất, và tinh chế, đánh giá chuẩn, để:

- Phục vụ nguồn chất chuẩn trong phân tích kiểm nghiệm

- Bổ sung nguồn thư viện tài liệu về ngưu tất

2 Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích xác định acid oleanolic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1 Mô tả thực vật về cây ngưu tất [1,2,3]

1.1.1 Phân loại và mô tả hình thái

Ngưu tất - Achyranthes bidentata Blume, thuộc họ Rau dền - Amaranthaceae

Mô tả: Cây thảo, sống nhiều năm, cao 60 – 80 cm hoặc hơn Rễ hình

trụ dài, có nhiều rễ phụ to Thân mảnh, có cạnh, phình lên ở những đốt, màu lục hoặc nâu tía Cành thường mọc hướng lên gần như thẳng đứng Lá mọc đối, hình bầu dục hoặc hình mác, dài 5-10 cm, rộng 1-4 cm, gốc thuôn hẹp, đầu rất nhọn, hai mặt nhẵn, mép nguyên đôi khi uốn lượn, gân lá mặt trên thường có màu nâu tía Cuống lá dài 1-1,5 cm Cụm hoa mọc ở nhọn thân và

kẽ lá đầu cành thành bông, dài 2-5 cm Hoa thường gập xuống, sát vào cuống của cụm hoa Lá bắc dài 3mm Lá dài 5 mm, gần bằng nhau Nhị, chỉ nhị dính với nhau vào dính cả với nhị lép Nhị lép có răng rất nhỏ, bao phấn hình mắt chim Bầu hình trứng Quả hình bầu dục, có một hạt Cây cho hoa vào khoảng

từ tháng 5-9 và cho quả tháng 10-11

Hình 1 Cây và bộ phận rễ của ngưu tất

1.1.2 Nơi sống và thu hái

Cây ngưu tất hiện nay được trồng thành công ở nước ta, dược liệu

đủ dùng trong cả nước và xuất khẩu

Ngưu tất là một vị thuốc được dùng khá phổ biến trong Y học cổ truyền với nhu cầu ngày càng tăng, được nhập trồng vào nước ta từ những năm 1960 Hiện nay đã thích hợp với điều kiện nước ta và phát triển tốt, được trồng ở nhiều nơi nhất là đồng bằng Bắc bộ như: xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên; thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên; xã Ninh Hiệp, huyện Gia Lâm; Trung tâm nghiên cứu cây trồng

và chế biến thuốc Hà Nội và một số nơi khác

Cây trồng được cả ở trên núi cao lẫn đồng bằng Thu hái vào mùa đông xuân, phơi tái rồi ủ đến khi nhăn da (6-7 ngày), xông diêm sinh, sấy khô Dùng sống hoặc sao tẩm rượu

Trong các bộ phận của cây ngưu tất, thì rễ ngưu tất có tác dụng y học lớn, và ngày nay, các sản phẩm bắt nguồn từ rễ ngưu tất khá nhiều Do

đó, những nghiên cứu về rễ ngưu tất rất cần thiết Ngoài ra, trong rễ ngưu tất có các hoạt chất có chức năng trị bệnh

1.1.3 Bộ phận dùng

Bộ phận dùng: Rễ - Radix Achyranthis Bidentatae

Rễ hình trụ tương đối thẳng, dài 20-30 cm, đường kính 0,5-1 cm Ðầu trên mang vết tích của cổ rễ, đầu dưới hơi thuôn nhỏ Mặt ngoài màu vàng đất hay nâu nhạt, có nhiều nếp nhăn dọc nhỏ và vết tích của rễ con

Vi học

 Ðặc điểm vi phẫu

Mặt cắt rễ gần tròn Từ ngoài vào trong có: Lớp bần gồm các tế bào nhỏ, dẹt, xếp thành dãy đồng tâm và xuyên tâm, phần ngoài có nhiều chỗ bị bong ra Mô mềm vỏ cấu tạo từ những tế bào đa giác thành mỏng xếp lộn xộn Libe-gỗ xếp thành từng bó, mỗi bó có libe phía ngoài, mạch gỗ ở phía trong Các bó libe-gỗ xếp rải rác thành bốn vòng đồng tâm, ở tâm các bó libe-gỗ có hình tam giác xếp sát nhau tạo thành những hình quạt

 Ðặc điểm bột dược liệu

Bột màu nâu nhạt, mùi hơi hắc, vị ngọt sau đắng Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh bần, mảnh mô mềm thành mỏng, nhiều mảnh mạch điểm, tinh thể calci oxalat hình cầu gai kích thước 0,03-0,04mm và những mảnh vỡ hình khối của các tinh thể này

1.1.4 Thành phần hóa học [2]

Rễ chứa saponin triterpen, khi thủy phân cho ra genin là acid oleanolic, các sterol ecdysteron, inokosteron Với acid oleanolic chiếm 0,096%, saponin toàn phần 4,04% và acid oleanolic α -L-rhamnopyranosyl- β -D- galactopyranosid Rễ còn chứa ecdysteron

và inokosteron Hàm lượng ecdysteron khoảng 0,037%

Rễ ngưu tất chứa một saccharid là fructan mạch ngắn với mức độ trùng hợp trung bình là 8 Chất saccharid này có tác dụng cải thiện hệ miễn dịch

Rễ còn có một peptidpolysaccharid trong đó 24,1% là peptid bao gồm glycin, serin, acid glutamic và acid aspartic Chất peptidpolysaccharid này có tác dụng miễn dịch

Betain có trong rễ với hàm lượng 0,93-1,029% đã được chứng minh là

ổn định trong quá trình chế biến Rễ khô còn có emodin và physcion

Theo một nghiên cứu sự phân bố Saponin Triterpenoid trên các bộ phận của cây ngưu tất của Jinting Li và Zhenghai Hu, “ Accumulation and Dynamic Trends of Triterpenoid Saponin in Vegetative Organs of Achyranthus bidentata”, thì hàm lượng acid oleanolic có trong các bộ phận nghiên cứu trên cùng một cây có sự khác nhau như sau:

Bảng 1 Hàm lượng Oleanolic acid (OA) trong từng bộ phận khác nhau của

cây ngưu tất thay đổi theo thời gian [8]

Thời gian thu hoạch mẫu Hàm lượng của OA (%)

- Gây thu teo tuyến ức chuột cống đực non Tác dụng gây thu teo tuyến ức

là một trong những đặc tính của thuốc ức chế miễn dịch Rễ ngưu tất có tác dụng mạnh hơn khoảng 8 lần so với rễ cỏ xước Có mối tương quan song song giữa tác dụng kháng viêm và tác dụng gây thu teo tuyến ức của rễ Ngưu tất

- Rễ Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu ở thỏ đã gây tăng cholesterol từ ngoài vào và gây ức chế sự tổng hợp cholesterol trong cơ thể thỏ; gây hạ huyết áp rõ rệt trên mèo, mức độ hạ áp từ từ, thời gian tác dụng kéo dài Có độc tính thấp

- Chế phẩm Solamin trong thành phần có ngưu tất và một số dược liệu khác

đã được áp dụng để điều trị thấp khớp với kết quả là có tác dụng chống viêm

và giảm đau rõ rệt trên lâm sàng Kết quả tốt nhất và tương đối nhanh đối với đau lưng cấp do lạnh và sang chấn Ðối với viêm đa khớp dạng thấp, chưa có biến dạng về khớp và đối với chứng đau nhức đơn thuần, tác dụng điều trị tương đối tốt Khi đã có biến dạng về xương, cơ, khớp, kết quả kém Thuốc không gây tác dụng phụ đáng kể

Công dụng

Ngưu tất dạng sống chữa cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đi tiểu rát buốt, tiểu ra máu hoặc sỏi, bế kinh, bụng dưới kết hòn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau thai không ra, sau khi đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầu gối nhức mỏi

Ngưu tất sao tẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, tay chân

co quắp hoặc bại liệt

Ngày dùng 6-12 g dạng thuốc sắc hoặc bột

- Kiêng kị: phụ nữ có thai, băng huyết không nên dùng ngưu tất Trong y học Trung Quốc, rễ ngưu tất với liều 5-12 g dưới dạng nước sắc được sử dụng làm thuốc phục hồi sức lực, lợi tiểu, chữa bế kinh, đau kinh, tăng huyết áp, thấp khớp, sỏi đường tiết niệu, viêm họng, viêm amidan Ngoài ra, nó còn được dùng làm thuốc kích thích tình dục, tráng dương, chữa liệt dương, gây sảy thai Dùng ngoài, nước sắc 20% ngưu tất chữa các bệnh về da chân và các móng (bệnh nấm biểu bì) Hạt được dùng làm thuốc chống độc, chữa thấp khớp, hen phế quản (phối hợp với một số dược liệu khác) Phụ nữ có thai không được dùng

Theo Đông y, ngưu tất có vị chua, hơi đắng, tính bình không độc, vào 2 kinh can và thận, có tác dụng làm tan máu ứ, bớt sưng tấy, đau nhức, chống

co rút, rung giật, làm mạnh gân cốt

Sau đây là bốn bài thuốc của cố Lương y Lê Trần Đức đã được thử nghiệm, có hiệu quả tốt

1 Ngưu tất dùng độc vị ngày 40 – 60g sắc uống nhiều lần chống co giật, bại liệt, phong thấp teo cơ, xơ vữa mạch máu

2 Rượu thuốc: Ngưu tất 100g, huyết giác 50g, sâm đại hành 30g Ngâm trong rượu 30 – 400 ml Từ 10 ngày trở lên, mỗi ngày uống 1 – 2 lần, mỗi lần 1 chén (10 – 15ml) Chữa các chứng bị thương máu tụ ở ngoài, hoặc bị ngã máu ứ ở trong hoặc đi xa về chân tay nhức mỏi

3 Thang an thần: Ngưu tất 30g, hạt muồng sao 20g Sắc uống mỗi ngày

1 thang, chữa các chứng bốc nóng, nhức đầu, chóng mặt, đau mắt, ù tai, tăng huyết áp cao, rối loạn tiền đình, khó ngủ, đau nhức dây thần kinh, rút gân, co giật, táo bón

4 Thang tiết niệu: Ngưu tất 30g, rễ cỏ tranh, mã đề, mộc thông, huyết

dụ, lá móng tay, huyết sâm đều 15g sắc uống

Chữa các chứng viêm cầu thận cấp, phù thũng, đái đỏ, đái són, viêm gan

vi rút, đái vàng thẫm, da vàng, viêm bàng quang, đái ra máu

Rễ ngưu tất đã được GS Đoàn Thị Nhu và cộng sự chứng minh có tác dụng hạ cholesterol máu và có tác dụng hạ huyết áp Viện Dược liệu (Bộ Y

tế Việt Nam) đã sản xuất cao toàn phần bào chế dưới dạng viên được đem thử tại Viện Bảo vệ sức khỏe người cao tuổi do GS Phạm Khuê và các cộng sự thực hiện và đã đi đến kết luận sau:

- Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu trên 65% số bệnh nhân có cholesterol máu cao được điều trị

- Ngưu tất có tác dụng làm giảm tỉ lệ β/α lipoprotein máu ở 82% số bệnh nhân có tỉ lệ β/α lipoprotein máu cao điều trị

- So sánh với Clofibrat (một loại thuốc hóa học được dùng phổ biến điều trị các bệnh nhân trên) thì tác dụng hạ cholesterol máu cao hơi yếu hơn, còn tác dụng hạ tỉ lệ β/α lipoprotein thì gần tương đương

Phạm Kim Mãn (luận án phó tiến sĩ 1992) đã nghiên cứu đưa ra chế phẩm “Bidentin” mà thành phần có saponin của rễ ngưu tất cộng với chất phụ gia để làm thuốc hạ cholesterol Thuốc đã được thử lâm sàng có kết quả tốt, thuốc ổn định và không gây tác dụng phụ

Gần đây, một nam dược mới được nghiên cứu là có tác dụng điều hòa huyết áp, với ba dược liệu gồm ngưu tất, sơn tra, nhân trần, với tên gọi an mạch ích nhân, đang được bán rộng rãi trong khắp cả nước

Tính vị: Ngưu tất có vị đắng, chua mặn, tính bình; có tác dụng bổ can thận,

mạnh gân cốt, phá ứ huyết, tiêu ung độc

Ngưu tất đã được chính thức đưa vào Dược điển II Việt Nam tập 3 năm 1994

Khi nghiên cứu về rễ cây ngưu tất, người ta nghiên cứu thành phần hóa học có trong rễ Trong rễ ngưu tất có chứa saponin triterpenoid

1.2 Sơ lƣợc về saponin [2]

Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao Saponin có một số tính chất đặc biệt:

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

- Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b-hydroxysteroid khác

Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin.Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol

Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt

Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do

đó người ta dùng 3 dung môi này để tủa saponin Saponin có thể bị tủa bởi chì acetat, bari hydroxyd, ammoni sulfat

Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin

Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin steroid Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm

chất của 3-b-hydroxy olean 12- ene, tức là b-amyrin Một vài aglycon làm ví dụ (công thức A):

o Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = -CH3, R3 = -COOH

o Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = -CH 2 OH , R3 = COOH

-o Gyps-ogenin: R2 = R4 = R5 = -CH3 , R1 = CHO , R3 = COOH

-Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đường nối vào C-28 theo dây nối ester Gần đây người ta phân lập được các saponin có đến 10-11 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vị đường

b - Nhóm ursan (II): Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean chỉ khác là nhóm methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị trí C-19

c - Nhóm lupan (III): Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thường có nối đôi ở vị trí 20-29

d - Nhóm hopan (IV): Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,D giống như các nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17

Saponin triterpenoid tetracyclic: có 3 nhóm chính là Dammaran,

Lanostan và Cucurbitan

a - Nhóm dammaran(V): Ðại diện là các saponin của nhân sâm Phần aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran Hai genin chính là:protopanaxadiol và protopanaxatriol

Phần đường nối vào OH ở carbon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh

Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran còn gặp trong

hạt táo (Ziziphus jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.)

Wettst

b - Nhóm lanostan (VI): Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải sâm - Holothuria spp là một ví dụ của nhóm này

c/ Nhóm cucurbitan (VII) Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp

trong họ Cucurbitaceae Ở đây nhóm CH3 góc thay vì ở vị trí C10 lại đính ở C9

Saponin steroid:

Nhóm spirostan: sarsasapogenin, smilagenin, tigogenin Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid Hai sapogenin quan trọng nhất

là diosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave)

Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi

Nhóm aminofurostan: Ở đây vòng F mở như trường hợp sarsaparillosid nói ở trên nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2

Nhóm spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F được thay bằng NH

Nhóm solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này Những chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều có chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những chất glycoalcaloid

Ngoài những nhóm saponin steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin steroid có cấu trúc mạch nhánh khác

Saponin là một glycosid Sự thủy phân các glycosid để cho ra phần đường và phần aglycon dễ hay khó tùy thuộc vào nối glycosid (C-glycosid hay O-glycosid), loại đường (-uronic hay ose), kiểu mạch đường (biose nối 1-2 hay biose nối 1-6) hay vị trí gắn đường với khung

Các tác nhân thủy phân thường là kiềm, acid hoặc enzym

Trong việc nghiên cứu saponin, nhất là đối với những hợp chất mới, người ta hay chiết xuất sapogenin Vì saponin thường khó phân lập, khó kết tinh, và việc phân tích cấu trúc phần đường cũng khó Hơn nữa, quá trình phân tích cấu trúc saponin cũng cần phải tách sapogenin để xác định Vậy, muốn có sapogenin toàn phần, người ta phải thủy phân saponin toàn

phần, loại bỏ phần ose bằng phương pháp thích hợp sau đó phân lập các sapogenin riêng biệt từ hỗn hợp sapogenin toàn phần bằng các phương pháp như sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng điều chế Tùy theo độ bền của liên kết glycosid mà sự thủy phân có thể thay đổi tác nhân :

- Thủy phân bằng acid: nếu phần aglycon bền vững với tác nhân thủy phân, dùng tác nhân thủy phân mạnh như: HCl 5% - HCl 18% trong 5 giờ đến 6 giờ ở 100 oC, hoặc H2SO4 10%, 25% đun trong cồn, HClO4 70% trong methanol với tỷ lệ 1:10, hỗn hợp Kiliani gồm (HCl đậm đặc: acetic: nước) (10: 35:55) ở 100oC trong 1 giờ, [2]

- Thủy phân bằng enzym: nếu phần aglycon dễ bị biến đổi trong quá trình thủy phân, dùng tác nhân thủy phân nhẹ nhàng như phương pháp Shibata dùng acid acetic 50% đun ở 70 o

C trong 6 giờ, hoặc dùng enzym (ß-glucosidase, glucuronidase) trong môi trường acid acetic hoặc môi trường đệm phosphat

Sản phẩm của phản ứng thủy phân, chiết tách lỏng-lỏng với dung môi methylen chloric để thu được acid oleanolic

1.4 Acid oleanolic

Acid oleanolic là một aglycon phổ biến trong các loại thực vật, thuộc phân nhóm olean triterpen

Tác dụng dược lý:

+ Bảo vệ tế bào gan do ức chế emzym gan Cyp P450 [9]

+ Tác dụng chống tác nhân gây khối u: acid ursolic và acid oleanolic

ức chế TPA một chất hoạt hóa thể EBV tại tế bào Raij [15]

+ Tác dụng chống một số tác nhân gây độc cho gan và được dùng trong điều trị viêm gan ở Trung Quốc: thử nghiệm trên chuột nhắt với acid oleanolic chống lại tác nhân gây độc là Cadmium bằng cách kích thích sản xuất metallothionein [11], và giảm tác dụng độc của acetaminophen bằng cách tăng hoạt tính alanin aminotrsferase và sorbitol dehyrogenase [10]

+ Tác dụng chống HIV invitro trên tế bào đơn nhân ở người đã được gây nhiễm [13]

+ Tác dụng ức chế α- glucosidase của acid oleanolic và dẫn chất tổng hợp của acid oleanolic[16]

Một số dược liệu có thành phần là acid oleanolic: trái bồ kết, cây ngưu tất, cây ngưu tất nam ( cỏ xước), hạt gấc,

1.5 Tình hình nghiên cứu về acid oleanolic

Trong Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận Dược liệu, trang 847 giới thiệu sơ lược về cây ngưu tất, chiết xuất acid oleanolic và định tính bằng sắc ký lớp mỏng trong dược liệu Quy trình chiết xuất oleanolic như sau:

2g ngưu tất chiết với ethanol 96 %, lấy dịch lọc đem thủy phân bằng acid HCl 10 %, cách thủy 80 oC, thêm một ít nước pha loãng dịch chiết rồi chiết với chloroform, thu gom phần dịch chiết cloroform cho bay hơi tới cắn Hòa tan cắn trong ethanol 96o, định tính bằng sắc kí lớp mỏng [2]

Trong một báo cáo luận văn dược sĩ đại học, đề tài nghiên cứu và đánh giá cao ngưu tất, chúng tôi tham khảo được quy trình chiết xuất và đánh giá cao ngưu tất dựa trên định lượng acid oleanolic như sau:

Rễ ngưu tất + methanol 80 %, nhiệt độ 80 oC trong 4 giờ, bay hơi dịch chiết tới cắn rồi hòa tan bằng một ít nước nóng, sau đó chiết với n-buthanol bão hòa nước Đem cô cạn dịch chiết, và thủy phân bằng acid sulfuric 20 %, dịch thủy phân đem chiết với methylen chloric Sau

đó, hòa tan cắn trong methanol và tiến hành định lượng bằng phương pháp HPLC

Luận văn dược sĩ đại học của Nguyễn Kim Ngọc Duyên, nghiên cứu phương pháp chiết xuất và sơ bộ định lượng acid oleanolic trong cao cồn

gấc Quy trình chiết xuất oleanolic và phương pháp định lượng tham khảo được từ bài viết:

Hạt gấc xay thô ngấm kiệt với xăng công nghiệp loại béo, sau đó chiết ngấm kiệt với cồn 90 % Cao cồn được đem thủy phân bằng acid sulfuric 10 %, trong 3 giờ, lấy dịch thủy phân chiết với cloroform, thu gom phần tan trong cloroform cho bay hơi tới cắn Hòa tan cắn cloroform cho chạy qua cột rồi định lương bằng phương pháp HPLC Các nghiên cứu đề cập đến phương pháp chiết cũng như định lượng acid oleanolic từ nhiều loại cây khác nhau, trong đó có bài viết chiết tách và xác định cây ngưu tất nam (cỏ xước), với quy trình chiết như sau:

Cỏ xước được chiết với methanol, thủy phân cao methanol bằng HCl 2M, trong 2 giờ, cách thủy 100 oC, sau đó chiết qua methanol.[14]

Một số công trình nghiên cứu về định lượng acid oleanolic khác như:

- Định lượng nhanh acid oleanollic trong viên nén bằng HPLC dùng cột ultrasphere-ODS, pha động methanol:nước [12]

- Định lượng đồng thời acid oleanolic và acid ilrolic bằng HPLC dùng cột Shim-pack CLC-ODS, pha động MeOH: H2O: AcOH: TEA [20]

- Định lượng acid oleanolic bằng HPLC sử dụng cột tách RP 18, pha động acetonitril: nước ( 60:40 ), bước sóng 210 nm [16]

- Định lượng acid oleanolic trong rễ ngưu tất bằng phương pháp sắc kí mao quản SFC ( sắc kí lỏng siêu tới hạn)[19]

- Định lượng acid oleanolic bằng phương pháp đo quang ở vùng 230

nm đến 350 nm với cả hai dung môi cho acid oleanolic trong acetic băng ( λ max = 256 nm) và trong ethanol (λ max = 277 nm)[18]

 Tóm lại, từ những nguồn tài liệu tham khảo dẫn ra ở mục trên, chúng tôi lựa chọn một số qui trình sau sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu:

Định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng với các điều kiện theo chuyên luận DĐVN IV [2]

- Dung môi chạy sắc ký: (chloroform: Methanol) (40:1)

Qui trình định lượng bằng phương pháp đo quang UV-VIS:

Định lượng acid oleanolic bằng phương pháp đo quang ở vùng 230

nm đến 350 nm cho cả hai dung môi là acid oleanolic trong acetic băng ( λ max = 256 nm) và trong ethanol (λ max = 277 nm) [18]

 Tuy nhiên, trong trường hợp này, chúng tôi sử dụng dung môi là methanol, áp dụng phương pháp đo quang ở vùng 190 nm đến 350 nm,

Chương 2 – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Dược liệu: bộ phận sử dụng là rễ cây ngưu tất, vì so với các bộ phận khác thì rễ ngưu tất có chứa 0.096% hàm lượng acid oleanolic, nhiều hơn so với hàm lượng acid oleanolic trong thân và lá [8]; và quá trình chiết tách acid oleanolic từ bộ phận rễ khá thuận lợi và rất sạch, còn với

bộ phận thân và lá chúng tôi phải thêm các giai đoạn loại màu xanh sinh học tự nhiên

Rễ ngưu tất có các saponin, khi thủy phân cho các sapogenin là acid oleanolic; ngoài ra còn có ecdysteron và inokosteron

Hoạt chất: oleanolic acid Công thức cấu tạo [4]

Công thức phân tử: C30H48O3, khối lượng phân tử: 456.70

Danh pháp:

(4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-hydroxy-tetradecahydropicene-4a-carboxylic acid

2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-Hay 3 beta- Hydroxyolean-12-en-28-oic acid Cảm quan: bột trắng

Tính chất: tan trong ethanol, methanol, nhiệt độ nóng chảy: 310oC

2.2 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị

Hóa chất

Chuẩn đối chiếu

Chuẩn acid oleanolic của Sigma aldrich, mã số sản phẩm 508-02-01/

05504, khối lượng phân tử 456.70, độ tinh khiết 99 %

Pha chế hóa chất

Dung dịch thuốc thử acid phosphormolybdic 5 % trong ethanol: cân khoảng 1 gam acid phosphomolybdic ( ngậm 24 phân tử nước), hòa tan trong 20 ml ethanol 96 % Lọc lấy dung dịch trong, đựng trong bình nâu kín

Trang thiết bị

- Bình sắc kí (5x15x15 cm)

- Bảng chấm sắc kí kích thước 3x11 cm, silicagel 60 F254

- Bể siêu âm Branson 8501

- Máy cô quay

- Cân phân tích GH -202, Nhật, có hai chế độ cân:

- Cân 4 số: M ± 0.1 mg

- Cân 5 số: M ± 0.01 mg

- Nồi cách thủy Memmert WNB 7-45, Đức

- Máy sắc kí lỏng shimadzu UFLC 20 AD, đầu dò PDA

- Máy đo quang phổ UV-VIS Shimadzu UV-2450

- Sắc kí cột, kích thước 2x20 cm

- Cách thức nhồi cột: ước tính lượng bột silicagel để nhồi cột tương ứng với lượng mẫu chạy cột Cho bột silicagel vào một becher có chứa sẵn dung môi cloroform, cho từ từ và dùng đũa khuấy nhẹ Cho hỗn hợp bột silicagel vào cột, gõ nhẹ để cột nhồi được chắc, cho dung môi cloroform chạy qua cột liên tục với độ phân cực tăng dần ( bằng cách cho thêm lượng methanol tăng dần đến tỷ lệ sử dụng chạy chất phân tích mà ở đây chúng tôi khảo sát là (cloroform : methanol) = (1000 : 6), ổn định cột khoảng một tiếng

2.3.1 Chuẩn bị mẫu dược liệu

Rễ cây được mua về, làm sạch và phơi khô, xác định đúng loại rễ cây cần nghiên cứu bằng cách sử dụng kĩ thuật vi phẫu

Thực nghiệm vi phẫu rễ cây ngưu tất

Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu Trong phần lớn các trường hợp, hình dạng và cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học Vì vậy, khi quan sát các mẫu ( đặc biệt là các tiêu bản cắt ngang hay dọc của các mô) người ta thường loại bỏ tế bào chất, nhuộm màu màng tế bào để việc quan sát được dễ dàng hơn

- Chọn mẫu: mang tính đại diện, có thể tươi hay mẫu khô ngâm mềm

2.3.2 Tối ưu quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất

- Chiết cao ngưu tất:

Sau khi loại béo, rễ được phơi khô, và dùng dung môi thích hợp ngâm chiết, cô thành cao Dung môi thường sử dụng như methanol, ethanol Trong trường hợp này, vì ethanol là một dung môi ôn hòa với môi trường, ít độc hại, dễ kiếm, và giá thành rẻ hơn nhiều so với methanol Mặt khác, theo các tài liệu tham khảo được,

đa số sử dụng ethanol để chiết cao Và các chế phẩm cao trên thị trường cũng đa phần là cao cồn với các tỷ lệ khác nhau Với những

lí do đó, chúng tôi không sử dụng methanol, mà thay vào đó, chúng tôi sử dụng dung môi chiết cao ngưu tất trong quá trình nghiên cứu

là ethanol với sự kết hợp ethanol và nước theo các tỷ lệ nhất định Các công trình nghiên cứu tham khảo được đều khảo sát trên ethanol 100 %, 96 %, 70 % Do đó, chúng tôi khảo sát chiết xuất cao ngưu tất trên ethanol với ba tỷ lệ này

- Thủy phân saponin trong cao ngưu tất cho ra sapogenin [4,5]

Cao ngưu tất hòa tan với một ít nước, có thể dùng cao lỏng thay thế, sau đó, dùng các tác nhân xúc tác để thực hiện phản ứng thủy phân saponin trong cao ngưu tất cho ra sapogenin, dựa trên phản ứng cắt mạch các phân tử đường Tác nhân xúc tác là các acid, trong nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu hai tác nhân acid là acid hydrocloric và acid sulfuric, hai loại acid thường dùng

Các yếu tố khảo sát trong quá trình thủy phân saponin trong cao ngưu tất cho ra sapogenin: [5]

Tác nhân acid: HCl, H2SO4

Nồng độ acid: HCl 10%, 15%, 20%

Nhiệt độ thủy phân: 80 oC, 90 oC, 100 oC

Thời gian phản ứng: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ

- Chiết sapogenin toàn phần: sản phẩm của phản ứng thủy phân

saponin là hỗn hợp các phân tử đường và sapogenin toàn phần Những dung môi hữu cơ thích hợp để ly trích sapogenin ra khỏi hỗn hợp là cloroform, methylen cloric Ở đây, chúng tôi tiến hành chiết xuất sapogenin toàn phần bằng dung môi methylen cloric, với lý do methylen cloric có giá thành rẻ hơn và ít độc hại hơn so với cloroform Sau đó cất thu hồi dung môi, thu gom lấy phần cắn

- Tách acid oleanolic trong hỗn hợp sapogenin:

Lấy cắn sapogenin cô được hòa tan trong một ít dung môi cloroform rồi cho qua sắc kí cột, sắc kí cột được nhồi từ bột silicagel 60 GF có kích thước hạt 63-200 µm để tách thu từng phân đoạn

Từ hỗn hợp dung môi chạy sắc kí bản mỏng, chúng tôi khảo sát tỷ lệ dung môi chạy sắc kí cột Tiến hành hạ dần độ phân cực của hệ dung môi chạy sắc kí bản mỏng, bằng cách giảm tỷ lệ lượng methanol, cứ mỗi lần thay đổi tỷ lệ, cho chấm sắc kí bản mỏng cho chuẩn và nguyên liệu, cho đến khi vệt chấm chuẩn và thử có Rf khoảng 0,2, chúng tôi có tỷ lệ dung môi qua cột là: (cloroform: methanol) ( 50 ml : 6 giọt)

Mẫu qua sắc kí cột được tách ra thành từng phân đoạn, các phân đoạn thu được kiểm tra sự hiện diện của acid oleanolic bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Sau đó thu gom các phân đoạn có chứa acid oleanolic, cho bay hơi dung môi

Quy trình chiết:

Hình 3 Sơ đồ chung về quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất 2.3.3 Tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu đƣợc

song song với chuẩn đối chiếu

Tinh chế acid oleanolic thu đƣợc:

Khảo sát, chọn lựa phương pháp tinh chế acid Oleanolic: sắc kí cột, bản mỏng, sắc kí điều chế, …

Những phân đoạn chứa acid oleanolic sau khi kiểm tra bằng sắc

kí lớp mỏng được gom lại, cho bay hơi dung môi, lấy cắn kiểm tra và cho chạy qua sắc kí cột nhiều lần để có độ sạch cao, có thể cho chạy qua sắc kí cột điều chế nếu chất vẫn chưa sạch Kết hợp những phương pháp kết tinh và kết tinh lại cho cắn acid oleanolic thu được để có những tinh thể tinh khiết Những tinh thể này được thu gom nhiều lần, lọc qua giấy lọc dày, và đem sấy khô với nhiệt độ thích hợp, trong quá trình nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nhiệt độ 40 oC Sau đó, tinh thể được đựng trong bình nâu kín, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 – 8 oC

Xác định cấu trúc nguyên liệu thu đƣợc:

Từ những tinh thể phân tách bằng sắc kí cột, định tính với chuẩn đối chiếu acid oleanolic bằng sắc kí lớp mỏng, và dùng những phương pháp kết tinh, kết tinh lại để có được những tinh thể tinh khiết; sau đó

gom lại và đem phân tích cấu trúc, độ tinh khiết với mục đích định danh nguyên liệu acid oleanolic phân lập được từ cây ngưu tất

Xác định cấu trúc của những tinh thể thu được bằng các phương pháp : UV, IR, MNR, để từ những kết quả khảo sát chúng tôi tiến hành xác thực những tinh thể thu được đúng là acid oleanolic

Định lượng hàm lượng acid oleanolic nguyên liệu thu được bằng phương pháp UV và HPLC, để đánh giá chất lượng của nguyên liệu so với chuẩn đối chiếu được mua từ các hãng hóa chất có tiếng như hãng Sigma

Đánh giá chất chuẩn cho acid oleanolic nguyên liệu

Acid oleanolic nguyên liệu sau khi qua phân tích kiểm tra là đúng

và tinh khiết, chúng tôi đánh giá chất chuẩn nguyên liệu acid oleanolic thực hiện dựa trên các tiêu chuẩn: cảm quan, điểm chảy, phổ UV-VIS, thời gian lưu trên sắc kí đồ HPLC, phổ IR, MNR,

Xây dựng quy trình thẩm định phương pháp xác định acid oleanolic bằng phương pháp HPLC/PDA

2.3.4 Xây dựng qui trình phân tích và áp dụng xác định acid oleanolic

trong mẫu thử bằng chuẩn oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn đối chiếu bằng phương pháp UV-VIS và HPLC

Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều sản phẩm dược có tác dụng

hạ cholesterol, hạ huyết áp cho người huyết áp cao, sản phẩm ngày càng

đa dạng và phong phú Đa số là dạng nam dược được bào chế từ cao ngưu tất

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích acid oleanolic trong viên cao ngưu tất để tiến hành xác định hàm lượng acid oleanolic có trong những mẫu nam dược này, song song với chuẩn đối chiếu mua về

Nội dung bao gồm:

- Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic

- Thẩm định phương pháp phân tích từ mẫu thử bằng chuẩn acid oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn mua về

- Áp dụng quy trình xây dựng được để xác định mẫu thử

Chương 3 – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Kết quả chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất

Tối ưu các thông số trong quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất

3.1.1 Chiết cao ngưu tất

Kết quả chiết cao với ethanol tuyệt đối, ethanol 96 % và ethanol 70 % Thực hiện: cân 3 bình khối lượng bằng nhau, tiến hành chiết tách đồng thời và cùng các điều kiện

Kết quả sắc ký bản mỏng:

A S B C

Hình 4 Kết quả khảo sát dung môi chiết

Từ trái qua phải, kết quả cho thấy ethanol 70 % cho vệt sắc kí đậm hơn rất nhiều, và số vệt sắc kí ở cả ba dạng khảo sát là bằng nhau

Rõ ràng, phần trăm nước càng nhiều, độ phân cực của dung môi chiết càng tăng, năng suất chiết cao tăng Tuy nhiên theo các tài liệu tham khảo, quy trình khảo sát ethanol ở 100 %, 96% và 70 % Ngoài ra, với hàm lượng nước lớn sẽ gây khó khăn trong việc cô cạn dung môi, và có

A: ethanol 100%

B: ethanol 96 % C: ethanol 70 % S: chuẩn

thể gây ẩm mốc rất nhanh Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ở ba dung môi trên Sắc kí đồ cho thấy, ethanol 70 % cho vệt rất đậm, và vệt khá rõ ràng Cho nên chúng tôi chọn ethanol 70 % làm dung môi chiết xuất cao ngưu tất

3.1.2 Kết quả thủy phân saponin trong cao ngưu tất cho ra sapogenin

Khảo sát môi trường acid dùng để thủy phân: acid hydrochlorid và

acid sulfuric

Hình 5 Kết quả khảo sát acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần

Trong quá trình tách chiết acid oleanolic từ dịch thủy phân, với tác nhân thực hiện phản ứng thủy phân là acid sulfuric thì sự tạo nhũ lớn gây bất lợi cho việc lôi kéo acid oleanolic ra khỏi dung dịch thủy phân

Do đó, chúng tôi chọn HCl để thủy phân sapogenin

H2: HCl 20%

H3: HCl 15%

S: chuẩn oleanolic

Kết quả cho thấy, HCl 15 % và HCl 20 % cho hàm lượng acid oleanolic nhiều tương đương nhau Và ở kết quả sắc kí của thí nghiệm sử dụng HCl 20 % đã xuất hiện thêm một vệt tạp, vì thế, để tiết kiệm acid HCl, cũng như giảm độ độc hại với môi trường, chúng tôi quyết định chọn HCl 15% trong quá trình nghiện cứu, và tiến hành tối ưu phản ứng trên thông số nhiệt độ và thời gian

Khảo sát nhiệt độ thủy phân: 80 o C, 90 o C và 100 o C trên bếp cách thủy

Hình 7 Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân

Với HCl 15 %, kết quả khảo sát ở nhiệt độ 100 oC trên bếp cách thủy cho hàm lượng acid oleanolic nhiều hơn, và đây cũng là nhiệt độ cài đặt tối đa của bếp cách thủy mà chúng tôi sử dụng nghiên cứu, do đó, chúng tôi chọn 100 o

C làm nhiệt độ thực hiện phản ứng thủy phân

Khảo sát thời gian thủy phân: 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ

S: chuẩn acid oleanolic T1: Nhiệt độ thủy phân là 80 oC T2: Nhiệt độ thủy phân là 90 oC T3: Nhiệt độ thủy phân là 100 oC

S: chuẩn oleanolic G1: phản ứng thủy phân diễn ra trong 1 giờ

G2: phản ứng thủy phân diễn ra trong 2 giờ

G3: phản ứng thủy phân diễn ra trong 3 giờ

T1 S T2 T3

G1 S G2 G3

Hình 8: Kết quả khảo sát thời gian thủy phân

Kết quả cho phép chọn thời gian 2 giờ là thích hợp nhất, vì với thời gian phản ứng 1 giờ thì cho hàm lượng acid oleanolic ít, mà với thời gian 3 giờ thì hàm lượng acid oleanolic không tăng so với 2 giờ Vậy, để tiết kiệm thời gian, chúng tôi chọn thời lượng cho phản ứng thủy phân là 2 giờ

3.1.3 Kết quả chiết sapogenin toàn phần từ dịch thủy phân

Sau khi thực hiện phản ứng thủy phân saponin, chúng tôi tiến hành chiết xuất sapogenin toàn phần bằng dung môi methylen cloric Sau đó, cho cô quay chân không đến cắn và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trước khi cho qua cột silicagel để tách phân đoạn acid oleanolic Dịch chiết methylen cloric luôn cho 3 vệt tách khá xa nhau trên sắc kí

đồ, trong đó có một vệt tương đương giá trị Rf với chuẩn, một cho giá trị lớn hơn và một vệt cho giá trị nhỏ hơn Chứng tỏ rằng, trong cắn methylen cloric thu được có sự tồn tại của ba hoạt chất, có độ phân cực khác nhau, trong đó có acid oleanolic, là chất có độ phân cực trung bình

so với hai chất còn lại Nhiệm vụ chúng tôi đặt ra là phải tách được riêng

biệt ba chất này, thu gom acid oleanolic

3.1.4 Kết quả phân tách cắn acid oleanolic thô từ sapogenin toàn phần

Tách phân đoạn chứa acid oleanolic bằng sắc kí cột silicagel 60

GF, kích thước 63-200 µm Thể tích cho một phân đoạn là 10 ml, các phân đoạn được hứng và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng

Sau khi qua cột, chúng tôi thu được 9 phân đoạn như sau:

Hình 9 Kết quả kiểm tra các phân đoạn thu được

S: chuẩn oleanolic

1 2 3 S 4 5 6 S 7 8 9

Dựa vào những phân đoạn cho vệt sắc kí tương đương Rf với vệt của chuẩn, từ đó chúng tôi thu gom tất cả những phân đoạn chứa acid oleanolic Trong thí nghiệm minh họa này, acid oleanolic chỉ có trong phân đoạn 5 và 6, nên chúng tôi thu gom phân đoạn 5 và 6, cho bay hơi Hợp chất thu được chúng tôi đặt tên là NL1

=> Tóm tắt quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ ngưu tất:

 Dung môi chiết cao ngưu tất: ethanol 70 %

 Acid sử dụng thủy phân saponin thành sapogenin: acid hydrocloric 15%

Điều kiện thủy phân: nhiệt độ 100 o

C, trong thời gian 2 giờ

Hình 10 Quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất

Hiệu suất chiết:

Bảng 2 Hiệu suất chiết acid oleanolic từ cao và dược liệu rễ cây ngưu tất

Rễ ngưu tất Cao cồn Cao CH2Cl2 Acid oleanolic Khối lượng

25 g bột silicagel, 250 ml chloroform, 50 ml methanol

3.2 Kết quả tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu

thu đƣợc song song với chuẩn đối chiếu

3.2.1 Kết quả tinh chế và định danh acid oleanolic

Kết tinh cắn acid oleanolic thu được sau khi chạy qua sắc kí cột

Sử dụng một lượng methanol vừa đủ, hòa tan cắn acid oleanolic, thêm một ít bột than hoạt tính và tiến hành lọc qua giấy lọc, để bay hơi

tự nhiên, thu được hợp chất NL1 có dạng hình kim, màu trắng Thực hiện nhiều lần để có độ sạch cao

T1 S T2

Hình 11 Kết quả chấm sắc kí của NL1 với chuẩn acid oleanolic

Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NL1

Hợp chất NL1 kết tinh lại từ các phân đoạn 5 và 6 , có đặc điểm sau:

T1: Thử NL1 S: Chuẩn acid oleanolic T2: Thử NL1

 Dạng bột trắng

 Điểm nóng chảy: 310.8 oC (phụ lục 01)

 Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất ở Rf = 0.6 trong hệ dung môi (cloroform: methanol) (40:1), phun thuốc thử hiện hình dung dịch acid phosphormolybdic 5 % trong ethanol 96 %, nung nóng bản cho vết màu đen (hình 11)

Trắng: dung môi hòa tan, methanol

Tiến hành quét phổ cho mẫu trắng, chuẩn và thử ở dãy bước sóng từ 190 –

Chuẩn: sử dụng một lượng nhỏ, tiến hành dập viên KBr, đo phổ IR

Nguyên liệu: sử dụng một lượng nhỏ tương ứng với chuẩn, dập viên KBr

và đo phổ IR

Kết quả: phổ IR của chuẩn và thử tương đương nhau

Phổ hấp thu IR của acid oleanolic đặc trưng bởi nhóm chức sau:

chuyển hóa học được trình bày trong bảng 3

Cân khoảng 20 mg nguyên liệu đóng gói cẩn thận gửi chạy phổ NMR Nơi gửi mẫu: phòng MNR_ Viện Hóa học/ Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, cầu Giấy Hà Nội

Mẫu: acid oleanolic

Dung môi: DMSO-d6

Máy : 500 MHz

Biện luận cấu trúc

Hợp chất NL1 có dạng tinh thể màu trắng, tan trong dung môi CHCl3, methanol

2 3 4 5 10 1

6 7 8

13 12 11

15 16 17

21 20 19

30 29

25

Hình 12 Cấu trúc của hợp chất NL1

Phổ proton (phụ lục 05) của hợp chất NL1 cho thấy ở vùng trường thấp xuất hiện các tín hiệu của 1 proton olefin [δ 5.15(1H;