phân lập acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất (achyranthes bidentata blume) và tinh chế làm chất chuẩn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HỒ THỊ THU HƯƠNG PHÂN LẬP ACID OLEANOLIC TỪ RỄ CÂY NGƯU TẤT (Achyranthes Bidentata Blume) VÀ TINH CHẾ LÀM CHẤT CHUẨN Chuyên ngành: Hóa Phân Tích Mã số chuyên ngành: 604429 LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ XUÂN MAI Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Vô cùng bố mẹ và các anh chị trong gia đình, những người đã nuôi dạy cho tôi thành người hôm nay. Chân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Mai, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu; chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Hóa phân tích nói riêng và khoa hóa nói chung, đã truyền đạt nền tảng kiến thức sâu rộng trong những năm được học dưới mái trường Đại học Khoa học tự nhiên này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Ths. Dược sĩ Phạm Thị Hồng Nhung, trưởng phòng khoa Kiểm nghiệm Mỹ Phẩm, cảm ơn chị đã giúp tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Và tôi xin chân thành cảm ơn các chị, các bạn đồng nghiệp viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh, và các bạn trong khoa Hóa đã nhiệt tình ủng hộ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người. Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt MS: Mass Spectroscopy IR: Infrared Spectroscopy NMR: Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy DEPT: Distortionless Enhancement By Polarization Transfer HMBC: Heteronuclear Multiple – Bond Correlation Spectroscopy HSQC: Heteronuclear Single – Quantum Correlation Spectroscopy COSY: Correlation Spectroscopy TLC: Thin Layer Chromatography HPLC: High Performance of Liquid Chromatography UFLC: Ultra Fast of Liquid Chromatography DMSO: Dimethyl Sulfoxid m: multies s: single d: douplet dd: douplet-douplet HCl: acid hydrochloric H 2 SO 4 : acid sulfuric C: chuẩn đối chiếu NL: chuẩn nguyên liệu thu được T: mẫu thử DĐVN: dược điển Việt Nam. Danh mục các bảng Bảng 1. Hàm lượng Oleanolic acid (OA) trong từng bộ phận khác nhau của cây ngưu tất thay đổi theo thời gian Bảng 2. Hiệu suất chiết acid oleanolic từ cao và dược liệu rễ cây ngưu tất Bảng 3. Dữ liệu phổ của hợp chất 5 và acid oleanolic trong dung môi DMSO- d 6 Bảng 4. Kết quả định lượng acid oleanolic nguyên liệu bằng phương pháp HPLC Bảng 5. Kết quả định lượng acid oleanolic nguyên liệu bằng phương pháp đo quang UV-VIS Bảng 6. Kết quả thẩm định tính tương thích hệ thống của phương pháp với 6 lần tiếm chuẩn đối chiếu và 6 lần tiêm chuẩn nguyên liệu. Bảng 7. Kết quả độ lặp của phương pháp với 6 mẫu thử tính toán dựa trên phương trình tuyến tính của dung dịch chuẩn đối chiếu Bảng 8. Kết quả độ lặp của phương pháp với 6 mẫu thử tính toán dựa trên phương trình tuyến tính của dung dịch chuẩn nguyên liệu Bảng 9. Kết quả độ đúng của phương pháp với dung dịch thêm vào là chuẩn đối chiếu Bảng 10. Kết quả độ đúng của phương pháp với dung dịch thêm vào là chuẩn nguyên liệu Bảng 11. Kết quả xác định hàm lượng acid oleanolic trong thuốc thử dựa trên phương trình hồi quy của chất đối chiếu. Bảng 12. Kết quả xác định hàm lượng acid oleanolic trong thuốc thử dựa trên phương trình hồi quy của chất chuẩn nguyên liệu. MỤC LỤC Trang Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị Mở đầu 1 Chƣơng 1- TỔNG QUAN 1.1 Mô tả thực vật về cây ngƣu tất 3 1.1.1 Phân loại và mô tả hình thái 3 1.1.2 Nơi sống và thu hái 4 1.1.3 Bộ phận dùng 4 1.1.4 Thành phần hóa học 5 1.1.5 Công dụng và tính vị 6 1.2 Sơ lƣợc về saponin 9 1.3 Phản ứng thủy phân saponin 11 1.4 Acid oleanolic 12 1.5 Tình hình nghiên cứu 13 Chƣơng 2-NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 17 2.2 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị 19 2.3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Chuẩn bị mẫu dƣợc liệu 20 2.3.2 Tối ƣu quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất …21 2.3.3 Tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu đƣợc song song với chuẩn đối chiếu 23 2.3.4 Xây dựng qui trình phân tích và áp dụng xác định acid oleanolic trong mẫu thử bằng chuẩn oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn đối chiếu bằng phƣơng pháp UV-VIS và HPLC 24 Chƣơng 3-KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết quả chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất 26 3.2 Kết quả tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu đƣợc song song với chuẩn đối chiếu 30 3.3 Xây dựng phƣơng pháp và thẩm định qui trình xác định acid oleanolic bằng phƣơng pháp HPLC/PDA 39 3.4 Định lƣợng mẫu thử bằng phƣơng pháp HPLC, với chuẩn nguyên liệu song song với chuẩn đối chiếu 45 Chƣơng 4-KẾT LUẬN 50 Tài liệu tham khảo 51 Phụ lục Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1. Cây và bộ phận rễ của ngưu tất Hình 2. Hình vi phẫu rễ cây ngưu tất Hình 3. Sơ đồ chung về quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất Hình 4. Kết quả khảo sát dung môi chiết Hình 5. Kết quả khảo sát acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần Hình 6. Kết quả khảo sát nồng độ acid Hình 7. Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân Hình 8: Kết quả khảo sát thời gian thủy phân Hình 9. Kết quả kiểm tra các phân đoạn thu được Hình 10. Quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất Hình 11. Kết quả chấm sắc kí của NL1 với chuẩn acid oleanolic. Hình 12. Cấu trúc của hợp chất NL1 Hình 13. Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (đường kẻ đậm) của hợp chất NL1 1 MỞ ĐẦU Việc sử dụng cây cỏ làm thuốc đã có từ rất lâu đời…, cây cỏ vừa gần gũi, thân thiện và dễ sử dụng, nên rất được người dân ưa dùng. Có những loại thảo dược được xem là những cống phẩm quý hiếm như linh chi, nhân sâm ngàn năm… Có rất nhiều vị danh y nổi tiếng như Hoa Đà ở Trung Hoa, Hải Thượng Lãn Ông ở Việt Nam thời phong kiến,… , họ đã nghiên cứu, và tìm ra những phương pháp chữa bệnh bằng những loài cây cỏ dại sống xung quanh chúng ta. Cho đến ngày nay, tiếp nối những gì người xưa để lại, khoa học nghiên cứu những thảo dược ngày càng mở rộng, kho thảo dược ngày càng đa dạng và phong phú. Khoa học hiện đại không chỉ quan tâm các tính năng dược lí, mà còn nghiên cứu chuyên sâu các thành phần hợp chất có trong từng bộ phận của cây, phân lập các hợp chất, mang lại nhiều giá trị to lớn. Nói đến ngưu tất, ít người biết cây dược liệu này có tác dụng hạ cholesterol máu và hạ huyết áp, một trong những căn bệnh phổ biến, xuất hiện ở nhiều lứa tuổi, và là căn bệnh khó chữa hiện nay. Loài cây này được du nhập từ Trung Quốc, và hiện nay đã trồng thành công ở nước ta. [1,3] Acid oleanolic là sản phẩm thủy phân từ saponin có trong phần lớn thực vật như cây cỏ xước, hạt gấc, hoa tỳ bà,… và trong cây ngưu tất, đặc biệt có nhiều trong phần rễ của cây ngưu tất. Nó có tác dụng bảo vệ tế bào gan, chống oxi hóa, chống tác nhân gây khối u. [4,5] Trên thị trường đã đưa ra nhiều chế phẩm mà thành phần có saponin của rễ cây ngưu tất, trong đó có chế phẩm dùng để làm thuốc hạ cholesterol máu cao. Điều đó thật đáng mừng, tuy nhiên, thuốc chữa bệnh phải ở hàm lượng cho phép, nếu hàm lượng quá cao sẽ ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe của người sử dụng. 2 Do đó, để kiểm tra cũng như giám sát chất lượng của các thành phẩm này, chúng tôi đã nghiên cứu chiết xuất acid oleanolic trong rễ cây ngưu tất dùng làm chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm. Vì vậy, cần tìm ra phương pháp chiết đơn giản để có thể phân lập được acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất, và sử dụng như chất chuẩn để đánh giá những sản phẩm bán thành phẩm. Nên tên đề tài của chúng tôi là “Phân lập acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume) và tinh chế làm chất chuẩn”. Với hai mục tiêu chính: 1. Phân lập chất acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất, và tinh chế, đánh giá chuẩn, để: - Phục vụ nguồn chất chuẩn trong phân tích kiểm nghiệm. - Bổ sung nguồn thư viện tài liệu về ngưu tất. 2. Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích xác định acid oleanolic bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao. 3 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1.1 Mô tả thực vật về cây ngƣu tất [1,2,3] 1.1.1 Phân loại và mô tả hình thái Ngưu tất - Achyranthes bidentata Blume, thuộc họ Rau dền - Amaranthaceae. Mô tả: Cây thảo, sống nhiều năm, cao 60 – 80 cm hoặc hơn. Rễ hình trụ dài, có nhiều rễ phụ to. Thân mảnh, có cạnh, phình lên ở những đốt, màu lục hoặc nâu tía. Cành thường mọc hướng lên gần như thẳng đứng. Lá mọc đối, hình bầu dục hoặc hình mác, dài 5-10 cm, rộng 1-4 cm, gốc thuôn hẹp, đầu rất nhọn, hai mặt nhẵn, mép nguyên đôi khi uốn lượn, gân lá mặt trên thường có màu nâu tía. Cuống lá dài 1-1,5 cm. Cụm hoa mọc ở nhọn thân và kẽ lá đầu cành thành bông, dài 2-5 cm. Hoa thường gập xuống, sát vào cuống của cụm hoa. Lá bắc dài 3mm. Lá dài 5 mm, gần bằng nhau. Nhị, chỉ nhị dính với nhau vào dính cả với nhị lép. Nhị lép có răng rất nhỏ, bao phấn hình mắt chim. Bầu hình trứng. Quả hình bầu dục, có một hạt. Cây cho hoa vào khoảng từ tháng 5-9 và cho quả tháng 10-11. Hình 1. Cây và bộ phận rễ của ngưu tất. 1.1.2 Nơi sống và thu hái Cây ngưu tất hiện nay được trồng thành công ở nước ta, dược liệu đủ dùng trong cả nước và xuất khẩu. [...]... thành từng phân đoạn, các phân đoạn thu được kiểm tra sự hiện diện của acid oleanolic bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Sau đó thu gom các phân đoạn có chứa acid oleanolic, cho bay hơi dung môi Quy trình chiết: 22 Hình 3 Sơ đồ chung về quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất 2.3.3 Tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu đƣợc song song với chuẩn đối chiếu Tinh chế acid oleanolic. .. cứu _acid oleanolic Dược liệu: bộ phận sử dụng là rễ cây ngưu tất, vì so với các bộ phận khác thì rễ ngưu tất có chứa 0.096% hàm lượng acid oleanolic, nhiều hơn so với hàm lượng acid oleanolic trong thân và lá [8]; và quá trình chiết tách acid oleanolic từ bộ phận rễ khá thuận lợi và rất sạch, còn với bộ phận thân và lá chúng tôi phải thêm các giai đoạn loại màu xanh sinh học tự nhiên Rễ ngưu tất có các... acid oleanolic Định lượng hàm lượng acid oleanolic nguyên liệu thu được bằng phương pháp UV và HPLC, để đánh giá chất lượng của nguyên liệu so với chuẩn đối chiếu được mua từ các hãng hóa chất có tiếng như hãng Sigma Đánh giá chất chuẩn cho acid oleanolic nguyên liệu Acid oleanolic nguyên liệu sau khi qua phân tích kiểm tra là đúng và tinh khiết, chúng tôi đánh giá chất chuẩn nguyên liệu acid oleanolic. .. mỏng, và dùng những phương pháp kết tinh, kết tinh lại để có được những tinh thể tinh khiết; sau đó 23 gom lại và đem phân tích cấu trúc, độ tinh khiết với mục đích định danh nguyên liệu acid oleanolic phân lập được từ cây ngưu tất Xác định cấu trúc của những tinh thể thu được bằng các phương pháp : UV, IR, MNR, để từ những kết quả khảo sát chúng tôi tiến hành xác thực những tinh thể thu được đúng là acid. .. cứu cây trồng và chế biến thuốc Hà Nội và một số nơi khác Cây trồng được cả ở trên núi cao lẫn đồng bằng Thu hái vào mùa đông xuân, phơi tái rồi ủ đến khi nhăn da (6-7 ngày), xông diêm sinh, sấy khô Dùng sống hoặc sao tẩm rượu Trong các bộ phận của cây ngưu tất, thì rễ ngưu tất có tác dụng y học lớn, và ngày nay, các sản phẩm bắt nguồn từ rễ ngưu tất khá nhiều Do đó, những nghiên cứu về rễ ngưu tất. .. đậm, và vệt khá rõ ràng Cho nên chúng tôi chọn ethanol 70 % làm dung môi chiết xuất cao ngưu tất 3.1.2 Kết quả thủy phân saponin trong cao ngƣu tất cho ra sapogenin Khảo sát môi trường acid dùng để thủy phân: acid hydrochlorid và acid sulfuric S: chuẩn oleanolic HCl S H2SO4 Hình 5 Kết quả khảo sát acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần Trong quá trình tách chiết acid oleanolic từ dịch thủy phân, ... tính alanin aminotrsferase và sorbitol dehyrogenase [10] 12 + Tác dụng chống HIV invitro trên tế bào đơn nhân ở người đã được gây nhiễm [13] + Tác dụng ức chế α- glucosidase của acid oleanolic và dẫn chất tổng hợp của acid oleanolic[ 16] Một số dược liệu có thành phần là acid oleanolic: trái bồ kết, cây ngưu tất, cây ngưu tất nam ( cỏ xước), hạt gấc, Tình hình nghiên cứu về acid oleanolic 1.5 - Qui trình... đa dạng và phong phú Đa số là dạng nam dược được bào chế từ cao ngưu tất Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích acid oleanolic trong viên cao ngưu tất để tiến hành xác định hàm lượng acid oleanolic có trong những mẫu nam dược này, song song với chuẩn đối chiếu mua về Nội dung bao gồm: 24 - Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic - Thẩm định phương pháp phân tích từ mẫu thử... oleanolic - Thẩm định phương pháp phân tích từ mẫu thử bằng chuẩn acid oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn mua về - Áp dụng quy trình xây dựng được để xác định mẫu thử 25 Chƣơng 3 – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết quả chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất Tối ƣu các thông số trong quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất Điều kiện sắc ký bản mỏng:  Dung môi chạy sắc ký:... với rễ cỏ xước - Gây thu teo tuyến ức chuột cống đực non Tác dụng gây thu teo tuyến ức là một trong những đặc tính của thuốc ức chế miễn dịch Rễ ngưu tất có tác dụng mạnh hơn khoảng 8 lần so với rễ cỏ xước Có mối tương quan song song giữa tác dụng kháng viêm và tác dụng gây thu teo tuyến ức của rễ Ngưu tất - Rễ Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu ở thỏ đã gây tăng cholesterol từ ngoài vào và . từ rễ cây ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume) và tinh chế làm chất chuẩn . Với hai mục tiêu chính: 1. Phân lập chất acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất, và tinh chế, đánh giá chuẩn, để: -. thể phân lập được acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất, và sử dụng như chất chuẩn để đánh giá những sản phẩm bán thành phẩm. Nên tên đề tài của chúng tôi là Phân lập acid oleanolic từ rễ cây ngưu. HỒ THỊ THU HƯƠNG PHÂN LẬP ACID OLEANOLIC TỪ RỄ CÂY NGƯU TẤT (Achyranthes Bidentata Blume) VÀ TINH CHẾ LÀM CHẤT CHUẨN Chuyên ngành: Hóa Phân Tích Mã số chuyên ngành: